本發(fā)明涉及天然產(chǎn)物應(yīng)用領(lǐng)域，且特別涉及一種牡丹多糖及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

自由基，化學(xué)上也稱為“游離基”，是指化合物的分子在光熱等外界條件下，共價(jià)鍵發(fā)生均裂而形成的具有不成對(duì)電子的原子或基團(tuán)。自由基反應(yīng)在燃燒、氣體化學(xué)、聚合反應(yīng)、等離子體化學(xué)、生物化學(xué)和其他各種化學(xué)學(xué)科中扮演很重要的角色。外界環(huán)境中的陽光輻射、空氣污染、吸煙、農(nóng)藥等都會(huì)使人體產(chǎn)生更多活性氧自由基，使核酸突變，這是人類衰老和患病的根源。

體內(nèi)活性氧自由基具有一定的功能，如免疫和信號(hào)傳導(dǎo)過程。但過多的活性氧自由基就會(huì)有破壞作用，導(dǎo)致人體正常細(xì)胞和組織的損壞，從而引起多種疾病。如心臟病、老年癡呆癥、帕金森病和腫瘤。眾多醫(yī)學(xué)研究及臨床試驗(yàn)證明：人體細(xì)胞電子被搶奪是萬病之源，自由基ROS是一種缺乏電子的物質(zhì)(不飽和電子物質(zhì))，進(jìn)入人體后到處爭奪電子，如果奪去細(xì)胞蛋白分子的電子，使蛋白質(zhì)接上支鏈發(fā)生烷基化，形成畸變的分子而致癌。該畸變分子由于自己缺少電子，又要去奪取鄰近分子的電子，又使鄰近分子也發(fā)生畸變而致癌。這樣，惡性循環(huán)就會(huì)形成大量畸變的蛋白分子，基因突變形成大量癌細(xì)胞，最后出現(xiàn)癌癥。而當(dāng)自由基或畸變分子搶奪了基因的電子時(shí)，人就會(huì)直接得癌癥。人體得到負(fù)離子后，由于負(fù)離子帶負(fù)電有多余的電子，可提供大量電子，而阻斷惡性循環(huán)，癌細(xì)胞就可防止或被抑制。目前用于清除自由基的藥品種類較少且其中有些還具有副作用，因而從天然植物中尋找高效、副作用小的自由基抑制劑為目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)，又名鼠姑、木芍藥、洛陽花和富貴花，屬于小灌木芍藥科植物，主要生長在我國長江流域及黃河流域等地區(qū)，其富含多種營養(yǎng)成分自古以來皆用其根皮入藥，名曰“丹皮”?！缎氯A本草綱要》中記載牡丹性微寒，味苦辛，無毒，入心、肝、腎經(jīng)。具有清肝火、活血散瘀的功能。近來年，研究發(fā)現(xiàn)牡丹可用于治療斑疹吐血、臃腫瘡毒、陰虛發(fā)勢(shì)和無汗骨蒸等疾病。目前國內(nèi)外學(xué)者對(duì)牡丹的化學(xué)成分及其應(yīng)用研究取得了一定進(jìn)展，但還需要系統(tǒng)深入研究多糖類、黃酮類和多酚類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種牡丹多糖的制備方法，此制備方法操作簡單，易于實(shí)現(xiàn)，制得的多糖物質(zhì)含量較多且對(duì)自由基的清除作用較強(qiáng)。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種由上述制備方法制備而得的牡丹多糖，該多糖具有很好的自由基清除作用。其原料為天然產(chǎn)物，毒副作用小，可廣泛應(yīng)用于各種自由基清除劑中。

本發(fā)明的第三目的在于提供一種牡丹多糖的應(yīng)用，即將牡丹多糖作為活性成分應(yīng)用于自由基清除劑中。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明提出一種牡丹多糖的制備方法，其包括以下步驟：

粉碎牡丹原料至其粒徑為400-600μm，牡丹原料選自牡丹葉片或牡丹種皮；

然后對(duì)粉碎后的牡丹原料進(jìn)行提取分離并收集分離后的上清液得粗提物，提取分離按以下方式進(jìn)行：按料液比5-20g：80-400mL將提取劑與粉碎后的牡丹原料混合，提取30-100min，過濾收集上清液；提取劑為親水性有機(jī)溶液；

然后將粗提物與蛋白質(zhì)變性劑混合，于2-8℃的條件下靜置12-48h，離心，收集離心后的上清液得粗多糖溶液；

然后向粗多糖溶液中加入無水乙醇溶液得待濃縮液，濃縮后得牡丹多糖。

本發(fā)明還提出一種由上述制備方法制備所得的多糖物質(zhì)。

本發(fā)明還提出了一種牡丹多糖在制備自由基清除劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明實(shí)施例的一種牡丹多糖及其制備方法和應(yīng)用的有益效果是：通過對(duì)牡丹進(jìn)行粉碎，增加了原料與提取劑之間的接觸面積，提高浸出速度。以親水性有機(jī)溶劑為提取劑，既能保證浸出速度快、浸出物的純度高、雜質(zhì)少，而且還能降低成本。5-20g：80-400mL的料液比可使牡丹中的活性成分提取效果較佳；提取時(shí)間選為30-100min，避免因提取時(shí)間過短造成有效物質(zhì)溶出率低，提取時(shí)間過長又會(huì)使得植物細(xì)胞中的油脂、鞣質(zhì)等雜質(zhì)過多的溶出，增大分離純化的難度等缺陷。將粗提物與蛋白質(zhì)變性劑混合可使粗提物中的蛋白質(zhì)變性，2-8℃條件下靜置可使蛋白質(zhì)充分變性沉淀，使牡丹多糖的分離效果和提取率達(dá)到最佳。該方法操作簡單，易于實(shí)現(xiàn)，制備出的牡丹多糖具有很好的自由基清除作用。由于該發(fā)明的原料為天然產(chǎn)物，毒副作用小，故由其制備出的多糖物質(zhì)可廣泛應(yīng)用于各種自由基清除劑中。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的牡丹多糖及其制備方法和應(yīng)用進(jìn)行具體說明。

本發(fā)明實(shí)施例提供的牡丹多糖的制備方法，以我國特有的牡丹為原料，其花瓣大而香、顏色鮮艷，有“國色天香”的譽(yù)稱，代表著華貴與端莊。具體的，本發(fā)明實(shí)施例中的牡丹例如可選取銅陵鳳凰山的“鳳丹”葉片或種皮中的一種為原料，也可同時(shí)將葉片和種皮共同作為原料。制備過程中，可先對(duì)原料進(jìn)行粉碎，以增加原料與提取劑之間的接觸面積，提高浸出速度。其中，葉片和種皮的粉碎粒度例如可以為400-600μm，優(yōu)選的，葉片和種皮的粉碎粒度例如還可以為420-580μm，該粒度范圍內(nèi)牡丹的葉片或種皮中的有效成分溶出率較大。原料優(yōu)選采自盛花期的新鮮牡丹，此時(shí)期的牡丹中的有效成分含量最高，有利于提高后續(xù)提取物中的有效成分的含量。

作為優(yōu)選的，在粉碎步驟之前，還可以對(duì)牡丹進(jìn)行除雜、清洗和干燥等工序。其中除雜和清洗可避免其它雜質(zhì)對(duì)制備效果的干擾，干燥可部分破壞原料的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，利于提取。其中，干燥溫度例如可以選擇為20-45℃，優(yōu)選為35-37℃。在此優(yōu)選的溫度范圍內(nèi)，原料中的活性成分可最大程度的保留并不被高溫破壞。

較佳的，本發(fā)明實(shí)施例采用浸提法，以親水性有機(jī)溶劑作為提取劑對(duì)粉碎后的原料進(jìn)行提取。利用相似相溶原則，該親水性有機(jī)溶劑例如可優(yōu)選為乙醇的水溶液，既能保證浸出速度快、浸出物的純度高、雜質(zhì)少，而且成本低。當(dāng)選用無水乙醇-水溶液作為提取劑時(shí)，無水乙醇的體積分?jǐn)?shù)例如可以為70％-90％，優(yōu)選為80％，此體積分?jǐn)?shù)下無水乙醇溶液的極性適中，使得牡丹中的絕大部分有效成分易溶于該溶液中，提取較快且雜質(zhì)較少。此外，還可選用甲醇-水溶液等。

將提取劑與粉碎后的牡丹原料以料液比例如為5-20g：80-400mL混合，得到待提物。作為優(yōu)選的，料液比例如可以為10g：100mL，在此比例下，牡丹中的活性成分提取效果最佳。

進(jìn)一步的，將待提物進(jìn)行第一次提取。作為優(yōu)選的，本發(fā)明實(shí)施例中的第一次提取采用水浴浸提，浸提的溫度例如可以為60-85℃，浸提的時(shí)間優(yōu)選為30-100min，得第一提取物。因提取時(shí)間過短或提取溫度過低會(huì)造成有效物質(zhì)溶出率低，提取時(shí)間過長或提取溫度過高又會(huì)使得植物細(xì)胞中的油脂、鞣質(zhì)等雜質(zhì)過多的溶出，增大分離純化的難度，故提取時(shí)間優(yōu)選為40min，提取溫度優(yōu)選為80℃。

此外，提取方式還可以采用微波提取、超聲波提取、超臨界流體提取等。

將第一提取物進(jìn)行第一次過濾，例如可以為離心過濾，收集分離后的上清液，得第一分離物。該離心過濾所用的離心設(shè)備的轉(zhuǎn)速例如可設(shè)置為3000-5000r/min，離心過濾的時(shí)間例如可以為10-35min。作為優(yōu)選的，本發(fā)明實(shí)施例的第一提取物于4000r/min的條件下離心20min，此條件下，離心效果最佳。

為了降低原料中多糖的損失率，還可將第一次過濾后所剩的沉淀進(jìn)行第二次提取，例如可將第一次過濾后所得的沉淀與上述提取劑再次按料液比5-20g：80-400mL混合，于60-85℃條件下第二次水浴浸提30-100min，得到第二提取物并于3000-5000r/min的離心條件下第二次過濾10-35min，收集上清液得第二分離物。其中，第二次過濾也優(yōu)選于4000r/min的條件下離心20min。此外，根據(jù)實(shí)際操作情況，還可在第二次提取的基礎(chǔ)上繼續(xù)進(jìn)行多次提取分離。

收集分離后所得的上清液作為粗提物，將該粗提物與蛋白質(zhì)變性劑混合，其中，蛋白質(zhì)變性劑例如可選用三氯乙酸溶液，粗提物與三氯乙酸溶液例如可以按投料體積比為1mL:6-20mL混合，優(yōu)選為1mL:12mL。其中，三氯乙酸溶液中的三氯乙酸的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)例如可以為6-15％，優(yōu)選為10％，該條件下三氯乙酸更易使蛋白質(zhì)變性并形成不溶性物質(zhì)。此外，本發(fā)明實(shí)施例中的蛋白質(zhì)變性劑還以選用尿素、鹽酸胍等物質(zhì)。

將混合后的粗提物和蛋白質(zhì)變性劑于2-8℃的條件下靜置12-48h，優(yōu)選于4℃的冰箱中冷藏靜置24h后離心以去除蛋白質(zhì)部分，收集上清液得粗多糖溶液。其中，本發(fā)明實(shí)施例所采用的離心時(shí)間例如可以為15-30min，離心轉(zhuǎn)速例如可以為3000-5000r/min。優(yōu)選的，該離心時(shí)間為10min且離心轉(zhuǎn)速為4000r/min，此離心條件下能使蛋白質(zhì)成分完全沉淀。

去除離心后的蛋白質(zhì)沉淀，并于粗多糖溶液中加入無水乙醇水溶液得待濃縮液，優(yōu)選的，該待濃縮液中所含的無水乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)大于等于80％，以利于多糖物質(zhì)的溶解和濃縮。

較佳的，例如可將上述的待濃縮液濃縮至其含水率小于或等于10％，得到牡丹多糖。作為優(yōu)選的，本發(fā)明實(shí)施例中例如可以將待濃縮液于45-55℃的水浴、轉(zhuǎn)速為30-50轉(zhuǎn)/min、以及真空度為0.07-0.09MPa的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去有機(jī)相中的乙醇，得到浸膏狀的牡丹多糖，該條件下進(jìn)行的減壓濃縮，有利于在回收溶劑時(shí)避免牡丹中活性成分的結(jié)構(gòu)受到破壞。

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

實(shí)施例1

將新鮮鳳丹的葉片和種皮分別粉碎至粒度為400μm和420μm，以甲醇-水溶液為提取劑，其中甲醇的體積百分?jǐn)?shù)為80％。按料液比5g：80mL將提取劑與粉碎后的葉片和種皮混合，得到待提物。于60℃的條件下水浴浸提100min，得到第一提取物。將該第一提取物于3000r/min的條件離心35min，收集離心后的上清液得第一分離物。將第一分離物與質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為6％的三氯乙酸溶液以投料體積比為1mL:6mL混合，于2℃的冰箱中冷藏靜置48h后，于3000r/min的離心條件下離心30min，去除蛋白質(zhì)部分，收集此次離心后的上清液得粗多糖溶液。向粗多糖溶液中加入無水乙醇得待濃縮液并使待濃縮液中的無水乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為80％，將該待濃縮液于45℃的水浴、50轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速以及0.07MPa的真空度條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至其含水率為10％，得到牡丹多糖。本實(shí)施例中1ul粗多糖溶液中含有0.085ug的牡丹多糖。

實(shí)施例2

將新鮮鳳丹的葉片和種皮進(jìn)行除雜、清洗，于20℃下烘干并分別粉碎至粒度為600μm和580μm，以無水乙醇-水溶液為提取劑，其中無水乙醇的體積百分?jǐn)?shù)為70％。按料液比5g：400mL將提取劑與粉碎后的葉片混合，得到待提物。于85℃的條件下水浴浸提30min，得到第一提取物。將該第一提取物于5000r/min的條件離心10min，收集上清液得第一分離物。將離心后所剩的沉淀與無水乙醇-水溶液按料液比5g：400mL混合，并于85℃的條件下第二次水浴浸提30min，得到第二提取物。將該第二提取物于5000r/min的條件離心10min，收集上清液得第二分離物。將第一分離物和第二分離物合并，并以投料體積比為1mL:20mL與質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為15％的三氯乙酸溶液混合，于8℃的冰箱中冷藏靜置12h后，于5000r/min的離心條件下離心15min，去除蛋白質(zhì)部分，收集此次離心后的上清液得粗多糖溶液。向粗多糖溶液中加入無水乙醇得待濃縮液并使待濃縮液中的無水乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為90％，將該待濃縮液于55℃的水浴、30轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速以及0.08MPa的真空度條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至其含水率為8％，得到牡丹多糖。本實(shí)施例中1ul粗多糖溶液中含有0.056ug的牡丹多糖。

實(shí)施例3

將新鮮鳳丹的葉片和種皮進(jìn)行除雜、清洗，于45℃下烘干并粉碎至粒度為420μm和600μm，以無水乙醇-水溶液為提取劑，其中無水乙醇的體積百分?jǐn)?shù)為90％。按料液比20g：80mL將提取劑與粉碎后種皮混合，得到待提物。于72℃的條件下水浴浸提65min，得到第一提取物。將該第一提取物于4000r/min的條件離心22.5min，收集上清液得第一分離物。將離心后所剩的沉淀與無水乙醇-水溶液按料液比20g：80mL混合，并于72℃的條件下第二次水浴浸提65min，得到第二提取物。將該第二提取物于4000r/min的條件離心22.5min，收集上清液得第二分離物。將第一分離物和第二分離物合并，并以投料體積比為1mL:13mL與質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為10.5％的三氯乙酸溶液混合，于5℃的冰箱中冷藏靜置30h后，于4000r/min的離心條件下離心22.5min，去除蛋白質(zhì)部分，收集此次離心后的上清液得粗多糖溶液。向粗多糖溶液中加入無水乙醇得待濃縮液并使待濃縮液中的無水乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為85％，將該待濃縮液于50℃的水浴、40轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速以及0.09MPa的真空度條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至其含水率為6％，得到牡丹多糖。本實(shí)施例中1ul粗多糖溶液中含有0.025ug的牡丹多糖。

實(shí)施例4

將新鮮鳳丹的葉片和種皮進(jìn)行除雜、清洗，于37℃下烘干并粉碎至粒度為580μm和400μm，以無水乙醇-水溶液為提取劑，其中無水乙醇的體積百分?jǐn)?shù)為80％。按料液比20g：400mL將提取劑與粉碎后的葉片和種皮混合，得到待提物。于80℃的條件下水浴浸提40min，得到第一提取物。將該第一提取物于4000r/min的條件離心20min，收集上清液得第一分離物。將離心后所剩的沉淀與無水乙醇-水溶液按料液比20g：400mL混合，并于80℃的條件下第二次水浴浸提40min，得到第二提取物。將該第二提取物于4000r/min的條件離心20min，收集上清液得第二分離物。將第一分離物和第二分離物合并，并以投料體積比為1mL:12mL與質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為10％的三氯乙酸溶液混合，于4℃的冰箱中冷藏靜置24h后，于4000r/min的離心條件下離心10min，去除蛋白質(zhì)部分，收集此次離心后的上清液得粗多糖溶液。向粗多糖溶液中加入無水乙醇得待濃縮液并使待濃縮液中的無水乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為95％，將該待濃縮液于55℃的水浴、40轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速以及0.09MPa的真空度條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至其含水率為4％，得到牡丹多糖。本實(shí)施例中1ul粗多糖溶液中含有0.078ug的牡丹多糖。

實(shí)施例5

將新鮮鳳丹進(jìn)行除雜、清洗，于35℃下烘干并將其葉片和種皮均粉碎至粒度為500μm，以無水乙醇-水溶液為提取劑，其中無水乙醇的體積百分?jǐn)?shù)為80％。按料液比10g：100mL將提取劑與粉碎后的葉片和種皮混合，得到待提物。于80℃的條件下水浴浸提40min，得到第一提取物。將該第一提取物于4000r/min的條件離心20min，收集上清液得第一分離物。將離心后所剩的沉淀與無水乙醇-水溶液按料液比10g：100mL混合，并于80℃的條件下第二次水浴浸提40min，得到第二提取物。將該第二提取物于4000r/min的條件離心20min，收集上清液得第二分離物。將第一分離物和第二分離物合并，并以投料體積比為1mL:12mL與質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為10％的三氯乙酸溶液混合，于4℃的冰箱中冷藏靜置24h后，于4000r/min的離心條件下離心10min，去除蛋白質(zhì)部分，收集此次離心后的上清液得粗多糖溶液。向粗多糖溶液中加入無水乙醇得待濃縮液并使待濃縮液中的無水乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為90％，將該待濃縮液于50℃的水浴、40轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速以及0.09MPa的真空度條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至其含水率為2％，得到牡丹多糖。本實(shí)施例中1ul粗多糖溶液中含有0.091ug的牡丹多糖。

實(shí)施例6

將新鮮鳳丹進(jìn)行除雜、清洗，于32.5℃下烘干并將其葉片和種皮均粉碎至粒度為500μm，以甲醇-水溶液為提取劑，其中甲醇的體積百分?jǐn)?shù)為80％。按料液比10g：100mL將提取劑與粉碎后的葉片和種皮混合，得到待提物。于80℃的條件下水浴浸提40min，得到第一提取物。將該第一提取物于4000r/min的條件離心20min，收集上清液得第一分離物。將離心后所剩的沉淀與甲醇-水溶液按料液比10g：100mL混合，并于80℃的條件下第二次水浴浸提40min，得到第二提取物。將該第二提取物于4000r/min的條件離心20min，收集上清液得第二分離物。將第一分離物和第二分離物合并，并以投料體積比為1mL:12mL與尿素溶液混合，于4℃的冰箱中冷藏靜置24h后，于4000r/min的離心條件下離心10min，去除蛋白質(zhì)部分，收集此次離心后的上清液得粗多糖溶液。向粗多糖溶液中加入無水乙醇得待濃縮液并使待濃縮液中的無水乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為90％，將該待濃縮液于50℃的水浴、40轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速以及0.09MPa的真空度條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至其含水率為9％，得到牡丹多糖。本實(shí)施例中1ul粗多糖溶液中含有0.083ug的牡丹多糖。

實(shí)施例7

將新鮮牡丹進(jìn)行除雜、清洗，于36℃下烘干并將其葉片粉碎至粒度為500μm，以甲醇-水溶液為提取劑，其中甲醇的體積百分?jǐn)?shù)為80％。按料液比10g：100mL將提取劑與粉碎后的葉片混合，得到待提物。于80℃的條件下水浴浸提40min，得到第一提取物。將該第一提取物于4000r/min的條件離心20min，收集上清液得第一分離物。將離心后所剩的沉淀與甲醇-水溶液按料液比5g：80mL混合，并于60℃的條件下第二次水浴浸提100min，得到第二提取物。將該第二提取物于3000r/min的條件離心35min，收集此次離心后的上清液得第二分離物。將第一分離物和第二分離物合并，并以投料體積比為1mL:12mL與鹽酸胍溶液混合，于4℃的冰箱中冷藏靜置24h后，于4000r/min的離心條件下離心10min，去除蛋白質(zhì)部分，收集上清液得粗多糖溶液。向粗多糖溶液中加入無水乙醇得待濃縮液并使待濃縮液中的無水乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為90％，將該待濃縮液于50℃的水浴、40轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速以及0.09MPa的真空度條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至其含水率為7％，得到牡丹多糖。本實(shí)施例中1ul粗多糖溶液中含有0.053ug的牡丹多糖。

實(shí)施例8

將新鮮牡丹進(jìn)行除雜、清洗，于36℃下烘干并將其種皮粉碎至粒度為500μm，采用微波提取得到第一提取物。將該第一提取物于4000r/min的條件離心20min，收集上清液得第一分離物。將離心后所剩的沉淀再次微波提取后得到第二提取物。將該第二提取物于4000r/min的條件離心20min，收集上清液得第二分離物。將第一分離物和第二分離物合并，并以投料體積比為1mL:12mL與鹽酸胍溶液混合，于4℃的冰箱中冷藏靜置24h后，于4000r/min的離心條件下離心10min，去除蛋白質(zhì)部分，收集此次離心后的上清液得粗多糖溶液。向粗多糖溶液中加入無水乙醇得待濃縮液并使待濃縮液中的無水乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為90％，將該待濃縮液于50℃的水浴、40轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速以及0.09MPa的真空度條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至其含水率為5％，得到牡丹多糖。本實(shí)施例中1ul粗多糖溶液中含有0.033ug的牡丹多糖。

實(shí)施例9

將新鮮牡丹進(jìn)行除雜、清洗，于36℃下烘干并將其葉片和種皮均粉碎至粒度為500μm，采用超聲波提取得到第一提取物。將該第一提取物于4000r/min的條件離心20min，收集上清液得第一分離物。將離心后所剩的沉淀再次超聲波提取后得到第二提取物。將該第二提取物于4000r/min的條件離心20min，收集上清液得第二分離物。將第一分離物和第二分離物合并，并以投料體積比為1mL:12mL與鹽酸胍溶液混合，于4℃的冰箱中冷藏靜置24h后，于4000r/min的離心條件下離心10min，去除蛋白質(zhì)部分，收集此次離心后的上清液得粗多糖溶液。向粗多糖溶液中加入無水乙醇得待濃縮液并使待濃縮液中的無水乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為90％，將該待濃縮液于50℃的水浴、40轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速以及0.09MPa的真空度條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至其含水率為3％，得到牡丹多糖。本實(shí)施例中1ul粗多糖溶液中含有0.077ug的牡丹多糖。

實(shí)施例10

將新鮮牡丹進(jìn)行除雜、清洗，于36℃下烘干并將其葉片和種皮均粉碎至粒度為500μm，采用超臨界流體提取得到第一提取物。將該第一提取物于4000r/min的條件離心20min，收集上清液得第一分離物。將離心后所剩的沉淀再次超臨界流體提取后得到第二提取物。將該第二提取物于4000r/min的條件離心20min，收集上清液得第二分離物。將第二提取物離心后所剩的沉淀進(jìn)行第三次超臨界流體提取后得到第三提取物。將該第三提取物于4000r/min的條件離心20min，收集上清液得第三分離物，將第一分離物、第二分離物和第三分離物合并，并以投料體積比為1mL:12mL與鹽酸胍溶液混合，于4℃的冰箱中冷藏靜置24h后，于4000r/min的離心條件下離心10min，去除蛋白質(zhì)部分，收集此次離心后的上清液得粗多糖溶液。向粗多糖溶液中加入無水乙醇得待濃縮液并使待濃縮液中的無水乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為90％，將該待濃縮液于50℃的水浴、40轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速以及0.09MPa的真空度條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至其含水率為1％，得到牡丹多糖。本實(shí)施例中1ul粗多糖溶液中含有0.081ug的牡丹多糖。

試驗(yàn)例1

采用如下的自由基清除作用試驗(yàn)方法，對(duì)實(shí)施例中所得的牡丹多糖物質(zhì)進(jìn)行清除率測(cè)試。

測(cè)試方法：重復(fù)以上實(shí)施例1-10以制得足夠多的牡丹葉片多糖、牡丹種皮多糖以及牡丹葉片與種皮混合多糖作為試驗(yàn)組，以市售多糖作為對(duì)照組，分別配置成不同濃度的多糖溶液作為待測(cè)液，其濃度依次為0.025ug/ul、0.05ug/ul、0.075ug/ul、0.1ug/ul和0.125ug/ul。

測(cè)定待測(cè)物對(duì)自由基清除作用的反應(yīng)溶液包括：待測(cè)液、0.2M且pH為7.4的磷酸緩沖液、7.5mmol/LFeSO₄、超純水、5.0mmol/L鄰二氮菲溶液和0.1％過氧化氫溶液。反應(yīng)共需空白管、未損傷管、損傷管、樣品空白管和加樣管共計(jì)5個(gè)反應(yīng)體系。其中，空白管中加入2mL濃度為0.2mol/L且pH為7.4的磷酸緩沖液和8mL超純水；未損傷管加入2mL濃度為0.2mol/L且pH為7.4的磷酸緩沖液、2mL的7.5mmol/L的FeSO₄、5.4mL的超純水和1.6mL的鄰二氮菲溶液；損傷管中加入2mL濃度為0.2mol/L且pH為7.4的磷酸緩沖液、1mL的7.5mmol/L的FeSO₄、4.4mL的超純水、1.6mL的鄰二氮菲溶液和1mL的過氧化氫溶液；樣品空白管中加入2mL濃度為0.2mol/L且pH為7.4的磷酸緩沖液、7mL超純水和1mL各濃度的多糖待測(cè)溶液；加樣管中加入2mL濃度為0.2mol/L且pH為7.4的磷酸緩沖液、1mL的7.5mmol/LFeSO₄、3.4mL超純水、1.6mL鄰二氮菲溶液、1mL過氧化氫溶液和1mL各濃度的多糖待測(cè)溶液。把加入試劑后的各個(gè)試管在40℃的恒溫水浴中放置1h，分別以樣品空白管和空白管作為對(duì)照管置零，在536nm波長處測(cè)出損傷管、未損傷管和不同濃度牡丹多糖待測(cè)物以及市售多糖加樣管的吸光度數(shù)值，計(jì)算牡丹多糖以及市售多糖對(duì)羥基自由基的清除率。計(jì)算公式如下：

羥基自由基清除率(％)＝[(A₃-A₂)/(A₁-A₂)]×100％。

其中：A₁、A₂分別為未損傷和損傷管的吸光度值；A₃為不同濃度牡丹多糖以及市售多糖加樣管的吸光度值。

測(cè)試結(jié)果如下：在實(shí)施例1-10中，實(shí)施例5所制備出的牡丹多糖對(duì)自由基清除作用最強(qiáng)，其原因在于該實(shí)施例以牡丹種皮和葉片共同作為原料，其制備過程中所采用的工藝條件均為最優(yōu)值。此外，濃度分別為0.025ug/ul、0.05ug/ul、0.075ug/ul、0.1ug/ul和0.125ug/ul時(shí)，牡丹葉片多糖、牡丹種皮多糖和牡丹葉片與種皮混合多糖的對(duì)應(yīng)的羥基自由基清除率如表1所示：

表1不同濃度下牡丹多糖的羥基自由基清除率

由表1可看出，在同一濃度條件下，牡丹種皮多糖、牡丹葉片多糖以及牡丹葉片與種皮混合多糖對(duì)羥基自由基的清除作用依次增強(qiáng)；該三種多糖清除羥自由基的能力均隨多糖濃度的增加而加強(qiáng)，且呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。另外，從測(cè)試結(jié)果還可以得出牡丹葉片多糖以及牡丹葉片與種皮混合多糖均顯著高于市售多糖的自由基清除效果，故本發(fā)明實(shí)施例所制備出的牡丹多糖具有較強(qiáng)的自由基清除效果。

因此，利用牡丹多糖對(duì)自由基的清除作用，可以將牡丹多糖應(yīng)用于制備自由基清除劑。并且作為優(yōu)選，牡丹多糖可以采用上述的牡丹多糖制備方法制備而得。此外，該多糖物質(zhì)來自天然植物，毒副作用小，還可將其用于各種保健品中，例如可清除自由基類的保健食品中。

綜上所述，本發(fā)明實(shí)施例通過對(duì)牡丹進(jìn)行粉碎，增加了原料與提取劑之間的接觸面積，提高浸出速度。以親水性有機(jī)溶劑為提取劑，既能保證浸出速度快、浸出物的純度高、雜質(zhì)少，而且還能降低成本。以5-20g：80-400mL作為料液比可使牡丹中的活性成分提取效果較佳；采用于60-85℃水浴浸提30-100min的方式，可避免因提取時(shí)間過短造成有效物質(zhì)溶出率低，提取時(shí)間過長又會(huì)使得植物細(xì)胞中的油脂、鞣質(zhì)等雜質(zhì)過多的溶出，增大分離純化的難度等缺陷。將粗提物與蛋白質(zhì)變性劑中的三氯乙酸溶液混合可使粗提物中的蛋白質(zhì)變性，2-8℃條件下靜置能使蛋白質(zhì)充分變性沉淀，使牡丹多糖的分離效果和提取率達(dá)到最佳。該方法操作簡單，易于實(shí)現(xiàn)，制備出的牡丹多糖具有很好的自由基清除作用。由于該發(fā)明的原料為天然產(chǎn)物，毒副作用小，故由其制備出的多糖物質(zhì)可廣泛應(yīng)用于各種自由基清除劑中。

以上所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。本發(fā)明的實(shí)施例的詳細(xì)描述并非旨在限制要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。