本發(fā)明涉及工業(yè)微生物脅迫耐受性領(lǐng)域和分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種分子改造手段提高釀酒酵母乙醇耐受性的方法。

背景技術(shù)：

自近幾十年爆發(fā)的資源危機(jī)以來，能源枯竭以及日趨惡化的環(huán)境問題，使燃料乙醇作為新型可再生清潔能源備受關(guān)注。燃料乙醇是一種代表性的可再生清潔能源，可以緩解我國(guó)能源緊張的現(xiàn)狀、降低原油進(jìn)口依賴度，并能大大緩解化石燃料煉制與消費(fèi)過程中帶來的嚴(yán)重環(huán)境污染問題，目前燃料乙醇已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用。人們希望利用廉價(jià)的木質(zhì)纖維素原料最終實(shí)現(xiàn)超高濃度(Very High Gravity，VHG)乙醇發(fā)酵，通過超過25％(v/v)的高終點(diǎn)乙醇濃度來大大降低了乙醇精餾能耗和廢槽液總量、提高生產(chǎn)效率。

但在發(fā)酵過程中，隨著終產(chǎn)物乙醇濃度的提高，乙醇在一眾環(huán)境脅迫因子(溫度、滲透壓、低pH、纖維素原料降解產(chǎn)生的有毒副產(chǎn)物等)中成為最主要的脅迫因素，酵母細(xì)胞活性被高濃度乙醇嚴(yán)重抑制甚至出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯和死亡的現(xiàn)象。從過程工程控制角度進(jìn)行的工藝優(yōu)化只能部分緩解這種脅迫因素，不能完全彌補(bǔ)酵母菌本身性能下降引發(fā)的發(fā)酵效率的降低問題。因此，揭示酵母細(xì)胞復(fù)雜的乙醇脅迫響應(yīng)機(jī)制、有效的篩選或構(gòu)建具有高耐受性高發(fā)酵性能的菌株一直是發(fā)酵工業(yè)追求的目標(biāo)。

組學(xué)的深入分析揭示應(yīng)對(duì)乙醇脅迫細(xì)胞在整體的轉(zhuǎn)錄/翻譯水平發(fā)生了調(diào)整，表達(dá)水平發(fā)生變化的基因數(shù)量依據(jù)不同的乙醇作用方式可達(dá)上百甚至上千，因此分子水平上的耐性改造策略已采用全局性、非靶向性的方法來代替?zhèn)鹘y(tǒng)單基因操作，如基因組改組、全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控等；生理生化水平的研究集中在乙醇脅迫響應(yīng)下酵母細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的組分改變、防止蛋白變性的大分子物質(zhì)的積累、更活躍的氧化-還原酶系統(tǒng)等，但對(duì)細(xì)胞形態(tài)和乙醇耐受性關(guān)系研究及機(jī)理探討還很鮮見，酵母細(xì)胞在乙醇脅迫下出現(xiàn)的"伸長(zhǎng)"、"單極出芽"等現(xiàn)象僅被認(rèn)為是細(xì)胞被動(dòng)承受乙醇脅迫的附屬結(jié)果，并且認(rèn)為這種"伸長(zhǎng)"使細(xì)胞的處境更為不利，活性進(jìn)一步降低。

但是，已有很多實(shí)例表明酵母細(xì)胞受到環(huán)境的刺激、伴隨極化狀態(tài)改變而出現(xiàn)的細(xì)胞形態(tài)變化其目的是更快更好的適應(yīng)環(huán)境，如假絲酵母只有在假絲型生長(zhǎng)狀態(tài)下才具有致病性，釀酒酵母在限氮固體培養(yǎng)基上出現(xiàn)的絲狀生長(zhǎng)現(xiàn)象使其擴(kuò)展生存空間獲取營(yíng)養(yǎng)。因此猜測(cè)釀酒酵母乙醇脅迫下形態(tài)的改變可能與細(xì)胞主動(dòng)的乙醇響應(yīng)存在關(guān)系，解決這一問題的關(guān)鍵是找到細(xì)胞形態(tài)與脅迫耐受性之間的媒介與橋梁，小分子量GTP水解酶家族引起了我們的關(guān)注。

小分子量GTP酶的功能為結(jié)合并水解鳥苷酸，當(dāng)其活性部位被GTP占據(jù)后發(fā)生構(gòu)象變化，特定部位可介導(dǎo)自身與下游靶點(diǎn)相互作用。在釀酒酵母的研究中已證明小GTP酶的活性與多種脅迫響應(yīng)有關(guān)，如細(xì)胞壁損傷修復(fù)、多效藥物響應(yīng)(pleiotropic drug response，PDR)、離子脅迫響應(yīng)、饑餓及耐熱性、滲透壓脅迫、活性氧(ROS)產(chǎn)生與消除途徑等，直接或間接影響眾多基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，如與多效脅迫響應(yīng)相關(guān)的雷帕霉素靶TOR復(fù)合物I(TORC1)依賴的信號(hào)級(jí)聯(lián)過程、HOG MAP kinase途徑、Pkc1依賴的細(xì)胞壁完整CWI途徑等。但小GTP酶與乙醇耐受性直接或間接相關(guān)的報(bào)導(dǎo)還較少見。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種以RhoGTPase為中心靶點(diǎn)改造菌種的方法用于提高釀酒酵母乙醇脅迫耐受性。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種分子改造手段提高釀酒酵母乙醇耐受性的方法，建立RHO1基因的突變序列文庫，導(dǎo)入釀酒酵母，通過添加乙醇的平板篩選方法獲得耐受性提高的菌株。

優(yōu)選地，所述RHO1基因的突變序列文庫由易錯(cuò)PCR獲得。

優(yōu)選地，突變序列文庫靶基因?yàn)镽hoGTPase中的RHO1基因。

優(yōu)選地，用于釀酒酵母轉(zhuǎn)化的載體以pRS316為骨架、由對(duì)應(yīng)宿主的PGK1啟動(dòng)子調(diào)節(jié)插入片段表達(dá)。

優(yōu)選地，以PGK-F/R為引物PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子片段pRS316載體。

更為具體地，一種提高釀酒酵母乙醇耐受性的方法，包括以下步驟：

S1.基因組選??；取釀酒酵母種子接種于YPD培養(yǎng)基30℃過夜培養(yǎng)后，以標(biāo)準(zhǔn)方法提取酵母基因組。

S2.以PGK-F/R為引物PCR擴(kuò)增對(duì)應(yīng)宿主PGK1啟動(dòng)子片段，以BamHI和EcoRI雙酶切、回收后，連入經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切線性化的pRS316載體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，挑選陽性克隆并提取質(zhì)粒，同樣雙切驗(yàn)證片段正確后，命名該載體為pRS316-PGK01；

S3.以基因組為模板，用引物對(duì)RHO-F/R利用易錯(cuò)PCR擴(kuò)增RHO1基因，克隆得到的片段純化后與載體pRS316-PGK01分別進(jìn)行EcoRI、KpnI雙酶切，隨后進(jìn)行連接反應(yīng)，進(jìn)行轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5α，挑選陽性克隆制成混菌，提取質(zhì)粒，即為突變序列的載體文庫。

S4.將突變序列的載體文庫的突變載體轉(zhuǎn)入釀酒酵母，以G418(終濃度100ug/mL)為篩選藥物，涂布于含5-12％(v/v)乙醇的平板上，篩選得到耐受性高的菌株。

優(yōu)選的，所述步驟S4中，乙醇平板培養(yǎng)條件具體為：30℃培養(yǎng)48h，挑選可以正常生長(zhǎng)的菌落，進(jìn)行耐受性評(píng)價(jià)，篩選得耐受性高的菌株。

上述方法可適用于工業(yè)釀酒酵母或?qū)嶒?yàn)室模式菌株。

本發(fā)明利用小GTP水解酶從調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)入手進(jìn)而提高細(xì)胞乙醇脅迫耐受響應(yīng)，采用類似全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控的方法對(duì)小GTP水解酶進(jìn)行隨機(jī)突變，通過主動(dòng)干預(yù)細(xì)胞形態(tài)來達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞乙醇耐受性的目的。這一新的耐受性調(diào)節(jié)方式的引入對(duì)乙醇耐性機(jī)理研究與提高燃料乙醇生產(chǎn)效率都有重要的意義，并可以為適應(yīng)性進(jìn)化研究提供參考。通過本發(fā)明方法可有效篩選到乙醇耐受性提高的菌株，構(gòu)建的載體有普遍適用性，可適用于實(shí)驗(yàn)室酵母、工業(yè)酵母。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1啟動(dòng)子電泳圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1測(cè)序發(fā)現(xiàn)的套峰；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1的pRS315-PGK-RHO01雙酶切驗(yàn)證電泳圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1乙醇耐受性考察結(jié)果圖；其中，A為YPD平板；B為含5％(v/v)無水乙醇的YPD平板；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例2突變株乙醇耐受性驗(yàn)證結(jié)果圖；其中，A為YPD平板，B為含12％(v/v)乙醇的YPD平板。

具體實(shí)施方式

下面以具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明不以任何形式受限于實(shí)施例內(nèi)容。實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；如無特殊說明，所述試劑和生物材料，均可從商業(yè)途徑獲得。

(1)菌株：實(shí)驗(yàn)室模式釀酒酵母Sc288c、工業(yè)釀酒酵母Sc4126；大腸桿菌E.coli DH5α。

(2)載體骨架：pRS316。

(3)培養(yǎng)基：

YPD培養(yǎng)基：葡萄糖2.5wt％，蛋白胨0.5wt％，酵母浸粉0.5wt％，自來水溶解，固體培養(yǎng)基加瓊脂2wt％

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨1wt％，酵母浸出粉0.5wt％，NaCl 1wt％，去離子水配置，pH7.0-7.2，固體培養(yǎng)基加2wt％的瓊脂。

(4)引物：

實(shí)施例1

提高實(shí)驗(yàn)室模式菌株S288c乙醇脅迫耐受性：

(1)基因組提?。喝√幱趯?duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期到穩(wěn)定期前期的實(shí)驗(yàn)室酵母Sc288c過夜培養(yǎng)物，3000r/min離心5min，棄上清，用3ml無菌水洗細(xì)胞，3000r/min離心5min，用500ul裂解緩沖液(0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)，50mmol/L EDTA，1％SDS)再次懸浮，加入干凈酸洗玻璃珠(約1.5mi離心管2/3體積)和25ul的5mmol/L NaCl，以最高速震蕩2min，10000r/min離心2min，轉(zhuǎn)移上清液至新離心管；加入500ul苯酚，震蕩，離心1min。吸取水相至新的離心管，加入2倍體積的無水乙醇，在—20℃下沉淀至少1h，最高轉(zhuǎn)速離心5min沉淀DNA，棄上清，用70％乙醇清洗，最后懸浮在50ul緩沖液中(2.5mM Tris-HCl(pH8.0))，獲得酵母基因組。

(2)含啟動(dòng)子片段的載體構(gòu)建：以PGK-F/R為引物PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子片段。

PCR體系：

PCR程序：

如圖1所示為啟動(dòng)子電泳圖，其中，M：DL2000Marker；P1：PGK1啟動(dòng)子克隆片段。擴(kuò)增產(chǎn)物用Takara回收試劑盒回收后，以BamHI和EcoRI雙酶切，37℃酶切2h。

酶切體系：

同上進(jìn)行片段回收。同時(shí)pRS316質(zhì)粒也進(jìn)行同樣的酶切反應(yīng)，反應(yīng)體系：

隨后進(jìn)行連接反應(yīng)。反應(yīng)體系：

該反應(yīng)體系于16℃水浴，過夜連接。連接產(chǎn)物隨后進(jìn)行感受態(tài)細(xì)胞制備與轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

從-80℃取出凍存的E.coli DH5α，接種于50ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)過夜。將該菌種懸液以1:100的比例接種，取250ul菌液轉(zhuǎn)接到50ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2～3h至OD₆₀₀＝0.4-0.5左右。將菌液轉(zhuǎn)入50mL離心管中，冰上放置10min。在4℃下，4000r/min離心10min。棄去上清，將管倒置1min以便培養(yǎng)液流盡。用冰上預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液10mL輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置30min，4℃4000r/min離心10min，棄去上清，加入2mL預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置。加入質(zhì)粒DNA溶液，輕輕搖勻，冰上放置30分鐘后，42℃水浴中熱擊90秒，熱擊后迅速置于冰上冷卻5分鐘。向管中加入1ml LB液體培養(yǎng)基(不含Amp和Kan)，混勻后37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因。將上述菌液搖勻后取100ul涂布于含Amp及Kan雙抗的篩選平板上，正面向上放置半小時(shí)，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)16-24小時(shí)。以Takara質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，以上述酶切驗(yàn)證是否連接正確。驗(yàn)證片段正確后，命名該載體為pRS316-PGK01

(3)突變文庫載體構(gòu)建：以上述基因組為模板，利用易錯(cuò)PCR擴(kuò)增RHO1基因，突變率保持在5％以下。

擴(kuò)增體系如下：

擴(kuò)增產(chǎn)物為含堿基突變的混合物。測(cè)序檢測(cè)到一定信號(hào)強(qiáng)度的套峰(圖2)，表明引入了突變位點(diǎn)。

同上用Takara純化試劑盒純化PCR片段，與pRS316-PGK01分別進(jìn)行EcoRI、KpnI的雙酶切，隨后進(jìn)行連接反應(yīng)，同上進(jìn)行轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選陽性克隆制成混菌，提取質(zhì)粒，即獲得突變序列的載體文庫。載體命名為pRS315-PGK-RHO01,用EcoRI、KpnI雙酶切驗(yàn)證結(jié)果如圖3所示，其中，M：DL2000Marker；R：表達(dá)載體酶切驗(yàn)證。

(4)耐受性提高的突變體篩選

將含不同突變序列的混合載體pRS315-PGK-RHO01電轉(zhuǎn)化入釀酒酵母S288c。在含5ml YPD的50ml離心管中，培養(yǎng)酵母，30℃過夜，取0.1-0.5ml過夜培養(yǎng)物，接種含100ml新鮮培養(yǎng)基的500ml搖瓶，30℃生長(zhǎng)至OD₆₀₀大約1.3-1.5左右；在4℃，3000r/min離心5min收集細(xì)胞，用50ml預(yù)冷的滅菌水懸浮細(xì)胞；在4℃，3000r/min離心5min收集細(xì)胞，用25ml預(yù)冷的滅菌水懸浮細(xì)胞；在4℃，3000r/min離心5min收集細(xì)胞，用2ml預(yù)冷的1M山梨醇懸浮細(xì)胞；在4℃，5000r/min離心5min收集細(xì)胞，用200ul預(yù)冷的1M山梨醇懸浮細(xì)胞；分裝細(xì)胞用以電轉(zhuǎn)。每40uL細(xì)胞加入約5～10ug的線性化的DNA 2ul，槍吹勻，置0.2cm電轉(zhuǎn)杯冰浴5min；使用預(yù)設(shè)程序Sc2(1500V，BioRad)，立即加入1ml 1M山梨醇，靜置培養(yǎng)1h以上。將菌體懸液涂布于YPD(含有100ug/mL的G418)和5％(v/v)乙醇的平板上，濃縮涂布篩選平板，培養(yǎng)48h。

可以正常生長(zhǎng)的細(xì)胞即可能為乙醇耐受性提高菌株，選菌落直徑最大的進(jìn)行復(fù)篩。將其作十倍梯度稀釋，2ul點(diǎn)滴含5％(v/v)乙醇平板和正常的YPD平板，觀察菌落生長(zhǎng)情況。圖4為含突變序列的菌體乙醇耐受性考察結(jié)果，其中，Control：出發(fā)菌株為實(shí)驗(yàn)室酵母S288c；1：篩選得到的一株突變體。從圖4可知，突變體耐受性要較出發(fā)菌株提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)。

實(shí)施例2

提高工業(yè)釀酒酵母菌株Sc4126乙醇脅迫耐受性：

實(shí)驗(yàn)基本步驟同實(shí)施例1，將基因組換為Sc4126基因組；電轉(zhuǎn)的宿主酵母為Sc4126。結(jié)果如圖5所示為突變株乙醇耐受性驗(yàn)證結(jié)果圖，出發(fā)菌株為工業(yè)酵母Sc4126，Sc4126-12與Sc4126-19為兩株突變體，其中圖5A為YPD平板，圖5B為含12％(v/v)乙醇的YPD平板，從圖5A和圖5B可知，突變體較出發(fā)菌株Sc4126乙醇耐受性有不同程度的提高。說明此方法可以適用于工業(yè)釀酒酵母和實(shí)驗(yàn)室酵母。