本發(fā)明涉及細胞領域，特別涉及培養(yǎng)基及其應用。
背景技術：
：間充質干細胞是一類存在于多種組織(如骨髓、臍帶血和臍帶組織、胎盤組織、脂肪組織等)，具有多向分化潛力，非造血干細胞的成體干細胞。這類干細胞具有向多種間充質系列細胞(如成骨、成軟骨及成脂肪細胞等)或非間充質系列細胞分化的潛能，并具有獨特的細胞因子分泌功能。許多臨床應用已經證實，間充質干細胞能解決多種血液系統(tǒng)疾病，心血管疾病，肝硬化，神經系統(tǒng)疾病，膝關節(jié)半月板部分切除損傷修復，自身免疫性疾病等方面取得了重大突破，挽救了更多病患的生命。許多的研究也證實，間充質干細胞分泌的營養(yǎng)物質也具有與間充質干細胞相似的作用，現在，越來越多的學者相信，間充質干細胞分泌的營養(yǎng)物質或許比細胞本身的作用更加重要。MSCs能分泌包括血管內皮生長因子(vEGF)、胎盤生長因子(PGF)、成纖維細胞生長因子(FGFs)、血小板源生長因子(PDGF)、轉化生長因子(TGF-β)、肝細胞生長因子(HGF)等在內的各種生長因子，這些生長因子可參與多種細胞反應。而穩(wěn)定可靠的培養(yǎng)條件下收集的條件培養(yǎng)基是取得細胞分泌的營養(yǎng)物質的有效手段。條件培養(yǎng)制備的方法有很多，方法一，如去掉培養(yǎng)用培養(yǎng)基后，條件無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)后收集條件培養(yǎng)基；方法二，直接收集培養(yǎng)后含血清或血清替代物的條件培養(yǎng)基，含有間充質干細胞的條件培養(yǎng)基的角膜內皮細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基等。但牛血清成分復雜，來源不穩(wěn)定，使得條件培養(yǎng)基的質量不可控制且存在潛在威脅。技術實現要素：有鑒于此，本發(fā)明提供了培養(yǎng)基及其應用。培養(yǎng)基使用DMEMF12+非必需氨基酸，營養(yǎng)更佳豐富，為細胞合成各種活性蛋白提供更豐富廣泛的來源，提高了蛋白獲得量。使用該培養(yǎng)基培養(yǎng)間充質干細胞收集得到的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)間充質干細胞，細胞數量和活性顯著提高。為了實現上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案：本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)基，包括基礎培養(yǎng)基和非必需氨基酸。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述培養(yǎng)基中所述非必需氨基酸選自甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-絲氨酸。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述培養(yǎng)基中所述基礎培養(yǎng)基為DMEMF12。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述培養(yǎng)基中所述非必需氨基酸在所述基礎培養(yǎng)基中的濃度為0.05～0.2mM。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述培養(yǎng)基中所述培養(yǎng)基的使用劑量為：每2.5×104個細胞使用所述培養(yǎng)基0.1～0.2mL。本發(fā)明還提供了所述培養(yǎng)基在培養(yǎng)間充質干細胞中的應用。本發(fā)明還提供了所述培養(yǎng)基在培養(yǎng)間充質干細胞收集條件培養(yǎng)基中的應用。本發(fā)明還提供了一種間充質干細胞條件培養(yǎng)基的制備方法，取間充質干細胞初步培養(yǎng)后，與本發(fā)明提供的所述培養(yǎng)基混合后繼續(xù)培養(yǎng)，收集培養(yǎng)上清。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述制備方法中所述初步培養(yǎng)為取P1～P5代的間充質干細胞(不限來源，包括脂肪、臍帶、牙髓、羊膜等)，使用DMEMF12+10％FBS+0.05～0.1mMNEAA培養(yǎng)，當細胞處于指數生長期，匯合度達到70～90％，去培養(yǎng)上清，用PBS洗滌。本發(fā)明還提供了所述制備方法制得的間充質干細胞條件培養(yǎng)基。本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)基，包括基礎培養(yǎng)基和非必需氨基酸。該培養(yǎng)基使用DMEMF12+非必需氨基酸，營養(yǎng)更佳豐富，為細胞合成各種活性蛋白提供更豐富廣泛的來源，提高了蛋白獲得量。使用該培養(yǎng)基培養(yǎng)間充質干細胞收集得到的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)間充質干細胞，細胞數量和活性顯著提高。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。圖1示細胞增殖情況。具體實施方式本發(fā)明公開了培養(yǎng)基及其應用，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發(fā)明技術。1、取P1～P5代的間充質干細胞(不限來源，包括脂肪、臍帶、牙髓、羊膜等)，使用DMEMF12+10％FBS+0.05～0.1mMNEAA培養(yǎng)，當細胞處于指數生長期，匯合度達到70～90％，去培養(yǎng)上清，用PBS洗兩遍后，加入0.1～0.2ml/cm2(cm2為培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板的底面積，約2.5×104個細胞)的DMEMF12+0.05～0.2mMNEAA靜置培養(yǎng)24h后，收集條件培養(yǎng)基；再加入0.1～0.2ml/cm2(cm2為培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板的底面積，約2.5×104個細胞)的DMEMF12+0.05～0.2mMNEAA繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集條件培養(yǎng)基；再加入0.1～0.2ml/cm2(cm2為培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板的底面積，約2.5×104個細胞)的DMEMF12+0.05～0.2mMNEAA繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集最后一次條件培養(yǎng)基。把三天收集的條件培養(yǎng)合并。第一次為細胞培養(yǎng)基，是為了細胞增殖；后續(xù)三次是無血清的的細胞培養(yǎng)基，是為了收集條件培養(yǎng)基。2、收集到的條件培養(yǎng)基200～400g離心5～10min，取上清，過0.22μm濾膜。3、3KD濾膜包超濾濃縮至1/5到1/20原體積，所得即為制備所得的條件培養(yǎng)基。本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)基，包括基礎培養(yǎng)基和非必需氨基酸。該培養(yǎng)基使用DMEMF12+非必需氨基酸，營養(yǎng)更佳豐富，為細胞合成各種活性蛋白提供更豐富廣泛的來源，提高了蛋白獲得量。使用該培養(yǎng)基培養(yǎng)間充質干細胞收集得到的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)間充質干細胞，細胞數量和活性顯著提高。本發(fā)明提供的培養(yǎng)基及其應用中所用原料及試劑均可由市場購得。市售的DMEMF12培養(yǎng)基(GIBCO貨號：12400-024)；NEAA(GIBCO貨號：11140-050)成分如下：(單位mM，濃度均為0.05～0.2mM)；包括Glycine；L-Alanine；L-Asparagine；L-Asparticacid；L-GlutamicAcid；L-Proline；L-Serine。下面結合實施例，進一步闡述本發(fā)明：實施例11、取P1代的脂肪間充質干細胞(使用DMEMF12+10％FBS+NEAA培養(yǎng)，當細胞處于指數生長期，匯合度達到80％，去培養(yǎng)上清，用PBS洗兩遍后；加入0.1ml/cm2的DMEMF12+0.1mMNEAA靜置培養(yǎng)24h后，收集條件培養(yǎng)基；再加入0.1ml/cm2DMEMF12+0.1mMNEAA繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集條件培養(yǎng)基；再加入0.1ml/cm2DMEMF12+0.1mMNEAA繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集最后一次條件培養(yǎng)基。把三天收集的條件培養(yǎng)合并。2、收集到的條件培養(yǎng)基200g離心5min，取上清，過0.22μm濾膜。3、3KD濾膜包超濾濃縮至1/5原體積，所得即為制備所得的條件培養(yǎng)基。對比例1、取P1代的脂肪間充質干細胞(使用DMEMF12+10％FBS+NEAA培養(yǎng)，當細胞處于指數生長期，匯合度達到80％，去培養(yǎng)上清，用PBS洗兩遍后；加入0.1ml/cm2的DMEM靜置培養(yǎng)24h后，收集條件培養(yǎng)基；再加入0.1ml/cm2DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集條件培養(yǎng)基；再加入0.1ml/cm2DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集最后一次條件培養(yǎng)基。把三天收集的條件培養(yǎng)合并。2、收集到的條件培養(yǎng)基200g離心5min，取上清，過0.22μm濾膜。3、3KD濾膜包超濾濃縮至1/5原體積，所得即為制備所得的條件培養(yǎng)基。實施例3使用bradford法檢測獲得的總蛋白量，結果如表1所示：(單位：μg/ml)表1單位：μg/ml123實施例1115123120對比例766981結果可見，發(fā)明組(實施例1制得的條件培養(yǎng)基)獲得的蛋白量明顯高于對比組(對比例)，P<0.01。使用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)P15代的脂肪間充質干細胞，檢測其增殖情況：陰性對照：DMEMF12+10％FBS+0.1mMNEAA對照組：DMEMF12+10％FBS+0.1mMNEAA+20％對照組(對比例)條件培養(yǎng)基發(fā)明組：DMEMF12+10％FBS+0.1mMNEAA+20％發(fā)明組(實施例1)條件培養(yǎng)基，每組設三個重復，連續(xù)培養(yǎng)7天，結果如表2所示：表2由圖1、表2可看出，細胞培養(yǎng)至第五天后，進入平臺期，細胞增殖緩慢，但發(fā)明組在連續(xù)7天后，細胞數量明顯高于其余兩組，即發(fā)明組對P15代細胞的促進作用強于對照組及陰性對照組(P<0.05)，證明發(fā)明組不但蛋白含量高于對照組，活性也高于對照組。實施例41、取P3代的臍帶間充質干細胞，使用DMEMF12+10％FBS+0.1mMNEAA培養(yǎng)，當細胞處于指數生長期，匯合度達到70％，去培養(yǎng)上清，用PBS洗兩遍后，加入0.2ml/cm2的DMEMF12+0.05mMNEAA靜置培養(yǎng)24h后，收集條件培養(yǎng)基；再加入0.2ml/cm2DMEMF12+0.05mMNEAA繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集條件培養(yǎng)基；再加入0.2ml/cm2DMEMF12+0.05mMNEAA繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集最后一次條件培養(yǎng)基。把三天收集的條件培養(yǎng)合并。2、收集到的條件培養(yǎng)基400g離心10min，取上清，過0.22μm濾膜。3、3KD濾膜包超濾濃縮至1/20原體積，所得即為制備所得的條件培養(yǎng)基。4、使用bradford法檢測獲得的總蛋白量，蛋白濃度為：201μg/mL。陰性對照組及對照組同實施例3。取制得的條件培養(yǎng)基按照實施例3的實驗方法檢測，實驗結果與實施例1制得條件培養(yǎng)基的效果相近，兩者無顯著差異(P＞0.05)。發(fā)明組對細胞的促進作用強于對照組及陰性對照組(P<0.05)，證明發(fā)明組不但蛋白含量高于對照組，活性也高于對照組。表3實施例51、取P5代的羊膜間充質干細胞，使用DMEMF12+10％FBS+0.1mMNEAA培養(yǎng)，當細胞處于指數生長期，匯合度達到90％，去培養(yǎng)上清，用PBS洗兩遍后，加入0.15ml/cm2的DMEMF12+0.2mMNEAA靜置培養(yǎng)24h后，收集條件培養(yǎng)基；再加入0.15ml/cm2DMEMF12+0.2mMNEAA繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集條件培養(yǎng)基；再加入0.15ml/cm2DMEMF12+0.2mMNEAA繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集最后一次條件培養(yǎng)基。把三天收集的條件培養(yǎng)合并。2、收集到的條件培養(yǎng)基300g離心8min，取上清，過0.22μm濾膜。3、3KD濾膜包超濾濃縮至1/20原體積，所得即為制備所得的條件培養(yǎng)基。4、使用bradford法檢測獲得的總蛋白量，蛋白濃度為：261μg/mL。陰性對照組及對照組同實施例3。取制得的條件培養(yǎng)基按照實施例3的實驗方法檢測，實驗結果與實施例1制得條件培養(yǎng)基的效果相近，兩者無顯著差異(P＞0.05)。發(fā)明組對細胞的促進作用強于對照組及陰性對照組(P<0.05)，證明發(fā)明組不但蛋白含量高于對照組，活性也高于對照組。表4以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁1 2 3