本發(fā)明涉及一種比例熒光探針及其應用，尤其涉及一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)機理的靶向線粒體的次氯酸比例熒光探針及其應用；屬于有機小分子熒光探針技術領域。

背景技術：

次氯酸是生物體中各種生物過程的重要的活性氧之一，內(nèi)源性的次氯酸主要由雙氧水與氯離子經(jīng)過氧化酶催化產(chǎn)生。次氯酸作為生物體內(nèi)的殺菌劑，在免疫系統(tǒng)中有重大作用，內(nèi)源性次氯酸的過量或缺乏都可能導致疾病發(fā)生，比如關節(jié)炎、動脈硬化以及腫瘤等疾病。因此，實現(xiàn)生物體內(nèi)次氯酸快速、靈敏、高選擇性的檢測至關重要。

線粒體是細胞內(nèi)活性氧的主要來源，線粒體內(nèi)次氯酸的檢測對細胞生物學以及生理病理學研究非常重要。中國專利如【201510794522】、【201610323154】、【201610263094】涉及次氯酸的選擇性檢測，但缺乏結(jié)構(gòu)多樣性，存在應用方面的局限，至今尚未見靶向線粒體的次氯酸比例熒光探針專利。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移機理的靶向線粒體的次氯酸比例熒光探針及其應用。

本發(fā)明技術方案的核心在于利用香豆素為能量供體，苯乙烯基苯并噻唑鹽為能量受體構(gòu)筑FRET體系。當用香豆素的激發(fā)波長激發(fā)探針時，發(fā)生FRET過程，探針發(fā)射苯乙烯基苯并噻唑鹽熒光團的熒光；當加入次氯酸時，苯乙烯基苯并噻唑鹽的雙鍵部位被氧化成醛，共軛體系斷裂，F(xiàn)RET系統(tǒng)被破壞。當同樣用香豆素的激發(fā)波長激發(fā)時，僅發(fā)出香豆素熒光團的熒光。兩個發(fā)射波長的熒光強度比與次氯酸濃度呈現(xiàn)線性關系，實現(xiàn)比率熒光檢測次氯酸，避免探針濃度以及環(huán)境等干擾，提高檢測精確度。

本發(fā)明所述的基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移機理的靶向線粒體的次氯酸比例熒光探針，其特征在于：所述比率熒光探針是以香豆素熒光團作為能量供體，苯乙烯基苯并噻唑鹽作為能量受體，構(gòu)成熒光共振能量轉(zhuǎn)移組合對，其化學結(jié)構(gòu)式如式(I)所示：

本發(fā)明所述的基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移機理的靶向線粒體的次氯酸比例熒光探針的制備方法是：4-(4-(7-(二乙胺基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-羰基)哌嗪基-1)苯甲醛【4-(4-(7-(diethylamino)-2-oxo-2H-chromene-3-carbonyl)piperazin-1-yl)benzaldehyde】與3-甲基苯并噻唑鹽反應得到所述比例熒光探針。

所述基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移機理的靶向線粒體的次氯酸比例熒光探針在檢測PBS/DMF緩沖液及生物細胞中的次氯酸的應用。

本發(fā)明所述的探針的結(jié)構(gòu)可以被次氯酸氧化成醛，釋放出具有熒光的4-(4-(7-(二乙胺基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-羰基)哌嗪基-1)苯甲醛，從而達到檢測的效果，見圖1。

配制此比例熒光探針的PBS/DMF緩沖液(pH＝7.0，v/v＝9:1)的溶液，分別定量加入微升級的KNO₃,Ba(NO₃)₂,AlCl₃,OCl^-,t-BuO·,H₂O₂,O₂^-,OONO^-,NO·,¹O₂,t-BuOOH,NaNO₂,Na₂CO₃,NaCH₃CO₂,Na₂S and NaSO₄的水溶液。通過紫外可見分光光度法和熒光分光光度法測試對不同活性氧、人體常見金屬離子的選擇性和響應能力，結(jié)果見圖2-3。在加入OCl^-前后體系在580nm與480nm處的熒光強度比值(I₅₈₀/I₄₈₀)以及在483nm處的吸收強度變化明顯。

在分別加入上述探針的RAW264.7活細胞中，對照不加LPS和加入LPS的細胞藍色熒光顯微成像變化。結(jié)果見圖4.

本發(fā)明所述基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移機理的靶向線粒體的次氯酸比例熒光探針在檢測線粒體中的次氯酸的應用。

通過探針在RAW264.7活細胞中與線粒體深紅的共定位實驗，表明所述探針能定位于線粒體。結(jié)果見圖5。預示其在檢測線粒體中的次氯酸的應用具有開發(fā)前景。

本發(fā)明設計合成的基于FRET的比例熒光探針可以與OCl^-發(fā)生氧化反應，隨著次氯酸濃度的增加，580nm處熒光強度逐漸減弱，480nm處熒光強度逐漸增強；二者比值與次氯酸濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關系。該探針實現(xiàn)了對OCl^-的微量高靈敏度檢測，具有重要的應用價值。

附圖說明

圖1：本發(fā)明探針與次氯酸氧化產(chǎn)物的高分辨質(zhì)譜。

圖2：本發(fā)明探針的PBS/DMF緩沖液(pH＝7.0，v/v＝9:1，10μM)中加入不同的活性氧、常見金屬離子的紫外吸收光譜，選擇性識別次氯酸。

圖3：本發(fā)明探針的PBS/DMF緩沖液(pH＝7.0，v/v＝9:1，2.5μM)中加入不同的活性氧、常見金屬離子的熒光發(fā)射譜，選擇性識別次氯酸。

其中：(A)熒光發(fā)射譜圖，(B)兩個波長下熒光強度比值量化圖。

圖4：本發(fā)明探針在RAW264.7cells中的熒光顯微成像圖。

其中：(A)熒光成像圖，(B)量化圖。

圖5：本發(fā)明探針在RAW264.7活細胞中與線粒體深紅染料的共定位。

其中：(a)探針的藍光405-550nm；(b)探針的綠光(560-700nm)；(c)Mito Tracker DeepRed，激發(fā)波長(Ex)644nm，發(fā)射波長(Em)665nm；(d)明場圖像；(e)為(a)，(b)和(c)的疊加圖；(f)探針和Mito Tracker Deep Red的共定位分析(共定位系數(shù)：0.91)。

具體實施方式

實施例1

用已知方法合成4-(4-(7-(二乙胺基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-羰基)哌嗪基-1)苯甲醛(1)，然后化合物1與3-甲基苯并噻唑鹽反應得到本發(fā)明所述的基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移機理的靶向線粒體的次氯酸比例熒光探針。該探針可以與次氯酸發(fā)生氧化反應，釋放出有熒光的7-二乙胺基香豆素衍生物1。

反應式如下：

將4-(4-(7-(二乙胺基)-2-氧代-2H-苯并吡喃-3-羰基)哌嗪基-1)苯甲醛(1,20mmol)，2-甲基苯并噻唑鹽(2,20mmol)至50mL無水乙醇中回流，反應3小時后冷至室溫，濃縮，硅膠柱層析，得到紅色粉末本發(fā)明的探針(3)，熔點：182℃，產(chǎn)率87％。

核磁共振氫譜測定：¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ＝8.34(d,J＝7.5Hz,1H),8.15-8.04(m,3H),7.95(d,J＝8.7Hz,2H),7.84-7.69(m,3H),7.52(d,J＝9.0Hz,1H),7.09(d,J＝9.0Hz,2H),6.76(dd,J＝2.1,9.0Hz,1H),6.57(d,J＝2.1Hz,1H),4.26(s,3H),3.74-3.32(m,12H),1.14(t,J＝6.9Hz,6H)；

核磁共振碳譜測定：¹³C NMR(75MHz,DMSO-d6):δ＝171.60,164.23,158.45,156.65,153.18,151.30,149.40,144.17,141.92,132.44,130.15,128.96,127.68,127.04,123.89,123.39,116.17,115.58,113.83,109.42,108.11,107.10,93.26,46.55,45.81,44.15,35.79,12.27；

高分辨質(zhì)譜：[M]⁺calcd for C₃₆H₃₅N₆O₄,579.2430,found 579.2469。

實施例2

用微量注射器向10mL配好的本發(fā)明所述的基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移機理的靶向線粒體的次氯酸比例熒光探針的PBS/DMF緩沖液(pH＝7.0，v/v＝9:1，10μM)中，分別定量加入10μM的KNO₃,Ba(NO₃)₂,AlCl₃,OCl^-,t-BuO·,H₂O₂,O₂^-,OONO^-,NO·,¹O₂,t-BuOOH,NaNO₂,Na₂CO₃,NaCH₃CO₂,Na₂S,NaSO₄的水溶液，作用3小時后進行熒光分光光度法和紫外分光光度計測試，顯示探針對次氯酸有較好的選擇性，加入次氯酸前后對照顯示紫外吸收以及兩個發(fā)射波長的熒光強度發(fā)生明顯變化，見圖2，3。

實施例3

細胞內(nèi)熒光成像：

RAW264.7細胞先用脂多糖(LPS，1μg/ml)培養(yǎng)12h，隨后在無血清培養(yǎng)基中加入佛波酯(PMA，1μg/mL)繼續(xù)孵育30min，再用本發(fā)明所述探針(2μM)孵育30min。PBS(pH 7.20)沖洗細胞3次后，用激光共聚焦顯微鏡(LSM 700)進行成像，收集405-550nm(藍光)和560-700nm(紅光)波長范圍內(nèi)的熒光，得到明場圖像、熒光圖像和二者的疊加圖像，然后進行統(tǒng)計(*p<0.05vs.control,**p<0.01vs.control,n＝3)，見圖4。

實施例4

本發(fā)明所述探針與線粒體的共定位分析：

利用本發(fā)明所述探針(2μM)孵育RAW264.7細胞15min，再加入線粒體標記物MitoTracker Deep Red(0.4μM)繼續(xù)孵育15min，PBS洗3次，然后進行共聚焦成像觀察。

結(jié)果見圖5：(a)探針的藍光405-550nm；(b)探針的綠光(560-700nm)；(c)Mito TrackerDeep Red，激發(fā)波長(Ex)644nm，發(fā)射波長(Em)665nm；(d)明場圖像；(e)為(a)，(b)和(c)的疊加圖；(f)探針和Mito Tracker Deep Red的共定位分析(共定位系數(shù)：0.91)。

通過探針在RAW264.7活細胞中與線粒體深紅的共定位實驗，表明所述探針能定位于線粒體。