本申請屬于微生物應(yīng)用于農(nóng)業(yè)植物保護領(lǐng)域，具體地說涉及一種多孢木霉菌菌株HZ-31及其在生物除草中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著社會文明的進步和公眾健康意識的提高，廣泛、長期、大量使用化學(xué)除草劑所帶來的負面影響亦日益顯現(xiàn)，倍受全球關(guān)注。一方面，大量化學(xué)除草劑的施用帶來了環(huán)境污染，尤其是長殘效除草劑的應(yīng)用引起了殘毒藥害、導(dǎo)致下茬作物的減產(chǎn)甚至人畜中毒。目前，全世界已經(jīng)有100余種化學(xué)除草劑在30多個國家被禁用或取消登記。另一方面，過度依賴和長期大量使用單一除草劑，導(dǎo)致了雜草抗藥性的產(chǎn)生和發(fā)展，使得藥效降低、用藥量增加、成本提高、也更加重了污染，直接威脅到除草劑的繼續(xù)使用和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全。據(jù)最新統(tǒng)計，全球已發(fā)現(xiàn)244種(142種雙子葉，102種單子葉)雜草的447個生物型對22類作用位點的156種化學(xué)除草劑產(chǎn)生了抗藥性。因此，研制廣譜、高效、低毒新型綠色除草劑特別是發(fā)展生物除草顯得十分迫切。1992年世界環(huán)境與發(fā)展大會要求“在2000年前全世界生物農(nóng)藥的產(chǎn)量占農(nóng)藥總產(chǎn)量的60％”。就生物除草而言，雖然目前遠未達到這一目標，但努力發(fā)展生物除草技術(shù)已逐漸成為全球的共識。

各國為了響應(yīng)這一號召，制定了本國的發(fā)展戰(zhàn)略。美國、歐盟等許多國家，制訂了相應(yīng)的法律法規(guī)，嚴格限制或停止使用一些化學(xué)農(nóng)藥，同時大力發(fā)展生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)。我國在農(nóng)業(yè)“十三·五”規(guī)劃中提出了“雙減(減化肥和農(nóng)藥)”目標。除草劑在整個農(nóng)藥市場中占比超過50％，因此，要想順利實現(xiàn)這個目標，必須想辦法大幅降低化學(xué)除草劑的用量。而發(fā)展生物除草劑是替代和減少化學(xué)除草劑的使用并有效控制草害、保證農(nóng)作物穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)、保障食品安全和公眾健康的重要基礎(chǔ)；是減少化學(xué)除草劑殘留、消除二次污染、改善農(nóng)業(yè)生態(tài)、實現(xiàn)環(huán)境安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑；是現(xiàn)代有機農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的基本要求和重要保障。

近10年來，在國家各級政府部門和科研機構(gòu)的高度重視下，尤其在“十一·五”、“十二·五”和國家“863”項目的資助下，我國已初步建立起了生物除草劑研究的技術(shù)體系，以馬唐-畫眉草彎孢霉C.eragrostidis、稗草-新月彎孢霉Culvularia lunata、稗草-禾長蠕孢菌H.gramineum和蟋蟀草平臍蠕孢菌株B.eleusines、加拿大一枝黃花Solidago canadensis-齊整小核菌S.rolfsii、空心蓮子草Alternantera phyloxeroides-假隔鏈格孢菌Nimbya alternantherae、紫莖澤蘭Ageratina adenophora-鏈格孢菌A.alternata研究已經(jīng)取得了系列進展，特別是紫莖澤蘭致病型鏈格孢菌代謝產(chǎn)物——4-羥-3-乙?；量┻?2-酮類化合物作用機理和靶標以及模擬合成的研究具有原創(chuàng)性。目前，已經(jīng)形成了一批具有自主知識產(chǎn)權(quán)的生物除草劑技術(shù)成果，申請國家發(fā)明專利30余項，其中，國際專利2項；獲得中國國家發(fā)明授權(quán)11項，美國和日本國家發(fā)明專利各1項。已經(jīng)有數(shù)項成果進入商業(yè)化發(fā)展階段，進行農(nóng)藥注冊登記的田間藥效，并有望在近期獲得正式登記?？傊覈锍輨┭芯空谡w進入一個以追求自主創(chuàng)新為特點的快速發(fā)展新階段。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本申請針對上述問題，提供了一種多孢木霉菌菌株HZ-31及其在生物除草中的應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問題，本申請公開了一種多孢木霉菌菌株，其分類命名為多孢木霉HZ-31(Trichoderma polysporum)，該菌株于2016年09月12日保藏于中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.12867。該菌株在PDA平板上培養(yǎng)7d后，表面產(chǎn)生致密的白色分生孢子，分生孢子梗排列成半球形或墊狀的皰狀物，分生孢子梗有隔膜，通常高度分枝，以2～4個輪生，直角，分生孢子長橢圓形或球形，光滑，結(jié)合形態(tài)特征和分子鑒定結(jié)果，判斷菌株HZ-31為多孢木霉(Trichoderma polysporum)。

本發(fā)明還公開了一種多孢木霉菌菌株HZ-31的可濕性粉劑。

進一步的，所述粉劑由下列重量百分比的原料組成：高嶺土10-15％、聚乙烯醇6％、糊精3％、拉開粉3％、膨潤土1％，余量為固體發(fā)酵得到的多孢木霉真菌固體發(fā)酵物。依次將各組分加入混合機，邊加入邊攪拌，直至各組分完全混合均勻。

本發(fā)明還公開了一種多孢木霉菌菌株HZ-31的可濕性粉劑制備方法，步驟包括：

(1)多孢木霉固體發(fā)酵物制備：將多孢木霉菌株HZ-31菌種以40％的量接種于固態(tài)基質(zhì)上，室溫下培養(yǎng)8d，粉碎后獲得多孢木霉固體發(fā)酵物；

(2)各組分依次加入混合機，邊加入邊攪拌，直至各組分完全混合均勻。

進一步的，所述多孢木霉菌株HZ-31菌種的孢子量1×10⁸個/mL。

本發(fā)明還公開了一種用于培養(yǎng)多孢木霉菌株HZ-31菌種的固態(tài)基質(zhì)，所述固態(tài)基質(zhì)由下列重量份數(shù)的原料組成：麥麩或麥稈糠96％、小麥粉2％和(NH₄)₂SO₄ 2％，所述基質(zhì)的含水量為37％。

其培養(yǎng)方法為：該菌采用液體-固體聯(lián)合發(fā)酵的生產(chǎn)方式，即先以液體發(fā)酵培養(yǎng)菌絲體，后在固體基質(zhì)上固定發(fā)酵培養(yǎng)，生產(chǎn)真菌侵染的基質(zhì)。固體培養(yǎng)8d后獲得多孢木霉固體發(fā)酵物，以高嶺土作為載體，聚乙烯醇作為分散劑，膨潤土作為穩(wěn)定劑，糊精作為保護劑，結(jié)合拉開粉作為潤濕劑，將HZ-31固體發(fā)酵物與篩選出的適宜載體、助劑按照15％的載體、6％的分散劑、1％穩(wěn)定劑和3％的潤濕劑的比例混合，粉碎，再混合，制成可濕性粉劑。

生產(chǎn)流程：實驗室菌種→一級種子(培養(yǎng)基平板)→液體接種發(fā)酵→固體培養(yǎng)基接種→通風(fēng)晾干→粉碎→干真菌侵染基質(zhì)→載體助劑→可濕性粉劑→致病性及安全性測定。

本發(fā)明還提供一種多孢木霉菌菌株可濕性粉劑在控制野燕麥、酸模葉蓼、薄朔草、藜、密花香薷、萹蓄雜草中的應(yīng)用。

進一步的，所述可濕性粉劑使用劑量為20g/m²。

本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：

1)本發(fā)明利用微生物資源防除雜草具有對作物影響小、環(huán)境負效應(yīng)少、安全性高等優(yōu)點，符合可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展，已受到世界各國的高度重視。對微生物除草劑的評價，理論上主要依據(jù)兩條標準即有效性(藥效)和專一性(安全性)。雜草生防菌具備既對靶標雜草具有強致病性又對作物相對安全兩大特點。

2)本發(fā)明針對蠶豆、豌豆田的野燕麥、酸模葉蓼、薄朔草、藜、密花香薷、萹蓄等常見雜草，制備一種多孢木霉菌可濕性粉劑，用于生物除草。本發(fā)明能有效安全地控制和防治部分農(nóng)田常見雜草，成本低，無污染，低殘留對環(huán)境友好。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1是本申請多孢木霉菌HZ-31可濕性粉劑對野燕麥、酸模葉蓼、密花香薷、薄朔草、藜、萹蓄葉片的離體致病效果；

圖2是本申請多孢木霉菌HZ-31可濕性粉劑對藜、野燕麥、密花香薷、萹蓄、薄朔草、酸模葉蓼植株的盆栽活體致病效果；

圖3是本申請多孢木霉菌HZ-31可濕性粉劑對藜、密花香薷等田間主要雜草的防控效果。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例1

一種多孢木霉菌菌株，其分類命名為多孢木霉HZ-31(Trichoderma polysporum)，該菌株于2016年09月12日保藏于中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.12867。該菌株在PDA平板上培養(yǎng)7d后，表面產(chǎn)生致密的白色分生孢子，分生孢子梗排列成半球形或墊狀的皰狀物，分生孢子梗有隔膜，通常高度分枝，以2～4個輪生，直角，分生孢子長橢圓形或球形，光滑，結(jié)合形態(tài)特征和分子鑒定結(jié)果，判斷菌株HZ-31為多孢木霉(Trichoderma polysporum)。

實施例2可濕性粉劑的制備

一、菌株HZ-31最佳發(fā)酵條件的確定

以PDA培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行碳氮源單因素試驗，以產(chǎn)孢量和孢子懸浮液OD吸光值為指標確定菌株HZ-31最適碳、氮源；選用菜籽餅、麥稈糠、羊糞、麥麩、珍珠巖和蛭石作為基質(zhì)，接種菌液后培養(yǎng)，確定產(chǎn)孢量高的底物固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)；以菜籽餅作為底物，混合營養(yǎng)物質(zhì)加入三角瓶，每個處理加入無菌水20mL，接不同比例基質(zhì)體積分數(shù)的孢子懸浮液，用血球計數(shù)板計數(shù)確定液體菌種的最適接菌量；通過單因素試驗篩選出培養(yǎng)基含水量和培養(yǎng)溫度，再結(jié)合培養(yǎng)時間這3個量作為因素，分別取5個水平，采用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計進行正交試驗，確定該菌的最優(yōu)培養(yǎng)條件。

結(jié)果顯示碳氮源、發(fā)酵時間、接種量、培養(yǎng)時間等因素對菌株HZ-31的發(fā)酵生產(chǎn)均有明顯的影響。HZ-31最適碳源為小麥粉，最適氮源(NH4)₂SO₄，在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量達到6.17×10⁸mL^-1時，最適碳源培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量達到3.03×10⁹個/mL，最適氮源培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量達到7.53×10⁸個/mL。小麥粉和(NH₄)₂SO₄分別作為補充碳氮源，優(yōu)化了固態(tài)培養(yǎng)基，促進了菌株的產(chǎn)孢量。產(chǎn)孢量高的底物固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)是麥麩或麥稈糠。研究中HZ-31最適宜的接種量為40％。正交試驗篩選出該菌株最適培養(yǎng)基質(zhì)含水量均為37％，最適培養(yǎng)溫度為23℃，最佳培養(yǎng)時間為8d。對于菌株HZ-31的發(fā)酵生產(chǎn)工藝來說,明確各因素與菌株發(fā)酵生產(chǎn)之間的關(guān)系,為該菌的規(guī)模化生產(chǎn)和劑型研究提供理論依據(jù)。

菌株HZ-31可濕性粉劑的制備

(一)載體和助劑的篩選

將高嶺土、硅藻土、磷酸鉀、拉開粉、幾丁質(zhì)、殼聚糖和羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、膨潤土、輕質(zhì)碳酸鈣、聚乙烯醇等載體和助劑，分別按2％的比例加入菌株HZ-31對應(yīng)的最適培養(yǎng)基。分別以200uL的菌液(稀釋106個/mL)涂平板，4-6d之后觀察菌落生長狀況，確定其對菌株孢子萌發(fā)的影響。將8mm的菌餅置于不同載體或助劑的培養(yǎng)基中，觀察不同載體助劑對菌株生長狀況的影響。

菌落數(shù)量及直徑測量結(jié)果如下：

表1 HZ-31在不同載體上菌落數(shù)量及直徑記錄

由表1看出，載體高嶺土處理后，菌落萌發(fā)數(shù)量多且菌落生長較快，選作HZ-31的載體。聚乙烯醇作為分散劑，膨潤土作為穩(wěn)定劑，糊精作為保護劑，結(jié)合拉開粉作為潤濕劑。

(二)菌株HZ-31可濕性粉劑制備

采用液體-固體聯(lián)合發(fā)酵的生產(chǎn)方式，即先以液體發(fā)酵培養(yǎng)菌絲體，后在固體基質(zhì)上固定發(fā)酵培養(yǎng)，生產(chǎn)真菌侵染的基質(zhì)。固體培養(yǎng)8d后獲得多孢木霉固體發(fā)酵物，以高嶺土作為載體，聚乙烯醇作為分散劑，膨潤土作為穩(wěn)定劑，糊精作為保護劑，結(jié)合拉開粉作為潤濕劑，將HZ-31固體發(fā)酵物與篩選出的適宜載體、助劑按照15％的載體、6％的分散劑、1％穩(wěn)定劑和3％的潤濕劑的比例混合，粉碎，再混合，制成可濕性粉劑。

實施例3菌株HZ-31可濕性粉劑對雜草的致病性的影響

采集新鮮的雜草葉片，置于墊有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，配置HZ-31可濕性粉劑，接種量為100uL/葉，以只接種清水的葉片為對照，每處理重復(fù)三次。置于25℃光照培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，觀察葉片發(fā)病情況。

將田間生長4～5葉期，葉色正常的野燕麥、酸模葉蓼、薄朔草、藜、密花香薷、萹蓄移栽于花盆(Φ＝15cm)中，于實驗室內(nèi)培養(yǎng)；將HZ-31可濕性粉劑溶解后噴霧接種到移栽的健康雜草植株上。以接種清水的植株作為空白對照，設(shè)3次重復(fù)。接種后的雜草植株置于室溫，7d后調(diào)查雜草發(fā)病程度，稱鮮重，計算發(fā)病率、鮮重效，所有數(shù)據(jù)采用DPS統(tǒng)計軟件進行差異顯著性分析。同時將HZ-31可濕性粉劑溶解后噴霧接種到農(nóng)田4-6葉期雜草植株上，觀察其控制效果。

如圖1-3所示，噴施菌株HZ-31可濕性粉劑后，6種雜草均表現(xiàn)出受害癥狀，不同程度的出現(xiàn)萎蔫，褪綠變黃，甚至枯萎癥狀。結(jié)合發(fā)病率、鮮重效綜合分析(見表2)，HZ-31可濕性粉劑對野燕麥、酸模葉蓼、密花香薷、萹蓄致病效果突出，HZ-31可作為防除野燕麥、酸模葉蓼、薄朔草、藜、密花香薷、萹蓄等農(nóng)田雜草的生物除草劑，進行進一步研究。

表2 菌株HZ-31可濕性粉劑對不同雜草致病力

注:同列不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。

實施例4菌株HZ-1對作物的安全性的影響

將青海省5種主栽作物：春小麥(青春587)、春油菜(青雜5號)、蠶豆(青海9號)、豌豆(草原224)、青稞(北青8號)分別種植于Φ＝15cm花盆中，室內(nèi)培養(yǎng)備用。HZ-31可濕性粉劑按上述方法接種于到3～4葉期的作物植株上，設(shè)3次重復(fù)，接種7d后觀察供試作物的發(fā)病情況，記載發(fā)病程度。

HZ-31菌株可濕性粉劑接種后對豌豆(草原224)、蠶豆(青海9號)均無致病性，作物長勢和株高與對照植株相比均未受影響，表現(xiàn)為沒有反應(yīng)(NS)；春小麥(青春587)、青稞(北青8號)有輕微的致病性，接種后3d，5％葉片出現(xiàn)萎蔫，后期癥狀不擴展，表現(xiàn)為輕微反應(yīng)(LS)；對春油菜(青雜5號)嚴重感病(SS)。

本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，除非另外定義，這里使用的所有術(shù)語(包括技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員的一般理解相同的意義。還應(yīng)該理解的是，諸如通用字典中定義的那些術(shù)語應(yīng)該被理解為具有與現(xiàn)有技術(shù)的上下文中的意義一致的意義，并且除非像這里一樣定義，不會用理想化或過于正式的含義來解釋。

最后所應(yīng)說明的是：以上實施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解：依然可以對本發(fā)明進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當中。