本發(fā)明屬于磁性材料固定化酶技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用聚丙烯酰胺包覆磁性納米顆粒固定化漆酶的方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
固定化漆酶延長了漆酶的使用壽命，降低了漆酶的使用成本，提高了漆酶的穩(wěn)定性及其對環(huán)境的耐受性，使漆酶在工業(yè)廢水處理、生物傳感器等方面的應(yīng)用前景更為廣闊。
固定化漆酶的使用次數(shù)和效率與酶催化反應(yīng)的生成物有關(guān)。當(dāng)生成物是有色的氧化性物質(zhì)或者是不溶性物質(zhì)時，酶的使用次數(shù)和效率大大下降。因為漆酶的催化反應(yīng)過程中常產(chǎn)生一些氧化性的醌類物質(zhì)，它們的化學(xué)性質(zhì)非?；顫?，很容易吸附在載體上，使固定化酶失活。因此，可以通過使用離子強度高的緩沖溶液沖洗載體而使這種現(xiàn)象得到部分消除。而要徹底消除這種現(xiàn)象就必須選擇合適的固定化載體。這種載體的表面不會吸附這些有色的氧化性物質(zhì)，從而可以長期保持固定化漆酶的活性。例如玻璃陶瓷材料雖然對漆酶的固定化效率不高 (只有 50%)，但它對有色的氧化性物質(zhì)吸附非常低，因此在處理紡織廠和造紙廠的污水時能夠較長時間保持活性。
另一方面當(dāng)催化反應(yīng)的生成物是不溶性物質(zhì)時，它會在反應(yīng)器中沉淀，并且容易在反應(yīng)器出口過 濾膜處沉積從而導(dǎo)致流速減慢甚至完全堵塞出口。這種現(xiàn)象通常是不可避免的，因為多酚氧化酶在催化反應(yīng)中會產(chǎn)生自由基和苯醌類化合物，這些物質(zhì)很容易產(chǎn)生聚合物從而產(chǎn)生絮狀沉淀。這個問題可以通過使用固定化酶的同時，用高分子陽離子絮凝劑如殼聚糖等來清除反應(yīng)產(chǎn)生的聚合物或沉淀而加以解決。
今后，漆酶固定化的發(fā)展方向?qū)⑹菙U大固定化 漆酶產(chǎn)品的生產(chǎn)和應(yīng)用。首先要解決的是真菌大規(guī) 模生產(chǎn)游離漆酶的工業(yè)化問題；其次是要在固定化漆酶產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)條件、設(shè)備及最佳工藝流程方面進行更進一步的研究。固定化漆酶技術(shù)作為一種高效的生物酶催化技術(shù)必將在今后的工業(yè)廢水處理中產(chǎn)生巨大的應(yīng)用價值。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種聚丙烯酰胺包覆磁性納米顆粒固定化漆酶的方法和應(yīng)用。
本發(fā)明利用水熱法和懸浮聚合法，通過簡單的操作就可以制備出用來固定化漆酶的聚丙烯酰胺包覆磁性納米顆粒。
本發(fā)明提供的一種聚丙烯酰胺包覆磁性納米顆粒固定化漆酶的方法和應(yīng)用，包含的工藝步驟如下：
（1） 以含鐵化合物（如三氯化鐵、硫酸鐵等）、堿（如乙酸鈉、氨水等）、表面活性劑（如聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉等）為原料，用水熱法制備出四氧化三鐵磁性納米顆粒；
（2）利用油酸改性四氧化三鐵磁性納米顆粒；
（3）以丙烯酰胺為主要原料，以苯乙烯、二乙烯基苯、偶氮二異丁腈、正庚烷為輔助原料，用懸浮聚合制備出聚丙烯酰胺包覆的四氧化三鐵磁性納米顆粒；
（4）以戊二醛為聯(lián)合劑，將漆酶固定化在聚丙烯酰胺包覆的四氧化三鐵磁性納米顆粒上；
（5）用磁性載體固定化的漆酶，可以重復(fù)多次回收使用，來降解水中的酚類污染物。
本發(fā)明步驟（1）中所述水熱法合成四氧化三鐵的原料為：含鐵化合物（如三氯化鐵、硫酸鐵等）、堿（如乙酸鈉、氨水等）、表面活性劑（如聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉等），溶劑為乙二醇、水、二甘醇等或者其混合物，合成溫度為60-300℃，合成時間為6-72小時。
本發(fā)明步驟（2）中所述油酸改性為：將步驟（1）中合成的四氧化三鐵納米顆粒加入含有油酸的蒸餾水中，反應(yīng)條件為氨水調(diào)節(jié)PH=10，反應(yīng)溫度65-85℃，機械攪拌1-3小時。
本發(fā)明步驟（3）中所述懸浮聚合的反應(yīng)溶液為：將步驟（2）中改性后的四氧化三鐵納米顆粒加入含有丙烯酰胺、苯乙烯、二乙烯基苯、偶氮二異丁腈、正庚烷的水溶液中，冰溶超聲15-30分鐘，0-4℃靜置10-24小時；上述溶液再加入飽和氯化鈉和淀粉水溶液，反應(yīng)溫度60-80℃，機械攪拌2-4小時。
本發(fā)明步驟（4）中所述固定化漆酶過程為：將步驟（3）中懸浮聚合后制備出的聚丙烯酰胺包覆的四氧化三鐵磁性納米顆粒加入含有戊二醛的水溶液中，15-30℃機械攪拌5-8小時；再將聚丙烯酰胺包覆的四氧化三鐵磁性納米顆粒洗滌干凈，加入漆酶溶液中，20-30℃搖擺振蕩5-7小時。
本發(fā)明步驟（5）中所述的降解水中污染物的過程為：將聚丙烯酰胺包覆的四氧化三鐵磁性納米顆粒固定化漆酶加入含有酚類污染物（如雙酚A、對乙酰氨基酚等）的水中，15-30℃搖擺振蕩2-4小時。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施實例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明做各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附帶權(quán)利要求書所限定的范圍。
實施例1：
稱取1g三氯化鐵2.7g乙酸鈉0.75g PEG6000，將三種固體完全溶解于30ml 乙二醇中，超聲15分鐘，攪拌30分鐘，得到深黃色的反應(yīng)混合溶液。將混合溶液裝入100ml反應(yīng)釜，放入馬弗爐中反應(yīng)，反應(yīng)溫度200℃，反應(yīng)時間8小時。反應(yīng)完成后，自然降溫至室溫，用磁鐵吸引將上層液體倒出，固體用水和乙醇交替洗滌，真空干燥，冷卻，收集產(chǎn)物得到黑色粉末，即是四氧化三鐵納米顆粒。
稱取0.5g上述合成的四氧化三鐵納米加入10ml蒸餾水中，加入0.5g油酸，用氨水調(diào)節(jié)PH約為10，反應(yīng)溫度80℃，機械攪拌1小時。反應(yīng)完成后，自然降溫至室溫，用磁鐵吸引將上層清液倒出，固體用水和乙醇交替洗滌，真空干燥，冷卻，收集產(chǎn)物得到黑色粉末，即是親油性四氧化三鐵納米顆粒。
稱取0.15g上述反應(yīng)得到的親油性四氧化三鐵納米顆粒加入50ml蒸餾水中，加入 1.5g丙烯酰胺，加入0.36ml苯乙烯，加入0.38ml二乙烯基苯，加入0.022g偶氮二異丁腈，加入0.6ml正庚烷，混合均勻后，冰溶超聲20分鐘，4℃靜置12小時。在上述溶液中加入30ml飽和氯化鈉，加入0.69g淀粉，反應(yīng)溫度70℃，機械攪拌2小時。反應(yīng)完成后，自然降溫至室溫，用磁鐵吸引將上層液體倒出，固體用水和乙醇交替洗滌，再用甲醇抽提3天，真空干燥，冷卻，收集產(chǎn)物得到黑色固體顆粒，即是用聚丙烯酰胺包覆的磁性四氧化三鐵納米顆粒。
稱取0.1g用聚丙烯酰胺包覆的磁性四氧化三鐵納米顆粒,加入20ml 10%的戊二醛水溶液，室溫機械攪拌6小時，反應(yīng)完成后，用水和乙醇交替洗滌，再加入到30ml蒸餾水中，加入漆酶粉末0.02g,然后放入轉(zhuǎn)速為120rpm的搖床中，30℃反應(yīng)6小時。固定化結(jié)束后，用磁鐵吸引分離，并用PH=7.0，0.1mol/l的磷酸緩沖液去除未能結(jié)合上去的游離酶。
用Bradford-考馬斯亮藍法，測定載體的載酶量，計算載體的載酶率，載酶率在65%-75%。用ABTS-紫外可見分光光度法，測定游離態(tài)的漆酶酶活力和固定化后的漆酶酶活力，計算酶活力回收率，酶活力回收率在93%-98%。
將固定化了漆酶的聚丙烯酰胺包覆的四氧化三鐵磁性納米顆粒0.1g加入含有20mg/L雙酚A的水溶液20ml中，室溫搖擺振蕩2小時，99%以上的雙酚A被分解。
實施例2
稱取5g三氯化鐵13.5g乙酸鈉3.75g PEG6000，將三種固體完全溶解于150ml 乙二醇中，超聲15分鐘，攪拌30分鐘，得到深黃色的反應(yīng)混合溶液。將混合溶液裝入250ml反應(yīng)釜，放入馬弗爐中反應(yīng)，反應(yīng)溫度200℃，反應(yīng)時間8小時。反應(yīng)完成后，自然降溫至室溫，用磁鐵吸引將上層液體倒出，固體用水和乙醇交替洗滌，真空干燥，冷卻，收集產(chǎn)物得到黑色粉末，即是四氧化三鐵納米顆粒。
稱取2.5g上述合成的四氧化三鐵納米加入100ml蒸餾水中，加入2.5g油酸，用氨水調(diào)節(jié)PH約為10，反應(yīng)溫度80℃，機械攪拌1小時。反應(yīng)完成后，自然降溫至室溫，用磁鐵吸引將上層清液倒出，固體用水和乙醇交替洗滌，真空干燥，冷卻，收集產(chǎn)物得到黑色粉末，即是親油性四氧化三鐵納米顆粒。
稱取0.75g上述反應(yīng)得到的親油性四氧化三鐵納米顆粒加入250ml蒸餾水中，加入 7.5g丙烯酰胺，加入1.8ml苯乙烯，加入1.9ml二乙烯基苯，加入0.11g偶氮二異丁腈，加入3ml正庚烷，混合均勻后，冰溶超聲20分鐘，4℃靜置12小時。在上述溶液中加入150ml飽和氯化鈉，加入3.45g淀粉，反應(yīng)溫度70℃，機械攪拌2小時。反應(yīng)完成后，自然降溫至室溫，用磁鐵吸引將上層液體倒出，固體用水和乙醇交替洗滌，再用甲醇抽提3天，真空干燥，冷卻，收集產(chǎn)物得到黑色固體顆粒，即是用聚丙烯酰胺包覆的磁性四氧化三鐵納米顆粒。
稱取0.5g用聚丙烯酰胺包覆的磁性四氧化三鐵納米顆粒,加入100ml 10%的戊二醛水溶液，室溫機械攪拌6小時，反應(yīng)完成后，用水和乙醇交替洗滌，再加入到150ml蒸餾水中，加入漆酶粉末0.1g,然后放入轉(zhuǎn)速為120rpm的搖床中，30℃反應(yīng)6小時。固定化結(jié)束后，用磁鐵吸引分離，并用PH=7.0，0.1mol/l的磷酸緩沖液去除未能結(jié)合上去的游離酶。
用Bradford-考馬斯亮藍法，測定載體的載酶量，計算載體的載酶率，載酶率在65%-75%。用ABTS-紫外可見分光光度法，測定游離態(tài)的漆酶酶活力和固定化后的漆酶酶活力，計算酶活力回收率，酶活力回收率在93%-98%。
將固定化了漆酶的聚丙烯酰胺包覆的四氧化三鐵磁性納米顆粒0.5g加入含有20mg/L雙酚A的水溶液100ml中，室溫搖擺振蕩2小時，99%以上的雙酚A被分解。
對比實施例1，本實施例2是將實施例1中各步驟中反應(yīng)物量和溶劑量等全部放大了5倍，具體的制備方法和操作方法與實施例1中相同，得到的結(jié)果與實施例1基本一致。
實施例3：
稱取1g三氯化鐵2.7g乙酸鈉0.75g PEG6000，將三種固體完全溶解于30ml 乙二醇中，超聲15分鐘，攪拌30分鐘，得到深黃色的反應(yīng)混合溶液。將混合溶液裝入100ml反應(yīng)釜，放入馬弗爐中反應(yīng)，反應(yīng)溫度180℃，反應(yīng)時間12小時。反應(yīng)完成后，自然降溫至室溫，用磁鐵吸引將上層液體倒出，固體用水和乙醇交替洗滌，真空干燥，冷卻，收集產(chǎn)物得到黑色粉末，即是四氧化三鐵納米顆粒。
稱取0.5g上述合成的四氧化三鐵納米加入10ml蒸餾水中，加入0.5g油酸，用氨水調(diào)節(jié)PH約為10，反應(yīng)溫度80℃，機械攪拌1小時。反應(yīng)完成后，自然降溫至室溫，用磁鐵吸引將上層清液倒出，固體用水和乙醇交替洗滌，真空干燥，冷卻，收集產(chǎn)物得到黑色粉末，即是親油性四氧化三鐵納米顆粒。
稱取0.15g上述反應(yīng)得到的親油性四氧化三鐵納米顆粒加入50ml蒸餾水中，加入 1.5g丙烯酰胺，加入0.36ml苯乙烯，加入0.38ml二乙烯基苯，加入0.022g偶氮二異丁腈，加入0.6ml正庚烷，混合均勻后，冰溶超聲20分鐘，4℃靜置12小時。在上述溶液中加入30ml飽和氯化鈉，加入0.69g淀粉，反應(yīng)溫度70℃，機械攪拌2小時。反應(yīng)完成后，自然降溫至室溫，用磁鐵吸引將上層液體倒出，固體用水和乙醇交替洗滌，再用甲醇抽提3天，真空干燥，冷卻，收集產(chǎn)物得到黑色固體顆粒，即是用聚丙烯酰胺包覆的磁性四氧化三鐵納米顆粒。
稱取0.1g用聚丙烯酰胺包覆的磁性四氧化三鐵納米顆粒,加入20ml 10%的戊二醛水溶液，室溫機械攪拌6小時，反應(yīng)完成后，用水和乙醇交替洗滌，再加入到30ml蒸餾水中，加入漆酶粉末0.02g,然后放入轉(zhuǎn)速為120rpm的搖床中，30℃反應(yīng)6小時。固定化結(jié)束后，用磁鐵吸引分離，并用PH=7.0，0.1mol/l的磷酸緩沖液去除未能結(jié)合上去的游離酶。
用Bradford-考馬斯亮藍法，測定載體的載酶量，計算載體的載酶率，載酶率在65%-75%。用ABTS-紫外可見分光光度法，測定游離態(tài)的漆酶酶活力和固定化后的漆酶酶活力，計算酶活力回收率，酶活力回收率在93%-98%。
將固定化了漆酶的聚丙烯酰胺包覆的四氧化三鐵磁性納米顆粒0.1g加入含有20mg/L雙酚A的水溶液20ml中，室溫搖擺振蕩2小時，99%以上的雙酚A被分解。
對比實施例1，本實施例3是將實施例1中水熱法制備四氧化三鐵磁性納米顆粒的反應(yīng)溫度改為180度，反應(yīng)時間改為12小時，具體的制備方法和操作方法與實施例1中相同，得到的結(jié)果與實施例1基本一致。
實施例4：
稱取1g三氯化鐵2.7g乙酸鈉0.75g PEG6000，將三種固體完全溶解于30ml 乙二醇中，超聲15分鐘，攪拌30分鐘，得到深黃色的反應(yīng)混合溶液。將混合溶液裝入100ml反應(yīng)釜，放入馬弗爐中反應(yīng)，反應(yīng)溫度200℃，反應(yīng)時間8小時。反應(yīng)完成后，自然降溫至室溫，用磁鐵吸引將上層液體倒出，固體用水和乙醇交替洗滌，真空干燥，冷卻，收集產(chǎn)物得到黑色粉末，即是四氧化三鐵納米顆粒。
稱取0.5g上述合成的四氧化三鐵納米加入10ml蒸餾水中，加入0.5g油酸，用氨水調(diào)節(jié)PH約為10，反應(yīng)溫度80℃，機械攪拌1小時。反應(yīng)完成后，自然降溫至室溫，用磁鐵吸引將上層清液倒出，固體用水和乙醇交替洗滌，真空干燥，冷卻，收集產(chǎn)物得到黑色粉末，即是親油性四氧化三鐵納米顆粒。
稱取0.15g上述反應(yīng)得到的親油性四氧化三鐵納米顆粒加入50ml蒸餾水中，加入 1.5g丙烯酰胺，加入0.36ml苯乙烯，加入0.38ml二乙烯基苯，加入0.022g偶氮二異丁腈，加入0.6ml正庚烷，混合均勻后，冰溶超聲20分鐘，4℃靜置12小時。在上述溶液中加入30ml飽和氯化鈉，加入0.69g淀粉，反應(yīng)溫度80℃，機械攪拌3小時。反應(yīng)完成后，自然降溫至室溫，用磁鐵吸引將上層液體倒出，固體用水和乙醇交替洗滌，再用甲醇抽提3天，真空干燥，冷卻，收集產(chǎn)物得到黑色固體顆粒，即是用聚丙烯酰胺包覆的磁性四氧化三鐵納米顆粒。
稱取0.1g用聚丙烯酰胺包覆的磁性四氧化三鐵納米顆粒,加入20ml 10%的戊二醛水溶液，室溫機械攪拌6小時，反應(yīng)完成后，用水和乙醇交替洗滌，再加入到30ml蒸餾水中，加入漆酶粉末0.02g,然后放入轉(zhuǎn)速為120rpm的搖床中，30℃反應(yīng)6小時。固定化結(jié)束后，用磁鐵吸引分離，并用PH=7.0，0.1mol/l的磷酸緩沖液去除未能結(jié)合上去的游離酶。
用Bradford-考馬斯亮藍法，測定載體的載酶量，計算載體的載酶率，載酶率在65%-75%。用ABTS-紫外可見分光光度法，測定游離態(tài)的漆酶酶活力和固定化后的漆酶酶活力，計算酶活力回收率，酶活力回收率在93%-98%。
將固定化了漆酶的聚丙烯酰胺包覆的四氧化三鐵磁性納米顆粒0.1g加入含有20mg/L雙酚A的水溶液20ml中，室溫搖擺振蕩2小時，99%以上的雙酚A被分解。
對比實施例1，本實施例4是將實施例1中用懸浮聚合制備聚丙烯酰胺包覆的四氧化三鐵磁性納米顆粒過程中的反應(yīng)溫度改為80℃，機械攪拌時間改為3小時，具體的制備方法和操作方法與實施例1中相同，得到的結(jié)果與實施例1基本一致。
實施例5：
稱取1g三氯化鐵2.7g乙酸鈉0.75g PEG6000，將三種固體完全溶解于30ml 乙二醇中，超聲15分鐘，攪拌30分鐘，得到深黃色的反應(yīng)混合溶液。將混合溶液裝入100ml反應(yīng)釜，放入馬弗爐中反應(yīng)，反應(yīng)溫度200℃，反應(yīng)時間8小時。反應(yīng)完成后，自然降溫至室溫，用磁鐵吸引將上層液體倒出，固體用水和乙醇交替洗滌，真空干燥，冷卻，收集產(chǎn)物得到黑色粉末，即是四氧化三鐵納米顆粒。
稱取0.5g上述合成的四氧化三鐵納米加入10ml蒸餾水中，加入0.5g油酸，用氨水調(diào)節(jié)PH約為10，反應(yīng)溫度80℃，機械攪拌1小時。反應(yīng)完成后，自然降溫至室溫，用磁鐵吸引將上層清液倒出，固體用水和乙醇交替洗滌，真空干燥，冷卻，收集產(chǎn)物得到黑色粉末，即是親油性四氧化三鐵納米顆粒。
稱取0.15g上述反應(yīng)得到的親油性四氧化三鐵納米顆粒加入50ml蒸餾水中，加入 1.5g丙烯酰胺，加入0.36ml苯乙烯，加入0.38ml二乙烯基苯，加入0.022g偶氮二異丁腈，加入0.6ml正庚烷，混合均勻后，冰溶超聲20分鐘，4℃靜置12小時。在上述溶液中加入30ml飽和氯化鈉，加入0.69g淀粉，反應(yīng)溫度70℃，機械攪拌2小時。反應(yīng)完成后，自然降溫至室溫，用磁鐵吸引將上層液體倒出，固體用水和乙醇交替洗滌，再用甲醇抽提3天，真空干燥，冷卻，收集產(chǎn)物得到黑色固體顆粒，即是用聚丙烯酰胺包覆的磁性四氧化三鐵納米顆粒。
稱取0.1g用聚丙烯酰胺包覆的磁性四氧化三鐵納米顆粒,加入20ml 10%的戊二醛水溶液，室溫機械攪拌6小時，反應(yīng)完成后，用水和乙醇交替洗滌，再加入到30ml蒸餾水中，加入漆酶粉末0.02g,然后放入轉(zhuǎn)速為120rpm的搖床中，30℃反應(yīng)6小時。固定化結(jié)束后，用磁鐵吸引分離，并用PH=7.0，0.1mol/l的磷酸緩沖液去除未能結(jié)合上去的游離酶。
用Bradford-考馬斯亮藍法，測定載體的載酶量，計算載體的載酶率，載酶率在65%-75%。用ABTS-紫外可見分光光度法，測定游離態(tài)的漆酶酶活力和固定化后的漆酶酶活力，計算酶活力回收率，酶活力回收率在93%-98%。
將固定化了漆酶的聚丙烯酰胺包覆的四氧化三鐵磁性納米顆粒0.1g加入含有20mg/L雙酚A的水溶液20ml中，室溫搖擺振蕩2小時，99%以上的雙酚A被分解。
回收固定化了漆酶的聚丙烯酰胺包覆的四氧化三鐵磁性納米顆粒，重復(fù)回收用于降解實驗5次，每處理一次污染物后都對回收的固定化漆酶進行徹底的洗滌，仍然能使99%以上的雙酚A被分解。
對比實施例1，本實施例5是將實施例1中降解酚類污染物的過程重復(fù)回收進行5次，具體的制備方法和操作方法與實施例1中相同，得到的結(jié)果與實施例1基本一致。