本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體的說是利用紅花懸浮細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)CD20單鏈抗體的方法。

背景技術(shù)：

植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)是指將植物細(xì)胞或較小的細(xì)胞團(tuán)懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中能夠保持良好的分散狀態(tài)。近年來，植物懸浮細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)已成為有前途的替代傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵和哺乳動物細(xì)胞的生物反應(yīng)器，其特點在于：⑴細(xì)胞可以不斷增殖，形成高密度的細(xì)胞群體，適于大規(guī)模培養(yǎng)；⑵可以提供大量較為均勻的細(xì)胞；⑶內(nèi)源蛋白水解酶活性低；⑷可以進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)和瞬時表達(dá)；⑸蛋白表達(dá)穩(wěn)定性高；⑹具有蛋白翻譯后修飾的能力及產(chǎn)品能夠工業(yè)化生產(chǎn)。自1993年來，關(guān)于植物懸浮細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的研究專利，我國僅有相關(guān)研究專利5篇，且從2006年才開始申報。而國外在1993年就已經(jīng)有水稻原生質(zhì)體懸浮細(xì)胞表達(dá)蛋白的專利出現(xiàn)，在專利申報方面國內(nèi)與國外存在較大的差距。

CD20 是一種磷酸化蛋白質(zhì)分子, 分子質(zhì)量約為53kD, 屬于 4 次跨膜的蛋白質(zhì)超家族, 為B淋巴細(xì)胞表面特有的分化抗原。CD20 分子具有不易脫落、與抗體結(jié)合后不內(nèi)化、在人體血清中無游離形式存在等特征，因此作為治療B細(xì)胞淋巴瘤的理想作用靶點受到了人們的關(guān)注。目前，關(guān)于CD20的抗體藥物陸續(xù)被批準(zhǔn)上市，且價格越來越昂貴，生產(chǎn)成本較高。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是單鏈抗體最常用的原核表達(dá)系統(tǒng)，很多單鏈抗體的研究均選擇此表達(dá)系統(tǒng)。然而大腸桿菌是原核生物，普遍認(rèn)為，其表達(dá)產(chǎn)物缺乏糖基化等加工修飾而在人體內(nèi)穩(wěn)定性較差易被降解。另外，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的有熱原質(zhì)（pyrogen），生物制品或注射液除去熱原質(zhì)比較困難。

本項目擬建立植物（紅花）的懸浮細(xì)胞表達(dá)體系，利用植物懸浮細(xì)胞系統(tǒng)來表達(dá)具有重要生物活性的CD20單鏈抗體藥物，為推動我國抗體藥物市場的發(fā)展開辟新的生產(chǎn)途徑。

本發(fā)明的目的是為了解決大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)產(chǎn)物缺乏糖基化等加工修飾而在人體內(nèi)穩(wěn)定性較差易被降解、存在熱原質(zhì)問題，提高CD20單鏈抗體的活，而提供一種CD20單鏈抗體基因及利用紅花懸浮細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)CD20單鏈抗體的方法。

一種CD20單鏈抗體基因，它的堿基序列如SEQ ID NO.2所示。

重組植物表達(dá)載體pBasta-LPH-CD20，將序列表SEQ ID NO.2所示的基因插入了植物表達(dá)載體pBasta。

利用紅花懸浮細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)CD20單鏈抗體的方法,它包括：

1）重組質(zhì)粒pBasta-LPH-CD20轉(zhuǎn)化到感受態(tài)農(nóng)桿菌中；所述的重組質(zhì)粒pBasta-LPH-CD20，是在植物表達(dá)載體pBasta插入了序列表SEQ ID NO.1或2所示的基因；

2）農(nóng)桿菌侵染外植體，所述的外植體為紅花葉片；

3) 轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基共培養(yǎng)；2mg/L NAA+ 0.5mg/ L6-BA的MS培養(yǎng)基

4) 轉(zhuǎn)到愈傷繼代培養(yǎng)基中抑菌培養(yǎng)；

5）誘導(dǎo)分化出愈傷組織接種到進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

6）獲得愈傷組織后進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)，繼代三次后獲得懸浮細(xì)胞，將獲得的懸浮細(xì)胞進(jìn)行蛋白提??；

步驟3所述的培養(yǎng)基為2mg/L NAA+ 0.5mg/ L6-BA的MS培養(yǎng)基；

步驟4所述的培養(yǎng)基為2mg/L NAA+ 0.5mg/ L 6-BA+100 mg/L 頭孢霉素+100 mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基；

步驟5所述的培養(yǎng)基為1mg/L NAA+ 0.5mg/ L 6-BA+100 mg/L 頭孢霉素+100 mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基。

本發(fā)明提供一種利用紅花懸浮細(xì)胞系統(tǒng)生產(chǎn)CD20單鏈抗體的方法。本發(fā)明按照植物偏好性密碼子，人工合成CD20單鏈抗體基因，將其連接到含有35S啟動子的植物表達(dá)載體pBasta上，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化紅花愈傷組織，篩選出具有抗性的愈傷組織然后進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，最后獲得大量懸浮細(xì)胞，提取蛋白進(jìn)行純化并檢測，結(jié)果表明，利用紅花懸浮細(xì)胞表達(dá)的CD20抗體的活性高于利用擬南芥種子系統(tǒng)表達(dá)的抗體活性，利用紅花懸浮系統(tǒng)表達(dá)突變后的TK-CD20活性明顯高于原有序列的表達(dá)活性。

附圖說明

附圖1 CD20基因的PCR擴增結(jié)果；

附圖2 pEASY-T1-CD20的PCR鑒定結(jié)果；

附圖3 pBasta-LPH-CD20雙酶切鑒定結(jié)果；

附圖4 pBasta-LPH-CD20的農(nóng)桿菌菌液PCR檢測；

附圖5紅花懸浮細(xì)胞體系鑒定結(jié)果；

附圖6 pBasta-LPH-CD20轉(zhuǎn)基因紅花懸浮細(xì)胞Western blot檢測；

附圖7利用外周血單核淋巴細(xì)胞對CD20的活性檢測結(jié)果；

附圖8利用Fv區(qū)突變體對CD20的活性檢測結(jié)果。

具體實施方式

實施例1 CD20單鏈抗體基因重組植物表達(dá)載體的構(gòu)建

1、CD20單鏈抗體基因的獲得

人工合成CD20單鏈抗體基因，設(shè)計序列時將其優(yōu)化為植物偏好型密碼子，基因由生物公司合成，其堿基序列如SEQ ID NO.1所示。設(shè)計上游含Xmal酶切位點（CCCGGG）和下游含EcoRI的酶切位點（GAATTC）的引物。

上游引物CD20F： AATACCCGGGATGGCCCACGCCCGCGTCCTC

下游引物CD20R： AATAGAATTCTTATTTACCAGGTGACAATGA

以人工合成的基因為模板，采用上述引物對其進(jìn)行常規(guī)PCR擴增，獲得了全長為1482bp的目的基因，如圖1所示。

2、目的基因的克隆

采用常規(guī)重組克隆載體構(gòu)建技術(shù)，將上述目的基因的PCR產(chǎn)物與克隆載體pEASY-T1連接，構(gòu)建pEASY-T1-CD20，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，經(jīng)卡那霉素篩選陽性克隆子后，對其進(jìn)行菌體擴增培養(yǎng)。待菌液OD₆₀₀為0.6-0.8時，收獲菌液，試劑盒提取質(zhì)粒，采用PCR初步鑒定，如圖2所示，獲得了與預(yù)期大小相符的條帶。將該重組克隆質(zhì)粒送往上海生工生物工程公司測序，結(jié)果表明，成功獲得了優(yōu)化密碼子之后的CD20基因。

3、重組植物表達(dá)載體pBasta-LPH-CD20的構(gòu)建

采用Xmal和EcoRI限制性內(nèi)切酶，分別對pEASY-T1- CD20和pBasta進(jìn)行雙酶切，試劑盒回收CD20基因和pBasta載體大片段，采用T4 DNA連接酶對其進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，篩選陽性克隆子進(jìn)行增菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行Xmal和EcoRI雙酶切鑒定。如圖3所示，在預(yù)期大小位置可見條帶，表明成功構(gòu)建了重組植物表達(dá)載體pBasta-LPH-CD20。

實施例2 重組農(nóng)桿菌的獲得

采用常規(guī)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法，將實施例1所述的重組質(zhì)粒pBasta-LPH-CD20轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)中，過夜培養(yǎng)，挑取單菌落，進(jìn)行菌液PCR驗證，結(jié)果再預(yù)期位置可見清晰條帶，表明成功獲得了攜帶pBasta-LPH-CD20ab的重組農(nóng)桿菌。

實施例3 紅花懸浮細(xì)胞體系的建立

利用云紅一號紅花品種，葉片作為外植體，建立紅花的最佳懸浮細(xì)胞體系，種子培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基。最佳愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2mg/LNAA+0.5mg/L 6-BA（如圖5A所示），最佳愈傷繼代培養(yǎng)基為MS+1mg/L的NAA+0.5mg/L6-BA（如圖圖5B所示），最佳液體懸浮培養(yǎng)基為不加瓊脂粉的MS+1mg/L NAA+0.5mg/L6-BA+600mg/LCH（如圖5C所示）。每100mL 的三角瓶中加入液體懸浮培養(yǎng)基50mL, 搖床轉(zhuǎn)速為120r/min, 溫度為25℃, 黑暗培養(yǎng)。

實施例4 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CD20單鏈抗體的紅花懸浮細(xì)胞系

1、pBasta-LPH-CD20重組農(nóng)桿菌侵染

挑取攜帶pBasta-CD20的根癌農(nóng)桿菌單菌落接種于50 mL 含100 mg/ L Kan 的液體YEP培養(yǎng)基中, 28℃, 200 r/ min 恒溫振蕩培養(yǎng)過夜, 當(dāng)菌液OD 值為0.6-0.8 左右時收集菌液,待用。切下無菌苗的葉片投入到用上述YEP液體培養(yǎng)基重懸的菌液中,侵染10min, 倒去菌液后, 把外植體置于無菌濾紙上吸去多余菌液, 轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基（2mg/L NAA+ 0.5mg/ L6-BA的MS培養(yǎng)基）中, 于25℃黑暗條件下進(jìn)行共培養(yǎng)72小時。然后轉(zhuǎn)到2mg/L NAA+ 0.5mg/ L 6-BA+100 mg/L 頭孢霉素+100 mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基進(jìn)行抑菌培養(yǎng)20天，誘導(dǎo)分化出愈傷組織接種到1mg/L NAA+ 0.5mg/ L 6-BA+100 mg/L 頭孢霉素+100 mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)。獲得愈傷組織后進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng)，繼代三次后獲得懸浮細(xì)胞，將獲得的懸浮細(xì)胞進(jìn)行蛋白提取檢測。

2、SF-CD20重組蛋白的檢測

分別純化提取液體培養(yǎng)后的沉淀和上清蛋白，進(jìn)行常規(guī)Western blot檢測，如圖6所示，目的蛋白大小為53.33KDa，與預(yù)期蛋白分子量相符，表明成功在紅花懸浮細(xì)胞中表達(dá)了CD20單鏈抗體。

實施例5 活性檢測

1、利用外周血單核淋巴細(xì)胞進(jìn)行活性檢測

將紅花懸浮細(xì)胞表達(dá)CD20（命名為SF-CD20）和擬南芥種子系統(tǒng)表達(dá)CD20（命名為AR-CD20)進(jìn)行活性對比實驗?；钚詫嶒炌ㄟ^所表達(dá)的CD20ab對外周血單核淋巴細(xì)胞的作用來體現(xiàn)，具體操作如下：

1)以無酚紅 RPMI-1640 培養(yǎng)基將SF-CD20調(diào)整至 100 μg/mL、20 μg/mL、4 μg/mL、0.8 μg/mL、0.16μg/mL；

2) 每管加入 400 μL 調(diào)整好密度的 Daudi 細(xì)胞，4℃作用 30 min，離心收集，細(xì)胞后 PBS 洗 2 次，重懸于 400 μL 無酚紅 RPMI-1640 培養(yǎng)基中；

3) 設(shè)置效應(yīng)細(xì)胞+靶細(xì)胞自發(fā) LDH 釋放孔、靶細(xì)胞+靶細(xì)胞最大 LDH 釋放孔、培養(yǎng)基背景孔，將與抗體作用完畢后的細(xì)胞懸液加入至 96 孔板中，100 μL 每孔，每種情況均為 3 平行復(fù)孔；

4) 以 100 μL 每孔加入效應(yīng)細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中正常條件培養(yǎng) 6-18 h；

5) 1100 rpm，5 min 離心 96 孔板，吸取上清至一新的 96 孔板中，按照 CytoTox96 試劑盒指南配制顯色液，每孔 50 μL，避光室溫反應(yīng) 30 min；

6) 每孔加入 50 μL 反應(yīng)終止液，用注射器枕頭挑破氣泡，酶標(biāo)儀讀取 490 nm吸光值；

7) 根據(jù)試劑盒指南中的計算公式對細(xì)胞毒性百分比進(jìn)行計算。結(jié)果如圖7所示，利用紅花懸浮細(xì)胞表達(dá)的CD20抗體的活性高于利用擬南芥種子系統(tǒng)表達(dá)的抗體活性。

2、利用Fv區(qū)突變體進(jìn)行活性檢測

將CD20抗體序列的scFv區(qū)進(jìn)行突變，其堿基序列如SEQ ID NO.2所示，利用紅花懸浮系統(tǒng)表達(dá)，蛋白（命名為TK-CD20)活性測定方法同上。結(jié)果如圖8所示，利用紅花懸浮系統(tǒng)表達(dá)突變后的TK-CD20活性明顯高于原有序列的表達(dá)活性。

<110> 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 利用紅花懸浮細(xì)胞生產(chǎn)CD20抗體的方法

<160> 1

<210> 1

<211> 1482

<212> DNA

<213> 人工

<400> 1

atggcccacg cccgcgtcct cctcctggcg ctcgccgtcc tggccacggc cgccgtcgcc 60

gtcgcccaaa ttgttctctc ccagtctcca gcaatcctgt cagcttctcc tggagagaag 120

gtgactatga cttgcagggc ttcttcatct gtttcttaca tccactggtt ccagcagaag 180

cctggttctt cacctaagcc ttggatctac gctacatcta acttggcatc tggagtgcct 240

gtgaggttct ctggttctgg ttcaggtact tcttactctt tgacaatctc tagggtggag 300

gctgaggacg ctgctactta ctactgccag cagtggacat ctaaccctcc aacattcgga 360

ggtggtacta agttggagat caagggtgga ggtggatctg gaggaggagg atctggtgga 420

ggaggttctc aggtgcagtt gcaacagcct ggagctgagt tggtgaagcc tggtgcttct 480

gtgaagatgt cttgtaaggc ttctggatac acattcactt cttacaacat gcactgggtg 540

aagcagactc ctggtagggg tttggagtgg atcggagcta tctacccagg aaacggagac 600

acatcttaca accagaagtt caagggtaag gctacattga ctgctgacaa gtcttcatct 660

actgcttaca tgcaattgtc ttctttgaca tctgaggact ctgcagttta ctactgcgct 720

aggtctacat actacggagg tgactggtac ttcaacgtgt ggggagcagg taccacggtc 780

actgtctctg catctagaga caagactcac acttgccctc catgcccagc tccagagttg 840

ttgggaggac catctgtgtt ccttttccca ccaaagccaa aagacactct tatgatctct 900

aggactcctg aggtgacatg cgtggttgtg gatgtgtcac acgaggatcc tgaggtgaag 960

ttcaattggt acgtggacgg tgtggaggtg cataacgcaa agactaagcc aagggaggag 1020

cagtacaact caacttacag ggtggtgtct gtgcttacag tgcttcacca ggactggttg 1080

aatggtaagg aatacaaatg taaggtgtca aacaaggcat tgcctgcacc tatcgagaag 1140

actatttcaa aggcaaaggg tcaaccaagg gagcctcagg tgtacacttt gccaccttca 1200

agggaagaga tgactaagaa ccaagtttct ttgacttgct tggtgaaggg attctaccct 1260

tctgacatcg cagtggaatg ggagtctaac ggtcagccag aaaataacta caaaacaaca 1320

cctccagtgt tggactctga tggttctttc tttttgtatt caaagttgac tgtggacaag 1380

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<160> 1

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工

<400> 2

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gtcgcccaaa ttgttctctc ccagtctcca gcaatcctgt cagcttctcc tggagagaag 120

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