本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一種腸炎沙門菌基因敲除減毒突變株及其制備與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

沙門菌是人獸共患病原菌，能引起食物中毒、腸胃炎、傷寒和敗血癥等。沙門菌具有多種不同的血清型，可分為宿主適應(yīng)血清型和非宿主適應(yīng)血清型。腸炎沙門菌作為沙門菌一種常見血清型，在禽類中有較高的分離率，極易污染禽肉類、魚類奶制品和蛋制品等，能引起人類腸胃炎等疾病。

當(dāng)前，對(duì)沙門菌的防治主要是使用抗生素，但是隨著抗生素的大量使用，沙門菌的耐藥性也逐漸增強(qiáng)。疫苗接種是目前控制人和動(dòng)物沙門菌病的有效措施之一，其中減毒活疫苗因能產(chǎn)生較高的免疫保護(hù)而成為研究熱點(diǎn)。近年來，沙門菌已有多個(gè)毒力相關(guān)基因被鑒應(yīng)用于構(gòu)建毒力基因缺失的減毒菌株，這些減毒株對(duì)人和動(dòng)物的致病力顯著降低，但其仍保持較好的免疫原性。

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展使得我們可以通過基因敲除技術(shù)構(gòu)建遺傳背景清除的減毒疫苗株。這種方式往往需要對(duì)影響細(xì)菌生長(zhǎng)的某些重要基因或者與細(xì)菌致病性有關(guān)的毒力基因進(jìn)行敲除操作。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于以上現(xiàn)有技術(shù)的情況，本發(fā)明的目的在于提供一種腸炎沙門菌基因敲除減毒突變株及其制備與應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的以及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面，提供一種腸炎沙門菌sptP基因敲除減毒株，為sptP基因不表達(dá)的腸炎沙門菌。

優(yōu)選的，所述腸炎沙門菌sptP基因敲除減毒株，為sptP基因被敲除的腸炎沙門菌。

野生型腸炎沙門菌(Salmonella enteritidis)為現(xiàn)有技術(shù)，具體可使用的腸炎沙門菌包括但不限于：野生型腸炎沙門菌C50336。所述野生型腸炎沙門菌C50336來源：中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)CMCC(B)50336。

sptP基因?yàn)楝F(xiàn)有技術(shù)。野生型腸炎沙門菌C50336的sptP基因的閱讀框序列如SEQ ID NO:1所示。具體為：

1 atgctaaagtatgaggagagaaaattgaataatttaacgttgtcttcgttttcaaaagtt

61 ggtgtgtcgaatgatgcccgactttatattgctaaggaaaatactgataaggcatatgtt

121 gcgcctgaaaaattttcgtcaaaagtattaacctggcttggaaaaatgccgttatttaaa

181 aacactgaagtggtgcaaaaacatacggaaaatatcagagtacaggaccaaaagatttta

241 cagacatttctccatgcactaacggaaaaatatggggaaacagcggttaatgacgcactg

301 ttaatgtcccgtataaatatgaacaaaccccttacccaacgtttagcagtgcagatcacg

361 gagtgtgtaaaagctgctgacgaagggtttataaaccttattaagagcaaggataatgtt

421 ggtgtcaggaatgccgctttagtcataaaaggcggcgatacaaaagtggcagaaaaaaat

481 aacgatgttggagcagaaagtaagcaacctttactcgatatcgcgctaaagggacttaaa

541 agaacattaccgcaactggaacaaatggatggaaatagcctgcgagaaaacttccaggag

601 atggcttcaggtaacggcccgctgcgttcattaatgacgaatttacagaatttaaataaa

661 attccagaggctaaacaacttaatgattatgttacaacgttaacaaatattcaggtcggt

721 gtagcccggttctcacaatggggaacctgtggaggagaggttgagaggtgggttgataaa

781 gcctctactcatgaattaacccaggctgtaaaaaaaattcacgttattgctaaagaactg

841 aaaaatgttacagctgaacttgagaaaatagaagccggcgcgccaatgccacagacgatg

901 agcggaccgacactgggcctggcacggtttgcggtcagcagcattccaattaatcagcaa

961 acccaggtgaaactgagcgatggaatgcctgtgccagtgaatacgttaacttttgacggt

1021 aagcctgtggcattagccggttcgtacccaaaaaatacgccggatgcgctggcagcgcat

1081 atgaaaatgcttcttgaaaaagaatgctcatgcctggtggtgttaacgtcggaagatcag

1141 atgcaggcaaaacaattaccaccctatttcagagggagctacacctttggcgaggtgcat

1201 accaacagccaaaaagtgagctcagccagtcagggagaagcgatagaccaatacaatatg

1261 caactgtcctgcggggaaaagcggtatacaatcccggtattgcatgtgaaaaattggcca

1321 gatcaccagccgttaccgtctacggatcagttagaatacctggcggatagggtgaaaaat

1381 agtaaccaaaatggcgcgccggggcgtagttcatcagataagcatttaccgatgattcat

1441 tgtctgggcggagtggggagaaccggaacgatggcggcggcccttgtacttaaggataat

1501 cctcatagtaatctggagcaggtacgtgcagatttccggaattcacggaacaatagaatg

1561 ctggaagacgcctcacagtttgtacaactaaaagcaatgcaagcccagttgcttatgacg

1621 acggcacgctga。

只要將腸炎沙門菌中的sptP基因進(jìn)行敲除，使得sptP基因不表達(dá)，即可獲得腸炎沙門菌sptP基因敲除減毒株。

優(yōu)選地，本發(fā)明一實(shí)施例中，被敲除的sptP基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

進(jìn)一步地，所述減毒株還可經(jīng)過其他基因改造。

所述的其他基因改造是指除sptP基因敲除以外的基因改造。所述其他基因改造可以是單個(gè)目標(biāo)基因的改造或者為多個(gè)感興趣目標(biāo)基因的改造。感興趣目標(biāo)基因并不特指，可以根據(jù)研究需要設(shè)定并改造。例如，可以是一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)以上目標(biāo)基因的改造。理論上可以不斷對(duì)其進(jìn)行基因改造，對(duì)于目標(biāo)基因的改造數(shù)量可以按照需要操作，沒有特別限制。

基因改造具體是指通過生物或化學(xué)或物理的手段使基因相比改造前在結(jié)構(gòu)上發(fā)生變化。這種變化主要是指堿基對(duì)組成的變化，包括但不限于一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)的替換、增添、缺失引起的改變。所述基因改造包括但不限于目標(biāo)基因的敲入、目標(biāo)基因的敲除等。目標(biāo)基因的敲入、目標(biāo)基因的敲除可以采用基因打靶、同源重組等技術(shù)來完成。

優(yōu)選地，本發(fā)明一實(shí)施例中，如SEQ ID NO.1所示的sptP基因被敲除并替換為如SEQ ID NO:3所示的序列。如SEQ ID NO:3所示的序列具體為：

GTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTAAGGAGGATATTCATATGGACCATGGCTAATTCCCAT。

本發(fā)明的第二方面，提供了前述腸炎沙門菌sptP基因敲除減毒株的構(gòu)建方法，包括步驟：將腸炎沙門菌中的sptP基因敲除。

可以采用現(xiàn)有的基因編輯方法敲除所述sptP基因。優(yōu)選地，可采用同源重組的方法敲除sptP基因。在優(yōu)選的實(shí)施例中，采用Red同源重組的方法敲除sptP基因。還可采用其他方法實(shí)現(xiàn)基因敲除，并不限于實(shí)施例所列舉的方式。

基于sptP基因的敲除，sptP基因的完整序列從染色體DNA中去除。

本發(fā)明的第三方面，提供了前述腸炎沙門菌sptP基因敲除減毒株在制備腸炎沙門氏菌病的活疫苗上的用途。

本發(fā)明的第四方面，提供了一種腸炎沙門氏菌病的活疫苗，含有前述腸炎沙門菌sptP基因敲除減毒株。

進(jìn)一步的，所述活疫苗中還含有佐劑。

本發(fā)明的第五方面，提供了sptP基因作為靶基因在篩選腸炎沙門氏菌感染治療藥物中的用途。

本發(fā)明所述腸炎沙門氏菌感染治療藥物為以sptP基因?yàn)橹委煱谢?，使sptP基因敲除、不表達(dá)的藥物或者以sptP基因表達(dá)的蛋白為拮抗對(duì)象的藥物；或者以sptP基因和其他基因共同作為靶基因加以沉默的藥物。以sptP基因?yàn)榘悬c(diǎn)，篩選使這個(gè)基因不表達(dá)的藥物，用于使腸炎沙門菌毒性減弱，以治療腸炎沙門菌感染。例如，該腸炎沙門菌感染治療藥物可以通過RNA干擾或者基因重組的方法使sptP基因敲除或不表達(dá)；或者通過制備sptP蛋白拮抗劑，使sptP基因表達(dá)的蛋白不發(fā)揮作用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明成功研制了一種腸炎沙門菌sptP基因敲除減毒株，本發(fā)明通過動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，所述突變株毒力顯著降低，對(duì)強(qiáng)毒力腸炎沙門菌提供良好的保護(hù)作用，可有效清除強(qiáng)毒力菌株感染。

附圖說明

圖1：API20E生化鑒定板結(jié)果，

1：無菌水空白對(duì)照；2：腸炎沙門菌野生株C50336；3：C50336ΔsptP基因敲除株。

圖2.是質(zhì)粒pKD3的圖譜。

圖3是sptP同源臂+氯霉素抗性基因打靶片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果，

M：DL2000marker；1：sptP同源臂+氯霉素抗性基因打靶片段。

圖4是質(zhì)粒pKD46的圖譜。

圖5是突變株的PCR鑒定，

M：250bp market；1：野生株C50336的PCR擴(kuò)增片段；2：無Cat突變株C50336ΔsptP的PCR擴(kuò)增片段；3：有Cat突變株C50336Δspt::cat的PCR擴(kuò)增片段。

圖6細(xì)菌在肝臟的持續(xù)帶菌情況。

圖7細(xì)菌在脾臟中的持續(xù)帶菌情況。

圖8細(xì)菌在腸系膜淋巴結(jié)中的持續(xù)帶菌情況。

圖9為血清中特異性IgG抗體水平結(jié)果。

圖10為血清中特異性IgG抗體亞型檢測(cè)結(jié)果。

圖11為脾臟淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果。

具體實(shí)施方式

在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或者按照各制造商所建議的條件。

當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說明，具體可參見Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

實(shí)施例1腸炎沙門菌sptP基因敲除減毒株C50336ΔsptP的構(gòu)建

1.野生型腸炎沙門菌C50336的鑒定

野生型腸炎沙門菌C50336來源：中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)CMCC(B)50336。

1.1染色鏡檢革蘭氏法染色后，普通光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)、測(cè)量細(xì)菌大小。革蘭氏染色結(jié)果顯示鏡檢可觀察到散在排列的紅色短小直桿菌，大小約為1μm×4μm。

1.2生化試驗(yàn)挑取純培養(yǎng)的單菌落接種生化鑒定板(API20E生化鑒定板)，37℃培24h后觀察結(jié)果(見表4及圖1)，對(duì)照API20E生化鑒定板說明書確定細(xì)胞種屬的正確。

2.sptP基因敲除減毒株的構(gòu)建方法

2.1打靶片段的制備

2.1.1帶同源臂的Cm^R抗性基因擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)

用于Red同源重組的引物由兩部分組成，5'端大寫的39nt的序列與靶基因兩側(cè)序列同源，3'端小寫的20nt的序列與pKD3(從美國(guó)Yale University,The E.coli genetic resource center購買)質(zhì)粒上Cm^R抗性基因兩側(cè)序列同源，引物序列見表1。

表1擴(kuò)增打靶片段的引物序列

2.1.2打靶片段的擴(kuò)增與純化

以質(zhì)粒pKD3(圖2)作為模板，用表1中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，50μl PCR擴(kuò)增體系如下表：

表2sptP打靶片段基因PCR擴(kuò)增體系

PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min,共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min，4℃保存。

反應(yīng)結(jié)束后以1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物，回收操作按Fragment purification Kit說明書進(jìn)行，測(cè)定DNA濃度。

以質(zhì)粒pKD3作為模板，用帶有39nt同源臂的長(zhǎng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小為1111bp的打靶片段(圖3)。所述打靶片段如SEQ ID NO:2所示，具體為：

tgaatcagcaggaagtgctcaaaaacatactgcaggaatGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCATTTAAATGGCGCGCCTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTATTCATTAAGCATCTGCCGACATGGAAGCCATCACAAACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGTAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCGACAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCGATCAACGTCTCATTTTCGCCAAAAGTTGGCCCAGGGCTTCCCGGTATCAACAGGGACACCAGGATTTATTTATTCTGCGAAGTGATCTTCCGTCACAGGTAGGCGCGCCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTAAGGAGGATATTCATATGGACCATGGCTAATTCCCATtaaaaacatagcttacttttagaactatcagaaagtaag。

3.電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備

將攜帶Red重組酶系統(tǒng)的質(zhì)粒pKD46(從美國(guó)Yale University,The E.coli genetic resource center購買)(圖4)轉(zhuǎn)化至氯化鈣制備的野生株C50336感受態(tài)中構(gòu)建菌株C50336-pKD46，于氨芐青霉素平板上30℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落接種含Amp的LB培養(yǎng)基，30℃振蕩培養(yǎng)過夜。取200μL培養(yǎng)物接種到50mL含Amp的LB培養(yǎng)基中，并加入終濃度為30mM的L-阿拉伯糖，30℃振蕩培養(yǎng)箱至OD600≈0.4，冰浴10min，4℃、5000rpm離心10min收集細(xì)菌沉淀，用預(yù)冷的10％甘油洗三遍，用50μL預(yù)冷的10％甘油重懸，即為感受態(tài)細(xì)胞。

4.同源臂打靶片段的電轉(zhuǎn)化

將100ng的打靶片段(PCR產(chǎn)物的體積不能超過感受態(tài)細(xì)胞的10％)與50μL感受態(tài)細(xì)胞混合物加入到直徑為1mm的電擊杯中，冰浴2min，在電壓1.8KV，脈沖25μF，電阻200Ω的條件下進(jìn)行電擊。電擊完成后，加入預(yù)熱的1mL SOC培養(yǎng)液于電擊杯中，移液器輕輕吹勻后轉(zhuǎn)移至1.5mL EP管中，180rpm，30℃振蕩培養(yǎng)2h。取500μL菌液涂布于含氯霉素的LB抗性平板，37℃倒置培養(yǎng)過夜，篩選Cm^R抗性轉(zhuǎn)化子。接種含氯霉素抗性的重組子，42℃培養(yǎng)過夜后，菌液分別接種于含有氯霉素和氨芐青霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)。選擇具有氯霉素抗性但對(duì)氨芐青霉素敏感的單菌落，獲得只有氯霉素抗性的突變株，并以sptP基因外側(cè)引物e-sptP-F/R引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，如圖5，驗(yàn)證正確的菌株命名為：C50336ΔsptP::cat。

表3突變株的驗(yàn)證引物

5.抗性基因的消除

將攜帶FLP重組酶的質(zhì)粒pCP20(從美國(guó)Yale University,The E.coli genetic resource center購買)電轉(zhuǎn)至C50336ΔsptP::cat突變株中，電轉(zhuǎn)化方法同上。電轉(zhuǎn)化后取500μL的菌液涂布于同時(shí)含有Amp和Cm的LB平板上，30℃培養(yǎng)過夜后，挑取單菌落于LB平板上，42℃培養(yǎng)過夜。以e-sptP-F/R引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證輔助質(zhì)粒pCP20和Cat抗性基因的消除情況，如圖5，從而獲得無抗性的基因突變株，經(jīng)測(cè)序正確的菌株命名為：C50336ΔsptP。

6.缺失株生理生化活性鑒定

挑取純培養(yǎng)的C50336ΔsptP單菌落接種生化鑒定板(API20E生化鑒定板)，并以C50336為對(duì)照，37℃培24h后觀察結(jié)果。結(jié)果見圖1及表4，與野生株相比，C50336ΔsptP生理生化活性未發(fā)生變化。

表4野生株C50336及基因缺失株的生化特性鑒定

注：“+”代表陽性，“—”表示陰性。

實(shí)施例2

1.安全性試驗(yàn)：

6-8周齡雌性BALB/c小鼠的半數(shù)致死率試驗(yàn)，將實(shí)施例1中制備的突變株與野生株C50336的毒力比較。

1.1.細(xì)菌的培養(yǎng)：細(xì)菌在LB平板上37℃培養(yǎng)24h，挑取單接種于液體LB中37℃靜置培養(yǎng)12小時(shí)，調(diào)節(jié)菌液濃度調(diào)節(jié)到1×10⁹CFU/ml。

1.2.小鼠半數(shù)致死量的測(cè)定

6-8周齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為8組，每組4只，將野生株C50336、突變株C50336ΔsptP分別以不同的劑量口服灌胃小鼠。在接種前一天給小鼠口服5％NaHCO₃，100μL/只，連續(xù)觀察并記錄2周內(nèi)小鼠的死亡情況，計(jì)算死亡率。試驗(yàn)結(jié)果表明，C50336ΔsptP突變株的毒力顯著降低(表5)。

表5野生株和突變株對(duì)小鼠的致死率

1.3.免疫小鼠體重變化的測(cè)定

比較腸炎沙門菌缺失株C50336ΔsptP口服免疫后對(duì)小鼠體重的影響，6-8周齡雌性BALB/c小鼠分別口服免疫1×10⁸CFUC50336ΔsptP。結(jié)果顯示免疫組與PBS對(duì)照組相比，免疫組小鼠體重?zé)o明顯變化(表6)。同時(shí)，每天觀察免疫組與對(duì)照組小鼠的臨床狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)免疫組與對(duì)照組一樣，能正常采食飲水，對(duì)外界刺激敏感，并未出現(xiàn)厭食、腹瀉、精神萎靡等癥狀。

表6免疫1×10⁸CFU C50336ΔsptP后小鼠體重變化

實(shí)施例3腸炎沙門菌C50336ΔsptP在小鼠體內(nèi)動(dòng)態(tài)變化分析

以10⁸CFU腸炎沙門菌C50336ΔsptP口服免疫小鼠，分別在免疫后3、5、7、10、14、17、21天剖殺實(shí)驗(yàn)小鼠，無菌操作取其肝臟、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)，細(xì)菌計(jì)數(shù)。肝臟細(xì)菌數(shù)變化見圖6，脾臟細(xì)菌數(shù)見圖7，細(xì)菌在腸系膜淋巴結(jié)中的變化規(guī)律見圖8。在接種后的第3天小鼠的肝臟、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)開始分離到細(xì)菌且數(shù)量達(dá)到最高。接種后21天，三只小鼠中的兩只臟器已基本不帶菌，而僅有一只體內(nèi)還載有少量細(xì)菌。對(duì)照組小鼠均未分離到沙門菌。

實(shí)施例4

1.腸炎沙門菌C50336ΔsptP免疫后小鼠血清中特異性抗體水平及亞型的測(cè)定結(jié)果

以腸炎沙門菌可溶性抗原為包被抗原，檢測(cè)血清中IgG及其亞型的分泌水平。圖9顯示免疫后12天與26小鼠血清中IgG抗體水平與對(duì)照組相比均存在顯著高(p＜0.05)。通過IgG亞型的測(cè)定可知，缺失株可以誘導(dǎo)IgG1和IgG2a亞型抗體產(chǎn)生，其中高滴度的IgG1抗體暗示C50336ΔsptP能誘導(dǎo)傾向Th2型免疫應(yīng)答(圖10)。ELISA結(jié)果表明，C50336ΔsptP可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生。

2.腸炎沙門菌C50336ΔsptP免疫后小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的結(jié)果

制備小鼠脾臟單細(xì)胞懸液，分別以ConA(終濃度為10μg/mL)，SEAgP(終濃度為10μg/mL)刺激，陰性對(duì)照組只加入培養(yǎng)基。置于37℃含有5％CO₂條件下培養(yǎng)48h后進(jìn)行觀察或檢測(cè)。完成刺激后使用Roche cell proliferation ELISA,BrdU試劑盒，參照其說明書進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算刺激指數(shù)SI值。

在ConA與SEAgP刺激下，免疫后12天與26天小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞增殖效果顯著高于未免疫對(duì)照組(p＜0.05)(圖11)。這說明腸炎沙門菌C50336ΔsptP能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較好的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

實(shí)施例5腸炎沙門菌C50336ΔsptP對(duì)小鼠免疫保護(hù)測(cè)定

1×10⁸CFU C50336ΔsptP免疫后，將腸炎沙門菌野生株C50336以口服感染途徑對(duì)免疫組與對(duì)照組小鼠進(jìn)行攻毒，記錄16天內(nèi)小鼠死亡情況及臨床癥狀，以評(píng)價(jià)減毒株的免疫保護(hù)作用。表7顯示攻毒后16天，1×10⁸CFU免疫組小鼠的存活率達(dá)100％，且無不良癥狀，而對(duì)照組的存活率僅為25％，并且在攻毒后第5天開始出現(xiàn)厭食、炸毛、顫抖、精神萎靡等臨床表現(xiàn)癥狀，第6天便開始出現(xiàn)死亡情況。這說明C50336ΔsptP能為小鼠提供較好的免疫保護(hù)。

表7C50336ΔsptP對(duì)小鼠的免疫保護(hù)效力

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明任何形式上和實(shí)質(zhì)上的限制，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還將可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，當(dāng)可利用以上所揭示的技術(shù)內(nèi)容而做出的些許更動(dòng)、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實(shí)施例；同時(shí)，凡依據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)對(duì)上述實(shí)施例所作的任何等同變化的更動(dòng)、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 揚(yáng)州大學(xué)

<120> 腸炎沙門菌基因敲除減毒突變株及其制備與應(yīng)用

<130> 164313

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1632

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> sptP基因的閱讀框序列

<400> 1

atgctaaagt atgaggagag aaaattgaat aatttaacgt tgtcttcgtt ttcaaaagtt 60

ggtgtgtcga atgatgcccg actttatatt gctaaggaaa atactgataa ggcatatgtt 120

gcgcctgaaa aattttcgtc aaaagtatta acctggcttg gaaaaatgcc gttatttaaa 180

aacactgaag tggtgcaaaa acatacggaa aatatcagag tacaggacca aaagatttta 240

cagacatttc tccatgcact aacggaaaaa tatggggaaa cagcggttaa tgacgcactg 300

ttaatgtccc gtataaatat gaacaaaccc cttacccaac gtttagcagt gcagatcacg 360

gagtgtgtaa aagctgctga cgaagggttt ataaacctta ttaagagcaa ggataatgtt 420

ggtgtcagga atgccgcttt agtcataaaa ggcggcgata caaaagtggc agaaaaaaat 480

aacgatgttg gagcagaaag taagcaacct ttactcgata tcgcgctaaa gggacttaaa 540

agaacattac cgcaactgga acaaatggat ggaaatagcc tgcgagaaaa cttccaggag 600

atggcttcag gtaacggccc gctgcgttca ttaatgacga atttacagaa tttaaataaa 660

attccagagg ctaaacaact taatgattat gttacaacgt taacaaatat tcaggtcggt 720

gtagcccggt tctcacaatg gggaacctgt ggaggagagg ttgagaggtg ggttgataaa 780

gcctctactc atgaattaac ccaggctgta aaaaaaattc acgttattgc taaagaactg 840

aaaaatgtta cagctgaact tgagaaaata gaagccggcg cgccaatgcc acagacgatg 900

agcggaccga cactgggcct ggcacggttt gcggtcagca gcattccaat taatcagcaa 960

acccaggtga aactgagcga tggaatgcct gtgccagtga atacgttaac ttttgacggt 1020

aagcctgtgg cattagccgg ttcgtaccca aaaaatacgc cggatgcgct ggcagcgcat 1080

atgaaaatgc ttcttgaaaa agaatgctca tgcctggtgg tgttaacgtc ggaagatcag 1140

atgcaggcaa aacaattacc accctatttc agagggagct acacctttgg cgaggtgcat 1200

accaacagcc aaaaagtgag ctcagccagt cagggagaag cgatagacca atacaatatg 1260

caactgtcct gcggggaaaa gcggtataca atcccggtat tgcatgtgaa aaattggcca 1320

gatcaccagc cgttaccgtc tacggatcag ttagaatacc tggcggatag ggtgaaaaat 1380

agtaaccaaa atggcgcgcc ggggcgtagt tcatcagata agcatttacc gatgattcat 1440

tgtctgggcg gagtggggag aaccggaacg atggcggcgg cccttgtact taaggataat 1500

cctcatagta atctggagca ggtacgtgca gatttccgga attcacggaa caatagaatg 1560

ctggaagacg cctcacagtt tgtacaacta aaagcaatgc aagcccagtt gcttatgacg 1620

acggcacgct ga 1632

<210> 2

<211> 1111

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 打靶片段

<400> 2

tgaatcagca ggaagtgctc aaaaacatac tgcaggaatg tgtaggctgg agctgcttcg 60

aagttcctat actttctaga gaataggaac ttcggaatag gaacttcatt taaatggcgc 120

gccttacgcc ccgccctgcc actcatcgca gtactgttgt attcattaag catctgccga 180

catggaagcc atcacaaacg gcatgatgaa cctgaatcgc cagcggcatc agcaccttgt 240

cgccttgcgt ataatatttg cccatggtga aaacgggggc gaagaagttg tccatattgg 300

ccacgtttaa atcaaaactg gtgaaactca cccagggatt ggctgagacg aaaaacatat 360

tctcaataaa ccctttaggg aaataggcca ggttttcacc gtaacacgcc acatcttgcg 420

aatatatgtg tagaaactgc cggaaatcgt cgtggtattc actccagagc gatgaaaacg 480

tttcagtttg ctcatggaaa acggtgtaac aagggtgaac actatcccat atcaccagct 540

caccgtcttt cattgccata cgtaattccg gatgagcatt catcaggcgg gcaagaatgt 600

gaataaaggc cggataaaac ttgtgcttat ttttctttac ggtctttaaa aaggccgtaa 660

tatccagctg aacggtctgg ttataggtac attgagcaac tgactgaaat gcctcaaaat 720

gttctttacg atgccattgg gatatatcaa cggtggtata tccagtgatt tttttctcca 780

ttttagcttc cttagctcct gaaaatctcg acaactcaaa aaatacgccc ggtagtgatc 840

ttatttcatt atggtgaaag ttggaacctc ttacgtgccg atcaacgtct cattttcgcc 900

aaaagttggc ccagggcttc ccggtatcaa cagggacacc aggatttatt tattctgcga 960

agtgatcttc cgtcacaggt aggcgcgccg aagttcctat actttctaga gaataggaac 1020

ttcggaatag gaactaagga ggatattcat atggaccatg gctaattccc attaaaaaca 1080

tagcttactt ttagaactat cagaaagtaa g 1111

<210> 3

<211> 103

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 替換序列

<400> 3

gtgtaggctg gagctgcttc gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata 60

ggaactaagg aggatattca tatggaccat ggctaattcc cat 103

<210> 4

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> sptp-Cat-F

<400> 4

tgaatcagca ggaagtgctc aaaaacatac tgcaggaatg tgtaggctgg agctgcttc 59

<210> 5

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> sptP-Cat-R

<400> 5

cttactttca gatagttcta aaagtaagct atgtttttaa tgggaattag ccatggtcc 59

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> e-sptP-F

<400> 6

atccgaacta ctttacgc 18

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> e-sptP-R

<400> 7

tgaatggcta ttctactgg 19