順行跨單級(jí)突觸神經(jīng)示蹤系統(tǒng)的制作方法

文檔序號(hào)：12097193閱讀：5835來(lái)源：國(guó)知局

導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>有機(jī)化合物處理,合成應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明一般涉及神經(jīng)生物學(xué)，并且更具體地涉及順行(anterograde)跨單級(jí)突觸神經(jīng)(monosynaptic transneuronal)示蹤系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

繪制大腦連接組對(duì)了解大腦是如何工作來(lái)說(shuō)是必不可少的。作為神經(jīng)功能的基本單位，神經(jīng)環(huán)路在宏觀結(jié)構(gòu)/功能和微分子/信號(hào)環(huán)路間起到橋梁的作用。然而，許多特定的功能神經(jīng)環(huán)路的結(jié)構(gòu)，包括組件，連接和分布，仍有待闡明。新的示蹤技術(shù)和示蹤工具，特別是病毒示蹤工具，有助于發(fā)現(xiàn)新的環(huán)路和揭示已知的典型環(huán)路的新功能。

病毒示蹤工具已經(jīng)用于神經(jīng)科學(xué)研究?？袢〔《?RV)和偽狂犬病病毒(PRV)的衍生病毒示蹤工具有能力追蹤神經(jīng)環(huán)路去標(biāo)記輸入神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(1)。重組水泡口炎病毒(VSV)用于順行或逆行跨突觸環(huán)路示蹤(2，3)。人單純皰疹病毒1型(HSV-1)毒株H129(H129)是一個(gè)潛在的順行跨突觸神經(jīng)環(huán)路的示蹤工具(4,5)。

然而，跨多級(jí)突觸病毒示蹤工具在確定直接或非直接投射靶標(biāo)時(shí)引起不可避免的模糊。因此，迫切需要的是開發(fā)順行跨單級(jí)突觸神經(jīng)示蹤系統(tǒng)，為了明確地確定直接投射靶標(biāo)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了順行跨單級(jí)突觸(monosynaptic transneuronal)病毒示蹤系統(tǒng),用于繪制在一個(gè)特定的腦核團(tuán)的特殊類型神經(jīng)元的直接后突觸靶標(biāo)。在一個(gè)實(shí)施例中，所述順行跨單級(jí)突觸病毒示蹤系統(tǒng)包括H129衍生的重組缺陷型病毒，其包含整合的第一表達(dá)盒含有第一啟動(dòng)子、第一熒光蛋白編碼序列，和抗性肽編碼序列，其中第一表達(dá)盒代替整個(gè)或部分胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因序列，產(chǎn)生的H129衍生的重組缺陷型病毒喪失了TK功能(H129-ΔTK-tdT)；和AAV9衍生的重組AAV9輔助病毒(AAV9-TK-GFP和AAV9-DIO-TK-GFP)，可補(bǔ)償TK，其包含整合的第二表達(dá)盒含有第二啟動(dòng)子、TK編碼序列，連接子肽編碼序列，和第二熒光蛋白編碼序列，其中第二表達(dá)盒的TK表達(dá)使H129衍生的重組缺陷型HSV-1病毒復(fù)制；其中所述第一和第二熒光蛋白編碼序列，編碼不同的熒光蛋白。

通過(guò)如下結(jié)合附圖對(duì)優(yōu)選實(shí)施例的詳細(xì)描述，本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)是顯而易見的。

附圖說(shuō)明

本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案現(xiàn)在將參考附圖進(jìn)行說(shuō)明，其中類似的附圖標(biāo)記表示相同的元件。

圖1、(a)H129-wt基因組的結(jié)構(gòu)示意圖；(b)H129-G1基因組結(jié)構(gòu)示意圖；(c)H129-ΔTK-tdT基因組結(jié)構(gòu)示意圖；(d)構(gòu)建pUS-F6；(e)構(gòu)建H129-G1；(f)H129-G1單克隆PCR驗(yàn)證結(jié)果；(g)伴隨病毒復(fù)制的GFP表達(dá)的GFP信號(hào)和導(dǎo)致的細(xì)胞病變效果；(h)Western Blot檢測(cè)病毒蛋白；(i)VERO細(xì)胞中H129-wt和H129-G1生長(zhǎng)曲線；(j)鼠胚海馬神經(jīng)元和VERO細(xì)胞中H129-G1和H129-ΔTK-tdT生長(zhǎng)曲線。

圖2、(a)輔助病毒AAV9-TK-GFP基因組的結(jié)構(gòu)示意圖；(b)輔助病毒AAV9-DIO-TK-GFP基因組的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3、用本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的順行跨單級(jí)神經(jīng)病毒示蹤系統(tǒng)繪制野生小鼠來(lái)自VPM的直接投射。

圖4、用本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的順行跨單級(jí)神經(jīng)病毒示蹤系統(tǒng)繪制DAT-Cre小鼠來(lái)自VTA-DA神經(jīng)元的直接投射。

圖5、用本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的順行跨單級(jí)神經(jīng)病毒示蹤系統(tǒng)繪制PV-Cre小鼠來(lái)自nRT-PV神經(jīng)元的直接投射。

具體實(shí)施方式

可以通過(guò)引用以下的本發(fā)明的某些實(shí)施例的詳細(xì)描述而更容易地理解本發(fā)明。

在本申請(qǐng)中，為了更充分地描述本發(fā)明所涉及領(lǐng)域狀態(tài)，當(dāng)出版物被引用，這些出版物的公開內(nèi)容的全部經(jīng)引用而并入本申請(qǐng)。

除非另有說(shuō)明，在本發(fā)明的實(shí)踐將采用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))，微生物學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)，生物化學(xué)，核酸化學(xué)和免疫學(xué)的現(xiàn)有技術(shù)，這些是在本領(lǐng)域的技能之內(nèi)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中已有完全解釋，如分子克?。簩?shí)驗(yàn)室說(shuō)明書，第三版(Sambrook和Russel，2001年)；分子生物學(xué)當(dāng)代程序(FM Ausubel等主編，1987年，包括補(bǔ)充至2001年)。

單純皰疹病毒1型(HSV-1)是一種普遍存在的、條件致病病原。其自然神經(jīng)嗜性和跨神經(jīng)突觸的傳播能力使其成為潛在的神經(jīng)環(huán)路示蹤工具。

HSV-1毒株McIntyre-B逆行傳播，而HSV-1毒株H129優(yōu)先順行跨神經(jīng)突觸傳播[7-9]。許多研究在不同的途徑和不同的動(dòng)物模型中的應(yīng)用了這種病毒[7,10-13]。特別是，表達(dá)遺傳改變的熒光蛋白(FP)的H129的研發(fā)促使了探索該病毒株在順行神經(jīng)環(huán)路中的示蹤[14,15]。然而，由于有限的標(biāo)記強(qiáng)度，這些H129衍生的示蹤工具無(wú)法讓突觸環(huán)路可視化，也無(wú)法顯示神經(jīng)元形態(tài)的細(xì)節(jié)[14,15]。

腺相關(guān)病毒(AAV)感染人類和其他靈長(zhǎng)類動(dòng)物。該病毒是一個(gè)小的(病毒顆粒直徑約20nm)，復(fù)制缺陷型，無(wú)囊膜病毒。AAV基因組是單鏈脫氧核糖核酸(DNA)，大約4700個(gè)堿基長(zhǎng)。基因組包括在DNA鏈的兩端的反向末端重復(fù)序列(ITRS)，和兩個(gè)開放閱讀框(ORF)：rep和cap。前者是由四個(gè)重疊基因組成，編碼Rep蛋白的，為腺病毒生命周期相關(guān)的所需，后者包含重疊的衣殼蛋白的核苷酸序列：VP1、VP2、VP3，相互作用在一起形成二十面體對(duì)稱的衣殼。

本發(fā)明提供順行跨單級(jí)神經(jīng)(monosynaptic transneuronal)病毒示蹤系統(tǒng)，用于繪制在任一給定腦核團(tuán)的特定神經(jīng)類型的直接后突觸靶標(biāo)。簡(jiǎn)而言之，所述順行跨單級(jí)突觸病毒示蹤系統(tǒng)包括H129衍生的重組缺陷型HSV-1病毒，和AAV9衍生的重組AAV9輔助病毒。所述H129衍生的重組缺陷型HSV-1病毒包含整合的第一表達(dá)盒含有第一啟動(dòng)子、第一熒光蛋白編碼序列，和抗性肽編碼序列，其中第一表達(dá)盒代替整個(gè)或部分胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因序列，產(chǎn)生的H129衍生的重組缺陷型HSV-1病毒H129喪失TK功能。所述AAV9衍生的重組AAV9輔助病毒包含整合的第二表達(dá)盒含有第二啟動(dòng)子、TK編碼序列，連接子肽編碼序列，和第二熒光蛋白編碼序列，其中第二表達(dá)盒的TK表達(dá)使H129衍生的重組缺陷型HSV-1病毒復(fù)制。

在一些實(shí)施例中，所述第一和第二啟動(dòng)子是選自CMV啟動(dòng)子,SV40啟動(dòng)子,CAG啟動(dòng)子，EF1a啟動(dòng)子，TH(tyrosine hydroxylase)啟動(dòng)子和Syn1啟動(dòng)子。所述第一和第二神經(jīng)元細(xì)胞特異性啟動(dòng)子可以是相同或不同的。在一些實(shí)施例中，第一啟動(dòng)子是神經(jīng)元細(xì)胞特異性的。

在一些實(shí)施例中，適用于本發(fā)明的熒光蛋白編碼序列可以是在目前或?qū)?lái)可用的任何熒光基因。熒光基因可以是野生型的或重組衍生，只要他們的熒光強(qiáng)度不降低。例如，所述熒光蛋白編碼序列包括GFP(green fluorescent protein)，eGFP(enhanced green fluorescent protein)，mGFP(membrane bound form of EGFP)，sfGFP(superfolder green fluorescent protein)，EYFP(enhanced yellow fluorescent protein)，ECFP(enhanced cyan fluorescent protein)，EBFP2(enhanced blue fluorescent protein 2)，tdTomato，MRFP(monomer red fluorescent protein，mCherry，Ypet，mKO，mkate，等等。所述第一和第二熒光蛋白編碼序列編碼不同的熒光蛋白。

在一些實(shí)施例中，所述抗性肽編碼序列包括Zeo^R(zeocin)，Amp^R(ampicillin)和Cam^R(chloramphenicol)。

在一些實(shí)施例中，所述連接子肽編碼序列編碼一個(gè)連接子多肽，其含有至少兩個(gè)相鄰氨基酸，他們間的肽鍵形成是非常低效的。在一些實(shí)施例中，所述連接子多肽含有的至少兩個(gè)相鄰氨基酸是甘氨酸和脯氨酸。當(dāng)連接子多肽編碼序列位于TK編碼序列和第二熒光蛋白編碼序列之間，他們被轉(zhuǎn)錄成一個(gè)單一轉(zhuǎn)錄子。當(dāng)所述單一轉(zhuǎn)錄子被翻譯時(shí)，TK和第二熒光蛋白生成為分離的蛋白(不是一個(gè)融合蛋白)，由于連接子多肽阻礙肽鍵形成。

在一些實(shí)施例中，單純皰疹病毒1型(HSV-1)毒株H129具有一個(gè)基因組(GenBank GU734772.1)。如圖1(a)所示，H129-wt具有典型的單純皰疹病毒的結(jié)構(gòu),包括一個(gè)單一的長(zhǎng)序列和一個(gè)單一的短序列，每個(gè)獨(dú)特組件兩端分別是反向重復(fù)序列，因此可以形成4個(gè)同分異構(gòu)體[16,17]。

在一些實(shí)施例中，AAV9具有一個(gè)基因組(addgene number 20298)。

如圖1(c)所示，示例性H129衍生的重組缺陷型HSV-1病毒為H129-ΔTK-tdT，其包括整合的第一表達(dá)盒，含有CMVpromoter-tdtomato-Zeo^R；其中第一表達(dá)盒替代TK(UL23)基因。作為一個(gè)例子，所述第一表達(dá)盒在HSV-1基因組的46617至47747替代TK(UL23)基因。所述第一表達(dá)盒中第一熒光蛋白編碼序列由SEQ ID NO 1代表，編碼由SEQ ID NO 2代表的tdtomato。所述第一表達(dá)盒中抗性肽編碼序列由SEQ ID NO 3代表，編碼由SEQ ID NO 4代表的Zeo^R。

在一些實(shí)施例中，使用熒光蛋白，連接子多肽，抗性肽和TK的變體；“變體”的定義為一個(gè)多肽與一個(gè)由序列號(hào)代表的氨基酸序列有至少90％，優(yōu)選95％，更優(yōu)選98％，甚至更優(yōu)選99％的同一性，只要變體中的變化不影響其功能。

在一些實(shí)施例中，所述H129衍生的重組缺陷型HSV-1病毒進(jìn)一步含有BAC序列。BAC序列為在細(xì)菌中的遺傳操作提供便利。一個(gè)示例性BAC核苷酸序列由SEQ ID NO 5代表。在一些實(shí)施例中，一個(gè)功能性BAC變體與SEQ ID NO 5有至少90％，優(yōu)選95％，更優(yōu)選98％，甚至更優(yōu)選99％的同一性。在一些實(shí)施例中，BAC序列位于HSV-1基因組的46616-46617間。

如圖2(a)所示，示例性AAV9衍生的重組AAV9輔助病毒包括整合的第二表達(dá)盒，EF1apromoter-TK-2A-GFP(命名為AAV-TK-GFP)；其中表達(dá)盒插入在AAV9基因組的BamHI和EcoRI間。TK編碼序列由SEQ ID NO 6代表，編碼由SEQ ID NO 7代表的TK。連接子多肽編碼序列由SEQ ID NO 8代表，編碼由SEQ ID NO 9代表的2A。第二熒光蛋白多肽編碼序列由SEQ ID NO 10代表，編碼由SEQ ID NO 11代表的GFP。對(duì)于TK-2A-GFP，示例性核苷酸序列由SEQ ID NO 12代表，示例性氨基酸序列由SEQ ID NO 13代表。

如圖2(b)所示，另一個(gè)示例性AAV9衍生的重組AAV9輔助病毒包括整合的第二表達(dá)盒，EF1apromoter-loxp2272-loxp-TK-2A-GFP-loxp2272-loxp(其中兩對(duì)loxp，分別反向；命名為AAV-DIO-TK-GFP)；其中表達(dá)盒插入在AAV9基因組的AscI和NheI間。一個(gè)示例性loxp核苷酸序列由SEQ ID NO 14代表。在一些實(shí)施例中，一個(gè)功能性loxp變體與SEQ ID NO 14有至少90％，優(yōu)選95％，更優(yōu)選98％，甚至更優(yōu)選99％的同一性。TK編碼序列由SEQ ID NO 6代表，編碼由SEQ ID NO 7代表的TK。連接子多肽編碼序列由SEQ ID NO 8代表，編碼由SEQ ID NO 9代表的2A。第二熒光蛋白多肽編碼序列由SEQ ID NO 10代表，編碼由SEQ ID NO 11代表的GFP。對(duì)于TK-2A-GFP，示例性核苷酸序列由SEQ ID NO 12代表，示例性氨基酸序列由SEQ ID NO 13代表。

實(shí)施例

提供下面實(shí)施例的唯一目的是說(shuō)明本發(fā)明的原理；它們決不旨在限制或縮小本發(fā)明的范圍

實(shí)施例1

細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)

VERO-E6細(xì)胞(VERO，ATCC#CRL-1586)培養(yǎng)在Dulbecco培養(yǎng)基(DMEM)(含10％胎牛血清(FBS)和青霉素-鏈霉素(100單位/毫升青霉素和100μg/mL鏈霉素、Gibco))。

沿用常規(guī)程序，分離和培養(yǎng)來(lái)源于小鼠胚胎的海馬神經(jīng)元[20,21]。簡(jiǎn)而言之，在胚胎18.5天(E18.5)從C57BL/6小鼠的幼崽中解剖出海馬，切片，進(jìn)一步用胰酶/DNA酶I在37℃消化15分鐘。分離的神經(jīng)元用無(wú)菌漢克平衡鹽溶液洗滌(HBSS)洗滌，懸浮和培養(yǎng)在添加了2％B27，glutamax(25μm)和青霉素-鏈霉素(100單位/毫升和100微克/毫升)(GIBCO)神經(jīng)基本培養(yǎng)基中。每隔一天換一次培養(yǎng)基。

實(shí)施例2

構(gòu)建H129-G1

將HSV-1-H129基因組(GenBank GU734772.1)克隆至帶有綠色熒光蛋白基因的細(xì)菌人工染色體(BAC)上，得到H129-G1(如圖1b所示)。如附圖1(d)和(e)所示,具體主要步驟如下：

(2.1)提取H129-wt病毒基因組DNA

用野生型H129-wt病毒[22]以感染復(fù)數(shù)為1的病毒量感染VERO細(xì)胞，感染12小時(shí)后，刮下細(xì)胞，離心收集細(xì)胞沉淀，用solution I(10mM Tris,10mM EDTA,pH 8.0)溶液清洗一遍，再用0.5ml的solution I溶液(包含有0.25mg Proteinase K/ml(美國(guó)Roche公司)；0.6％十二烷基硫酸鈉(SDS)(國(guó)藥集團(tuán))；終濃度為1M的氯化鈉)重懸細(xì)胞沉淀，50℃孵育2小時(shí)，加入終濃度為10mg/ml的RNase I(日本TaKaRa公司)37℃孵育1小時(shí),最后再用酚氯仿(1:1)進(jìn)行抽提獲得核酸(DNA)沉淀，干燥后用一定量的無(wú)菌去離子水(100ul)重懸核酸沉淀。這樣溶解后的DNA中含有大量的野生型的H129-wt病毒基因組DNA。

(2.2)PCR分別擴(kuò)增左右同源臂

以野生型H129-wt病毒基因組為模版PCR分別擴(kuò)增左右同源重組臂，其中左臂(L-arm)序列全長(zhǎng)1605bp，位于HSV-1-H129基因組(GenBank:GU734772.1)中的No.45011-46616，右臂(R-arm)序列全長(zhǎng)1953bp,位于基因組中的No.46617-48570。PCR反應(yīng)體系(PrimeStar DNA Polymerase，TaKaRa公司)的總體積為50μl,包含10μl 5×buffer,4μl dNTP,1.5μl正向引物,1.5μl反向引物,0.5μl PrimeStar酶，1μl模板,和31.5μl水。其中左臂正向引物序列為:5’-cgggatccagactgacacattaaaaaacac-3’(SEQ ID NO 15),左臂反向引物序列:為5’-cccaagcttataacttcgtataatgtatgctatacgaagttataacacggaaggagacaataccg-3’(SEQ ID NO 16),右臂正向引物序列為5’-cccaagcttataacttcgtataatgtatgctatacgaagttattcagttagcctcccccatctc-3’(SEQ ID NO 17),右臂反向引物序列為:5’-cgggatcccttcggacctcgcgggggccgc-3’(SEQ ID NO 18)。擴(kuò)增條件為：1)94℃2min；2)98℃15s；3)55℃15s；4)72℃2min；5)72℃10min；6)16℃10min；步驟2-4循環(huán)30次。然后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖(西班牙Biowest公司)凝膠電泳，純化左右同源重組臂，純化步驟完全按照試劑盒(美國(guó)omega公司)說(shuō)明書來(lái)做。

(2.3)連接左右同源臂

將純化后的左右臂DNA分別用限制性內(nèi)切酶BamHI(TaKaRa公司)進(jìn)行單酶切，酶切反應(yīng)的總體積為50μl，DNA量為2μg，37度水浴反應(yīng)約4小時(shí)后，再用1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化，所得酶切純化后的左右同源臂DNA直接進(jìn)行連接反應(yīng)，其連接反應(yīng)總體積為10μl，包含1μl T4DNA Ligase(TaKaRa公司)，1μl 10X buffer，8μl左右臂DNA(濃度比為1:1，16℃反應(yīng)約4小時(shí)后，PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)的左臂和右臂(L+R)，其PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為50μl，包含10μl 5×buffer,4μl dNTP,1.5μl左臂正向引物(5’-cgggatccagactgacacattaaaaaacac-3(SEQ ID NO 13)),1.5μl右臂反向引物(5’-cgggatcccttcggacctcgcgggggccgc-3’(SEQ ID NO 14))，0.5μl PrimeStar酶，1ul模板,31.5μl水。擴(kuò)增條件為：1)94℃2min；2)98℃15s；3)55℃15s；4)72℃3min；5)72℃10min；6)16℃10min；步驟2-4循環(huán)30次。用1％瓊脂糖凝膠電泳純化全長(zhǎng)同源重組臂(L+R)DNA片段。

(2.4)構(gòu)建pUS-F6

將上述純化的全長(zhǎng)同源重組臂(L+R)DNA片段和環(huán)狀pUS-F5(SEQ ID NO 59)載體分別用HindⅢ(TaKaRa公司)內(nèi)切酶進(jìn)行單酶切；酶切反應(yīng)的總體積為50μl，包含2μg DNA，37℃水浴反應(yīng)約4小時(shí)后，再用1％瓊脂糖凝膠電泳，分別進(jìn)行純化；所得純化的線性pUS-F5載體和L+R DNA片段進(jìn)行連接反應(yīng)，其連接反應(yīng)總體積為10μl，包含1μl T4DNA Ligase(TaKaRa公司)，1μl 10X buffer，4μl L+R DNA片段和4μl線性pUS-F5載體；16℃反應(yīng)約4小時(shí)后直接轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)E.coli DN5α細(xì)胞中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，PCR鑒定及測(cè)序，連接成功的帶有左右臂同源序列的pUS-F5質(zhì)粒命名為pUS-F6.

(2.5)pUS-F6的線性化

使用質(zhì)粒抽提試劑盒(美國(guó)Promega公司)提取pUS-F6質(zhì)粒，得到環(huán)狀的pUS-F6質(zhì)粒后，接著用限制性內(nèi)切酶為BamHI進(jìn)行單酶切反應(yīng)；酶切反應(yīng)的總體積為50μl，包含2μg DNA，平行設(shè)置4管酶切反應(yīng)，37℃水浴反應(yīng)約4小時(shí)后，直接向每管酶切反應(yīng)中加入2倍的無(wú)水乙醇和20μl的醋酸鈉(3M)，混勻后放-80℃大約10分鐘，用少量的(20μl)無(wú)菌去離子水重懸DNA沉淀，最后使用NanoDrop 2000(美國(guó)Thermo Scientific公司)測(cè)定其濃度。

(2.6)將線性化pUS-F6質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞

轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞接種于6孔板后孵育過(guò)夜，轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞達(dá)到50-80％融合度。將2μg線性化pUS-F6質(zhì)粒DNA與不含血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)混勻，再加入10μl轉(zhuǎn)染試劑(SuperFect Transfection Reagent，德國(guó)Qiagen公司)，室溫孵育10-15分鐘，將轉(zhuǎn)染混合液加入6孔板，培養(yǎng)3-4小時(shí)后，PBS清洗一次，加入DMEM完全培養(yǎng)基(GIBCO)，CO₂培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)。

(2.7)H129-wt病毒的感染

上述步驟(2.6)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染5-6小時(shí)后，用H129-wt病毒感染293T細(xì)胞，感染復(fù)數(shù)為1-3(MOI＝1-3)，即刻放入37℃，5％的CO₂培養(yǎng)箱(Thermo Scientific)中培養(yǎng)。

(2.8)流式細(xì)胞分選

上述步驟(2.7)中病毒感染后24小時(shí)，在倒置熒光顯微鏡下(日本Nikon公司)觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，若陽(yáng)性率大于1℅即可準(zhǔn)備細(xì)胞的分選。首先用胰酶(GIBCO)消化293T細(xì)胞，PBS清洗一遍，然后用滅菌處理的300目濾膜過(guò)濾細(xì)胞懸浮液，將流過(guò)300目濾膜的293T細(xì)胞進(jìn)行流式分選，GFP表達(dá)陽(yáng)性的293T細(xì)胞單獨(dú)分選出來(lái)，與鋪好的VERO細(xì)胞共培養(yǎng)。

(2.9)H129-G1重組病毒基因組DNA的制備

上述步驟(2.8)中流式分選GFP陽(yáng)性的293T細(xì)胞與VERO細(xì)胞共培養(yǎng)大約48小時(shí)后，觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。當(dāng)GFP陽(yáng)性率大于20℅，H129-G1重組病毒基因組DNA通過(guò)上述步驟(2.1)所描述的方法制備。

(2.10)H129-G1感染性單克隆的初步篩選和鑒定

將上述步驟(2.9)中制備的H129-G1重組病毒DNA電轉(zhuǎn)化(1.6/1.8kv，25uF，200Ω，1mm)進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞DH10B(美國(guó)Invitrogen公司)中，涂布在含有氯霉素抗性(科密歐公司)的LB平板,37℃中培養(yǎng)36-48小時(shí)。PCR鑒定單克隆，所有的PCR反應(yīng)條件參照上述步驟(2.2)，鑒定的序列為H129-wt的基因，包括UL3、UL14、UL26、UL37、UL38、UL50、US3、US8和US12，它們的引物分別是UL3-F：TCGGTTTGAAAGGCATCG(SEQ ID NO 22)，UL3-R：GACAAGGTCGCCATCTGCT(SEQ ID NO 23)；UL14-F：

GGGCACGCGAGACTATCAGAG(SEQ ID NO 24)，UL14-R：TCATTCGCCATCGGGATAGTC(SEQ ID NO 25)；UL26-F：ATGGAGGAGCCCCTACCAGA(SEQ ID NO 26)，UL26-R：

TACCAAAGACCGGGGCGAAT(SEQ ID NO 27)；UL37-F：

TGGTAACTAGTTAACGGCAAGTCCG(SEQ ID NO 28)，UL37-R：

ATGCCGGGACTTAAGTGGCCGTATA(SEQ ID NO 29)；UL38-F：

ATGAAGACCAATCCGCTACCCGCA(SEQ ID NO 30)，UL38-R：

AACACTCGCGTTTCGGGTTTCAGT(SEQ ID NO 31)；UL50-F：

ATGAGTCAGTGGGGATCCGG(SEQ ID NO 32)，UL50-R：CCCGGAACGAACCCCAAGCT(SEQ ID NO 33)；US3-F：GCCAACGACCACATCCCT(SEQ ID NO 34)，US3R：

CAGCGGCAAACAAAGCAG(SEQ ID NO 35)；US8-F：GGGGTTTCTTCTCGGTGTTTG(SEQ ID NO 36)，US8-R：GCGGTGCTGATGGTAATGTG(SEQ ID NO 37)；US12-F：

AAATTGCCCTAGCACAGGGG(SEQ ID NO 38)，US12-R：GGTCTCTCCGGCGCACATAA(SEQ ID NO 39)，以H129-wt陽(yáng)性對(duì)照，鑒定結(jié)果如圖1(f)所示。

(2.11)拯救克隆化H129-G1感染性病毒

轉(zhuǎn)染前一天將VERO細(xì)胞傳代至6孔板，待細(xì)胞融合度為80％左右。以上述步驟(2.10)中鑒定的H129-G1感染性單克隆的DNA轉(zhuǎn)染VERO細(xì)胞。轉(zhuǎn)染混合液的制備如下：2μg環(huán)狀H129-G1DNA，10μl SuperFect Transfection Reagent，和無(wú)血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)基配成100μl混合液，室溫放置5-10分鐘后，再加入600μl無(wú)血清和抗生素的DMEM稀釋成轉(zhuǎn)染混合液。去掉細(xì)胞培養(yǎng)基，用預(yù)熱的PBS洗一遍細(xì)胞，然后直接加上轉(zhuǎn)染混合液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2-3小時(shí)后，吸去轉(zhuǎn)染混合液，用PBS清洗一次，最后加入DMEM完全培養(yǎng)基；H129-G1感染性單克隆轉(zhuǎn)染后48小時(shí)后開始出現(xiàn)細(xì)胞病變現(xiàn)象，置于倒置熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)病變處都可以觀察到綠色熒光，說(shuō)明我們的感染性單克隆的拯救是成功的，如圖2(b)所示。然后繼續(xù)培養(yǎng)直到細(xì)胞全部病變后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，即獲得H129-G1重組病毒，加入1％的DMSO于-80℃凍存。

(2.12)檢測(cè)重組病毒蛋白表達(dá)

VERO細(xì)胞種在100mm培養(yǎng)皿中后，在37℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁后，分別用H129-wt病毒和H129-G1病毒以MOI＝1感染細(xì)胞。37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中吸附2h后，用含2％胎牛血清的MEM培養(yǎng)基替換培養(yǎng)皿中的病毒接種液，感染24小時(shí)后，用胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞在1000rmp離心5分鐘。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞一遍，繼續(xù)離心去掉上清液。收集細(xì)胞沉淀放入液氮中冰凍10秒，作為檢測(cè)樣品，準(zhǔn)備進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)。

Western Blot實(shí)驗(yàn)的操作如下：往細(xì)胞沉淀中加入50μl裂解緩沖液，利用超聲破碎細(xì)胞，接著測(cè)定蛋白含量，加入5x上樣Buffer，按照同等蛋白量上樣(20μg)，進(jìn)行SDS-聚丙稀酰胺凝膠(PAGE)電泳。之后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，先用甲醇處理尼龍膜2分鐘，然后在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15分鐘后，開始轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜條件為恒流200mA,90分鐘(美國(guó)Bio-Red公司)。轉(zhuǎn)膜完畢后，即刻用TBST液洗膜3分鐘，再用5％的牛奶/TBST封閉1小時(shí)。接著用TBST洗膜3次后，分別孵育gD和gB特異性的單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)，洗膜后孵育二抗后并再次洗膜。最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影(美國(guó)Alpha公司)，結(jié)果如圖1(h)所示。

(2.13)H129-wt和重組病毒H129-G1的生長(zhǎng)曲線對(duì)比

將VERO細(xì)胞傳代至6孔板(美國(guó)corning公司),細(xì)胞融合度為60-80％。待細(xì)胞完全貼壁后，用H129-wt和H129-G1感染復(fù)數(shù)MOI為0.1的病毒量分別感染細(xì)胞(此時(shí)設(shè)為感染后0小時(shí))。孵育2小時(shí)后換掉培養(yǎng)基。用DMEM完全培養(yǎng)基開始培養(yǎng)感染后的細(xì)胞；然后分別在病毒感染后不同時(shí)間點(diǎn)2，6，12，24，36，48h收取樣本并保存于-80℃。當(dāng)所有的病毒樣品收集完成后按照以下步驟測(cè)定每個(gè)樣本的病毒滴度。

病毒滴度測(cè)定步驟如下:將VERO細(xì)胞傳代至12孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)滿，用培養(yǎng)基梯度稀釋H129-wt和H129-G1病毒，每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)，吸去12孔板里的培養(yǎng)基，PBS清洗一次，每孔加200μl病毒液。1～1.5h后，吸去病毒液，PBS清洗3次，再補(bǔ)加2ml完全培養(yǎng)基(含2％FBS)培養(yǎng)24～48h，密切觀察，直至最低濃度出現(xiàn)的噬斑數(shù)不再增加。棄去培養(yǎng)基，每孔中加入300μl染色劑,孵育后，用雙蒸水反復(fù)洗，然后數(shù)空斑計(jì)算滴度，結(jié)果如圖1(i)所示。

實(shí)施例3

構(gòu)建H129-△Tk-td

基于H129-BAC(H129-G1)同源重組改造得到H129-△Tk-td。圖1(c)顯示H129-△Tk-td的結(jié)構(gòu)構(gòu)造。

(3.1)Cassette構(gòu)建

通過(guò)PCR、酶切、連接、轉(zhuǎn)化將tdtomato克隆至載體pRK-zeo(SEQ ID NO 40)，構(gòu)建Cassette CMVpromoter-tdtomato-Zeo^R，正向引物為F:gcgtcgacatggtgagcaagggcgaggag-(SEQ ID NO 41),反向引物為R:cgggatccttacttgtacagctcgtccatg(SEQ ID NO 42)。PCR反應(yīng)體系(PrimeStar DNA Polymerase，TaKaRa公司)的總體積為50μl,包含10μl 5×buffer,4μl dNTP,1.5μl正向引物,1.5μl反向引物,0.5μl PrimeStar酶，1μl模板,和31.5μl水。擴(kuò)增條件為：1)95℃2min；2)98℃15s；3)55℃15s；4)72℃1m30s；5)72℃10min；6)16℃10min；步驟2-4循環(huán)30次。然后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖(西班牙Biowest公司)凝膠電泳，純化左右同源重組臂，純化步驟完全按照試劑盒(美國(guó)omega公司)說(shuō)明書來(lái)做。

將上述純化的PCR產(chǎn)物和pRK-zeo載體(SEQ ID NO 40)分別用Sal I和Not I(TaKaRa公司)限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切；酶切反應(yīng)的總體積為50μl，包含2μg DNA，37℃水浴反應(yīng)約4小時(shí)后，再用1％瓊脂糖凝膠電泳，分別進(jìn)行純化；所得酶切純化后的載體和PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行連接反應(yīng)，其連接反應(yīng)總體積為10μl，包含1μl T4DNA Ligase(TaKaRa公司)，1μl10X buffer，5μl PCR產(chǎn)物和3μl線性pRK-zeo載體；16℃反應(yīng)約4小時(shí)后直接轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)E.coli DN5α細(xì)胞中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，PCR鑒定及測(cè)序.

(3.2)含有H129-G1的活化大腸桿菌細(xì)胞的制備

(i)將含有H129-G1的E.coli DY380在含有相應(yīng)抗性的LB固體平板上劃線，32℃培養(yǎng)過(guò)夜；

(ii)挑取單克隆放入5ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，搖床，32℃培養(yǎng)過(guò)夜；

(iii)以1：100的比例將其轉(zhuǎn)移到100ml液體培養(yǎng)基中，搖床，32℃培養(yǎng)，OD600值在0.4-0.6左右(0.55-0.6最佳)，大約需要3小時(shí)；

(iv)42℃水浴15分鐘；

(v)取出細(xì)菌懸浮液置于冰上10分鐘左右；

(vi)4000rpm，4℃，10分鐘，離心去上清；

(vii)用超純水重懸細(xì)菌沉淀，4000rpm，4℃，10分鐘，離心去上清；

(viii)用含有10﹪的甘油重懸細(xì)菌沉淀，4000rpm，4℃，10分鐘，離心去上清；

(ix)重復(fù)步驟(viii)一遍。

(x)800μl含有10﹪的甘油的純凈水重懸細(xì)菌沉淀，以80μl每管分裝細(xì)菌懸浮液，液氮處理冷凍，放入-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

(3.3)PCR擴(kuò)增各cassette

PCR的反應(yīng)體系(PrimeStar DNA Polymerase，日本TaKaRa公司)總體積為50μl，包括10μl 5×buffer,4μl dNTP,1.5μl正向引物，1.5μl反向引物，0.5μl PrimeStar酶，1μl模板，31.5μl水。引物序列如下表1所示。擴(kuò)增條件為：1)95℃2min，2)98℃15s，3)55℃15s，4)72℃3min，5)72℃10min，6)16℃10min，步驟2-4循環(huán)30次。然后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖(西班牙Biowest公司)凝膠電泳，純化步驟完全按照試劑盒(美國(guó)Omega公司)說(shuō)明書，最后用去離子水來(lái)洗脫DNA。

表1. PCR擴(kuò)增cassette的正向和反向引物序列

(3.4)電轉(zhuǎn)化Cassette CMV-tdtomato-zeo和同源重組得到H129-△Tk-td

將300ng的Cassette DNA(約5-15μl)加入步驟(3.2)制備的含有H129-G1的活化大腸桿菌細(xì)胞中混勻；電擊條件為：1.6/1.8kv，25uF，200Ω；電擊完畢后迅速加入培養(yǎng)基混勻細(xì)菌并轉(zhuǎn)移到1.5ml的EP管中在32℃培養(yǎng)1-2小時(shí)；將細(xì)菌均勻的涂布在固體LB平板(含有相應(yīng)篩選抗性)，32℃培養(yǎng)36-48h；挑取單克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證；正向引物(F)為：acctctgaaagaggaacttgg(SEQ ID NO 45)；反向引物(R)為：gtcaacagcgtgccgcagatc(SEQ ID NO 46)。

(3.5)拯救H129-△Tk-td病毒

將鑒定正確的含有H129-△Tk-td單克隆細(xì)菌細(xì)胞分別接種200ml的LB培養(yǎng)基，32℃培養(yǎng)過(guò)夜，然后用試劑盒(購(gòu)自MN公司)提取DNA，按照說(shuō)明書操作，最后用100μl去離子水溶解.轉(zhuǎn)染前一天將VERO細(xì)胞傳代至6孔板，待細(xì)胞融合度為80％左右。以上述提取的DNA轉(zhuǎn)染VERO細(xì)胞。轉(zhuǎn)染混合液的制備如下：2μg環(huán)狀H129-△Tk-td DNA，10μl SuperFect Transfection Reagent，和無(wú)血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)基配成100μl混合液，室溫放置5-10分鐘后，再加入600μl無(wú)血清和抗生素的DMEM稀釋成轉(zhuǎn)染混合液。去掉細(xì)胞培養(yǎng)基，用預(yù)熱的PBS洗一遍細(xì)胞，然后直接加上轉(zhuǎn)染混合液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2-3小時(shí)后，吸去轉(zhuǎn)染混合液，用PBS清洗一次，最后加入DMEM完全培養(yǎng)基；H129-△Tk-td感染性單克隆轉(zhuǎn)染后48小時(shí)后開始出現(xiàn)細(xì)胞病變現(xiàn)象，置于倒置熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)病變處都可以觀察到綠色熒光，說(shuō)明我們的感染性單克隆的拯救是成功的。然后繼續(xù)培養(yǎng)直到細(xì)胞全部病變后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，即獲得H129-△Tk-td重組病毒，加入1％的DMSO于-80℃凍存。

(3.6)H129-△Tk-td和H129-G1在VERO細(xì)胞和神經(jīng)元(體外)中生長(zhǎng)對(duì)比

生長(zhǎng)曲線對(duì)比的操作參照步驟(2.13)?，F(xiàn)參照?qǐng)D1(j)，圖示H129-G1和H129-△Tk-td在VERO細(xì)胞和神經(jīng)元中生長(zhǎng)曲線。H129-G1,H129-△Tk-td感染VERO細(xì)胞和神經(jīng)元的MOI為0.02，在指定的時(shí)間的上清液中的子代病毒，由空斑形成試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)。所顯示的是從3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值(標(biāo)準(zhǔn)差)。

實(shí)施例4

構(gòu)建AAV-TK-2A-GFP

AAV-TK-2A-GFP的構(gòu)建在AAV載體(addgene編號(hào)20298)的BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ之間插入TK-2A-GFP序列。

PCR反應(yīng)體系(PrimeStar DNA Polymerase，TaKaRa公司)總體積為50μl，包括10μl 5×buffer,4μl dNTP,1.5μl正向引物,1.5μl反向引物,0.5μl PrimeStar酶，1μl模版，31.5μl H₂O。擴(kuò)增條件為：1)95℃2min，2)98℃15s，3)55℃15s，4)72℃2min，5)72℃10min，6)16℃10min，步驟2-4循環(huán)30次。然后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖(西班牙Biowest公司)凝膠電泳，純化步驟完全按照試劑盒(美國(guó)Omega公司)說(shuō)明書來(lái)做。引物序列如下：正向引物:cgggatccatggcttcgtacccctgccatc(SEQ ID NO 47)；反向引物:cggaattcttacttgtacagctcgtccatg(SEQ ID NO 48)。

將上述純化的PCR產(chǎn)物和AAV載體分別用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ(TaKaRa公司)限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切；酶切反應(yīng)的總體積為50μl，包含2μg DNA，37℃水浴反應(yīng)約4小時(shí)后，再用1％瓊脂糖凝膠電泳，分別進(jìn)行純化；所得酶切純化后的載體和PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行連接反應(yīng)，其連接反應(yīng)總體積為10μl，包含1μl T4DNA Ligase(TaKaRa公司)，1μl 10X buffer，5μl PCR產(chǎn)物和3μl線性AAV載體；16℃反應(yīng)約4小時(shí)后直接轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)E.coli DN5α細(xì)胞中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，PCR鑒定及測(cè)序。

實(shí)施例5

構(gòu)建AAV-DIO-TK-2A-GFP

AAV-DIO-TK-2A-GFP的構(gòu)建在AAV載體(addgene編號(hào)20298)的Asc Ⅰ和Nhe Ⅰ之間插入TK-2A-GFP序列。

PCR反應(yīng)體系(PrimeStar DNA Polymerase，TaKaRa公司)總體積為50μl，包括10μl 5×buffer,4μl dNTP,1.5μl Tk-F,1.5μl Tk-R,1.5μl GFP-F,1.5μl GFP-R,0.5μl PrimeStar酶，1μl每個(gè)模版，27.5μl H₂O。擴(kuò)增條件為：1)95℃2min，2)98℃15s，3)55℃15s，4)72℃2min，5)72℃10min，6)16℃10min，步驟2-4循環(huán)30次。然后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖(西班牙Biowest公司)凝膠電泳，純化步驟完全按照試劑盒(美國(guó)Omega公司)說(shuō)明書來(lái)做。引物序列如下：Tk-F:ctagctagc atggcttcgtacccctgccatc(SEQ ID NO 49)；Tk-R:attctcctcgacgtcaccgcatgttagcagacttcc tctgccctcgttagcctcccccatctcccg(SEQ ID NO 50)；GFP-F：ggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaat cctggcccagtgagcaagggcgaggagctg(SEQ ID NO 51):GFP-R：ttggcgcgccttacttgtacagctcgtccatg(SEQ ID NO 52)。

將上述純化的PCR產(chǎn)物和AAV載體分別用Asc Ⅰ和Nhe Ⅰ(TaKaRa公司)限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切；酶切反應(yīng)的總體積為50μl，包含2μg DNA，37℃水浴反應(yīng)約4小時(shí)后，再用1％瓊脂糖凝膠電泳，分別進(jìn)行純化；所得酶切純化后的載體和PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行連接反應(yīng)，其連接反應(yīng)總體積為10μl，包含1μl T4DNA Ligase(TaKaRa公司)，1μl 10X buffer，5μl PCR產(chǎn)物和3μl線性AAV載體；16℃反應(yīng)約4小時(shí)后直接轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)E.coli DN5α細(xì)胞中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，PCR鑒定及測(cè)序。

實(shí)施例6

AAV輔助病毒的包裝

質(zhì)粒AAV-DIO-TK-2A-GFP和AAV-TK-2A-GFP提供給和元生物技術(shù)(上海)有限公司包裝，病毒滴度約為AAV-DIO-TK-2A-GFP：1X10¹³v.g./ml

AAV-TK-2A-GFP：5X10¹²v.g./ml。

實(shí)施例7

腦內(nèi)注射病毒

用立體定位系統(tǒng)，在BSL-2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，按照批準(zhǔn)的SOP，對(duì)成年野生型C57BL/6，DAT-Cre小鼠和PV-Cre小鼠進(jìn)行腦內(nèi)注射病毒。DAT-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠在多巴胺(DA)神經(jīng)元中特異表達(dá)Cre重組酶，表達(dá)受多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(DAT)啟動(dòng)子的控制；PV Cre轉(zhuǎn)基因小鼠在PV(光伏)中間神經(jīng)元表達(dá)Cre重組酶。都是C57BL/6背景。麻醉動(dòng)物的腦內(nèi)注射病毒用到機(jī)動(dòng)立體定向器(Stoelting Co.)。根據(jù)小鼠腦地圖，用內(nèi)外側(cè)(ML),前后(AP)和背腹(DV)與Bregma的距離測(cè)定小鼠核的確切位置(7)(8)。當(dāng)有注明時(shí)，Alexa Fluor 594共軛霍亂毒素B亞單位(CTB)(Invitrogen)是隨著注入病毒。

腦內(nèi)注射病毒，應(yīng)用到8-10周齡的雄性小鼠時(shí)，沒(méi)有隨機(jī)化或致盲。病毒注射后每天監(jiān)測(cè)動(dòng)物，如果觀察到嚴(yán)重的疾病，實(shí)驗(yàn)將被終止，動(dòng)物將被排除在外。

實(shí)施例8

檢查神經(jīng)環(huán)路示蹤

利用切片機(jī)(HM550，Thermo)冰凍切片獲得冠狀腦切片，厚度40μm。一抗是兔抗紅色熒光蛋白的多克隆抗體(Takara，貓。#632496)，二抗是Alexa Fluor 594耦合的羊抗兔IgG(H+L)抗體(Invitrogen，#R37117)；tdTomato信號(hào)由一抗和二抗進(jìn)行放大。細(xì)胞核染色用Hoechst染料33342(Thermo Fisher Scientific，#H3570)，神經(jīng)元細(xì)胞用兔抗NeuN染色(Abcam,#ab104225)和Alexa Fluor 647標(biāo)記的羊抗兔抗體(Life Technologies，#A-21245)。使用尼康的A1R MP+激光共聚焦顯微鏡配備高分辨率快速振鏡掃描得到圖像。

實(shí)施例9

雙光子熒光顯微光學(xué)切片成像(fMOST)

fMOST成像標(biāo)本嵌入9100甲基丙烯酸甲酯(MMA,Electron Microscopy Sciences)，如前所述([24])。簡(jiǎn)而言之，PFA固定的動(dòng)物大腦用0.01M PBS沖洗12h，用一系列醇(50％，75％，95％，100％和100％的乙醇，每個(gè)濃度2h)完全脫水，接著浸泡在二甲苯兩次(每次2h)以至透明。然后滲透標(biāo)本，轉(zhuǎn)移到明膠膠囊和浸漬在聚合溶液中。最后，帶試樣的膠囊被封閉和保存在干燥室，暗處，4℃，72h。聚合完成后，使用fMOST系統(tǒng)全腦成像，數(shù)據(jù)采集率的像素大小為0.5μm×0.5μm×1μm[25,26]。最后，對(duì)獲得的數(shù)據(jù)集的圖像疊加轉(zhuǎn)化為大數(shù)據(jù)，應(yīng)用Amira軟件(Visage Software,USA)進(jìn)行三維圖像重建[27]。

實(shí)施例10

H129-G1和H129-ΔTK-tdT的生長(zhǎng)比較

為了生長(zhǎng)曲線，用感染復(fù)數(shù)為0.01的H129-G1和H129-ΔTK-tdT感染鼠胎海馬神經(jīng)元和VERO細(xì)胞。在所示感染后時(shí)間點(diǎn)，用標(biāo)準(zhǔn)噬斑形成法測(cè)定上清中病毒滴度(圖1(j))。顯示的是來(lái)自3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差。H129-ΔTK-tdT在VERO細(xì)胞中顯示輕度生長(zhǎng)延遲，但是在培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中，有嚴(yán)重受損的復(fù)制動(dòng)力學(xué)。

實(shí)施例11

繪制野生型小鼠來(lái)自VPM的直接投射

現(xiàn)參照?qǐng)D3，用本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的順行跨單級(jí)突觸病毒示蹤系統(tǒng)繪制野生型小鼠來(lái)自VPM的直接投射，其中所述順行跨單級(jí)突觸病毒示蹤系統(tǒng)包括AAV9-TK-GFP和H129-ΔTK-tdT。(a)為了Cre-獨(dú)立單級(jí)突觸示蹤，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的時(shí)間線示意圖。(b-c)對(duì)照組，單獨(dú)輔助病毒和缺陷型病毒。AAV9-TK-GFP(3.5x10⁸v.g.,350nl)和H129-ΔTK-tdT(5x10⁵pfu,250nl)，單獨(dú)注射到野生型C57BL/6的VMP。照片在感染后21天(b)和10天(c)。注射區(qū)域用白色箭頭頭標(biāo)示。(d)H129-ΔTK-tdT傳播的起始神經(jīng)元。AAV9-TK-GFP和H129-ΔTK-tdT在第1和22天順序地注射到野生型C57BL/6的VMP。第25天獲取腦組織；腦切片用Hoechst33342和抗dsRed抗體染色。注射點(diǎn)的放大形象(d1)，代表區(qū)域進(jìn)一步放大(d2)。白色箭頭頭標(biāo)示tdT和GFP雙表達(dá)的神經(jīng)元。(e-f)示蹤VPM支配的腦區(qū)。第32天，VPM支配的腦區(qū)的代表性示蹤形象，包括nRT(e1)和S1(f1-3)。被AAV9-TK-GFP標(biāo)記的VPM投射纖維同樣存在(e2)。

為了確認(rèn)H129-ΔTK-tdT特異性單級(jí)突觸順行示蹤能力，AAV9-TK-GFP(3.5x10⁸v.g.,350nl)和H129-ΔTK-tdT(5x10⁵pfu,250nl)，注射到野生型C57BL/6的VMP(圖3a)。當(dāng)單獨(dú)注射時(shí)，VPM中的神經(jīng)元相應(yīng)的標(biāo)記上GFP或tdT(圖3b-c)。標(biāo)記細(xì)胞的位置和分布局限在注射點(diǎn)，表明TK缺失阻止H129-ΔTK-tdT跨神經(jīng)傳播。為了順行單級(jí)突觸示蹤，AAV9-TK-GFP注射到VPM(第一天)，接著21天后(第22天)注射H129-ΔTK-tdT到同一位點(diǎn)。注射H129-ΔTK-tdT三天后(第25天)，在注射位點(diǎn)觀察到雙表達(dá)GFP和tdT的神經(jīng)元。這些雙標(biāo)記的神經(jīng)元是始發(fā)細(xì)胞，在其中AAV9-TK-GFP輔助病毒提供TK，補(bǔ)充和幫助H129-ΔTK-tdT產(chǎn)生病毒示蹤顆粒(圖3d)。產(chǎn)生的病毒示蹤顆粒傳播到下一個(gè)，并且是唯一的下一個(gè)順行神經(jīng)元。到H129-ΔTK-tdT感染后10天(第32天)，tdT標(biāo)記的神經(jīng)元在nRT檢測(cè)到(圖3(e1))，表明H129-ΔTK-tdT從VPM到nRT神經(jīng)元的通過(guò)一個(gè)突觸的順行傳播?；趦?nèi)在的GFP信號(hào)，可以看見起源于注射的VPM的軸突纖維(圖3(e2))。在S1,稀疏但清晰TdT標(biāo)記的神經(jīng)元可觀察到(圖3(f))，其中少數(shù)GFP標(biāo)記的纖維也同樣存在。因此，H129-ΔTK-tdT和AAV9-TK-GFP構(gòu)成一個(gè)新的順行單級(jí)突觸示蹤系統(tǒng)。為更好地可視化，跨突觸的tdT信號(hào)由抗體染色放大。

實(shí)施例12

繪制DAT-Cre小鼠來(lái)自VTA-DA神經(jīng)元的直接投射

現(xiàn)參照?qǐng)D4，用本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的順行跨單級(jí)突觸病毒示蹤系統(tǒng)繪制DAT-Cre小鼠來(lái)自VTA-DA神經(jīng)元的直接投射，其中所述順行跨單級(jí)突觸病毒示蹤系統(tǒng)包括AAV9-DIO-TK-GFP和H129-ΔTK-tdT。(a)為了Cre依賴單級(jí)突觸示蹤，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的時(shí)間線示意圖。(b)在VTA中來(lái)自DA神經(jīng)元的直接投射的示意圖。DA神經(jīng)元，多巴胺能神經(jīng)元；VTA，中腦腹側(cè)被蓋區(qū)；Hipp CA3，在海馬的CA3區(qū)；mPFC，前額葉皮質(zhì)；NAc，內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)；Amy，杏仁核。(c-d)對(duì)照組，單獨(dú)輔助病毒和缺陷型病毒。AAV9-DIO-TK-GFP(10⁹v.g.,350nl)和H129-ΔTK-tdT(10⁶pfu,250nl)，單獨(dú)注射到DAT-Cre小鼠的VTA。照片在感染后21天(c)和10天(d)。注射區(qū)域用白色箭頭頭標(biāo)示。(e)H129-ΔTK-tdT傳播的起始神經(jīng)元。AAV9-DIO-TK-GFP和H129-ΔTK-tdT在第1和22天順序地注射到DAT-Cre小鼠的VTA。第25天獲取腦組織；腦切片用Hoechst33342和抗dsRed抗體染色。注射點(diǎn)的放大形象(e1)，代表區(qū)域進(jìn)一步放大(e2和e3)。白色箭頭頭標(biāo)示tdT和GFP雙表達(dá)的神經(jīng)元。(f-h)示蹤由VTA-DA神經(jīng)元支配的腦區(qū)。第32天，VTA-DA神經(jīng)元支配的腦區(qū)的代表性示蹤形象。代表性形象有Hipp(f1和f4)，Amy(f4-5)，mPFC(g)和NAc(h)；框內(nèi)區(qū)域用更高放大顯示。

H129-ΔTK-tdT與AAV9-DIO-TK-GFP結(jié)合使用，繪制Cre表達(dá)的神經(jīng)元的直接后突觸靶標(biāo)(圖4(a))。為了這個(gè)目的，我們使用DAT Cre轉(zhuǎn)基因小鼠，多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(DAT)啟動(dòng)子控制下在多巴胺(DA)神經(jīng)元中特異性表達(dá)Cre重組酶。AAV9-DIO-TK-GFP和H129-ΔTK-tdT順序地注射到VTA，目標(biāo)DA神經(jīng)元，其直接投射到Hipp CA3，mPFC，NAc和Amy(圖4(b))[28]。注射AAV9-DIO-TK-GFP或者H129-ΔTK-tdT到VTA，導(dǎo)致只在VTA內(nèi)標(biāo)記神經(jīng)元(圖4(c)-(d))。當(dāng)兩個(gè)表達(dá)順序注射時(shí)，共表達(dá)GFP和tdT的神經(jīng)元在VTA觀察到(圖4(a),(c))。由于AAV9-DIO-TK-GFP只在Cre表達(dá)的細(xì)胞中表達(dá)GFP和TK，含有AAV9-DIO-TK-GFP和H129-ΔTK-tdT的黃色神經(jīng)元代表DA神經(jīng)元，從此順行表達(dá)示蹤開始。與已知VTA-DA神經(jīng)元投射規(guī)律吻合，H129-ΔTK-tdT成功地在Amy，Hipp-CA3，mPFC和NAc中傳播和標(biāo)記神經(jīng)元(圖4(f)-(g))。

實(shí)施例13

繪制PV-Cre小鼠來(lái)自nRT-PV神經(jīng)元的直接投射

現(xiàn)參照?qǐng)D5，用本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的順行跨單級(jí)突觸病毒示蹤系統(tǒng)繪制PV-Cre小鼠來(lái)自nRT-PV神經(jīng)元的直接投射，其中所述順行跨單級(jí)突觸病毒示蹤系統(tǒng)包括AAV9-DIO-TK-GFP和H129-ΔTK-tdT。(a)來(lái)自nRT-PV直接投射的圖示。PV神經(jīng)元，小白蛋白神經(jīng)元；nRT，丘腦網(wǎng)狀核；PF，丘腦束旁核；PAG、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)；RMC，紅核大細(xì)胞部；VM，腹內(nèi)側(cè)核；Po，丘腦后核群；VP，腹后核；RPC，紅核，小細(xì)胞部分。(b-c)對(duì)照組，單獨(dú)輔助病毒和缺陷型病毒。AAV9-DIO-TK-GFP(10⁹v.g.,350nl)和H129-ΔTK-tdT(10⁶pfu,250nl)，單獨(dú)注射到PV-Cre小鼠的nRT-PV。照片在感染后21天(b)和10天(c)。注射區(qū)域用白色箭頭頭標(biāo)示。(d)病毒傳播的起始神經(jīng)元。AAV9-DIO-TK-GFP和H129-ΔTK-tdT在第1和22天順序地注射到PV-Cre小鼠的nRT-PV。第25天獲取圖像。顯示nRT注射點(diǎn)的圖像，代表區(qū)域進(jìn)一步放大(d1)。白色箭頭標(biāo)示tdT和GFP雙表達(dá)的神經(jīng)元。(f-j)由nRT-PV神經(jīng)元支配的腦區(qū)的代表圖像。由nRT-PV神經(jīng)元支配的腦區(qū)的代表圖像在第32天獲得。顯示VP，VM，Po(f)、PF(g)、PAG(h)、RPC(i)和RMC(j)的代表性圖像，框內(nèi)區(qū)域相應(yīng)放大。這在PV-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠上驗(yàn)證了這種單級(jí)突觸病毒示蹤系統(tǒng)。

盡管本發(fā)明參照特異的實(shí)施方式來(lái)描述，但是將被理解的是，實(shí)施例是說(shuō)明性的，本發(fā)明的范圍并不局限于此。本發(fā)明的替代實(shí)施例對(duì)本發(fā)明涉及的領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將變得顯而易見。這樣的替代實(shí)施例都被認(rèn)為是包含在本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的范圍由所附的權(quán)利要求被描述，由前面的描述所支持。

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SEQUENCE LISTING

<110> Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences

中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所

<120> ANTEROGRADE MONOSYNAPTIC TRANSNEURONAL TRACER SYSTEM

順行跨單級(jí)突觸神經(jīng)示蹤系統(tǒng)

<130> 1003.P002

<160> 52

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1431

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> tdtomato

<400> 1

atggtgagca agggcgagga ggtcatcaaa gagttcatgc gcttcaaggt gcgcatggag 60

ggctccatga acggccacga gttcgagatc gagggcgagg gcgagggccg cccctacgag 120

ggcacccaga ccgccaagct gaaggtgacc aagggcggcc ccctgccctt cgcctgggac 180

atcctgtccc cccagttcat gtacggctcc aaggcgtacg tgaagcaccc cgccgacatc 240

cccgattaca agaagctgtc cttccccgag ggcttcaagt gggagcgcgt gatgaacttc 300

gaggacggcg gtctggtgac cgtgacccag gactcctccc tgcaggacgg cacgctgatc 360

tacaaggtga agatgcgcgg caccaacttc ccccccgacg gccccgtaat gcagaagaag 420

accatgggct gggaggcctc caccgagcgc ctgtaccccc gcgacggcgt gctgaagggc 480

gagatccacc aggccctgaa gctgaaggac ggcggccact acctggtgga gttcaagacc 540

atctacatgg ccaagaagcc cgtgcaactg cccggctact actacgtgga caccaagctg 600

gacatcacct cccacaacga ggactacacc atcgtggaac agtacgagcg ctccgagggc 660

cgccaccacc tgttcctggg gcatggcacc ggcagcaccg gcagcggcag ctccggcacc 720

gcctcctccg aggacaacaa catggccgtc atcaaagagt tcatgcgctt caaggtgcgc 780

atggagggct ccatgaacgg ccacgagttc gagatcgagg gcgagggcga gggccgcccc 840

tacgagggca cccagaccgc caagctgaag gtgaccaagg gcggccccct gcccttcgcc 900

tgggacatcc tgtcccccca gttcatgtac ggctccaagg cgtacgtgaa gcaccccgcc 960

gacatccccg attacaagaa gctgtccttc cccgagggct tcaagtggga gcgcgtgatg 1020

aacttcgagg acggcggtct ggtgaccgtg acccaggact cctccctgca ggacggcacg 1080

ctgatctaca aggtgaagat gcgcggcacc aacttccccc ccgacggccc cgtaatgcag 1140

aagaagacca tgggctggga ggcctccacc gagcgcctgt acccccgcga cggcgtgctg 1200

aagggcgaga tccaccaggc cctgaagctg aaggacggcg gccactacct ggtggagttc 1260

aagaccatct acatggccaa gaagcccgtg caactgcccg gctactacta cgtggacacc 1320

aagctggaca tcacctccca caacgaggac tacaccatcg tggaacagta cgagcgctcc 1380

gagggccgcc accacctgtt cctgtacggc atggacgagc tgtacaagta a 1431

<210> 2

<211> 476

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> tdtomato

<400> 2

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Val Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys

1 5 10 15

Val Arg Met Glu Gly Ser Met Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys

35 40 45

Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro

50 55 60

Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile

65 70 75 80

Pro Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg

85 90 95

Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Leu Val Thr Val Thr Gln Asp Ser

100 105 110

Ser Leu Gln Asp Gly Thr Leu Ile Tyr Lys Val Lys Met Arg Gly Thr

115 120 125

Asn Phe Pro Pro Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp

130 135 140

Glu Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly

145 150 155 160

Glu Ile His Gln Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Leu Val

165 170 175

Glu Phe Lys Thr Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly

180 185 190

Tyr Tyr Tyr Val Asp Thr Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp

195 200 205

Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ser Glu Gly Arg His His Leu

210 215 220

Phe Leu Gly His Gly Thr Gly Ser Thr Gly Ser Gly Ser Ser Gly Thr

225 230 235 240

Ala Ser Ser Glu Asp Asn Asn Met Ala Val Ile Lys Glu Phe Met Arg

245 250 255

Phe Lys Val Arg Met Glu Gly Ser Met Asn Gly His Glu Phe Glu Ile

260 265 270

Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys

275 280 285

Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu

290 295 300

Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala

305 310 315 320

Asp Ile Pro Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp

325 330 335

Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Leu Val Thr Val Thr Gln

340 345 350

Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Thr Leu Ile Tyr Lys Val Lys Met Arg

355 360 365

Gly Thr Asn Phe Pro Pro Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met

370 375 380

Gly Trp Glu Ala Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu

385 390 395 400

Lys Gly Glu Ile His Gln Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr

405 410 415

Leu Val Glu Phe Lys Thr Ile Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu

420 425 430

Pro Gly Tyr Tyr Tyr Val Asp Thr Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn

435 440 445

Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ser Glu Gly Arg His

450 455 460

His Leu Phe Leu Tyr Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

465 470 475

<210> 3

<211> 472

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ZeoR including an EM7 promoter

<400> 3

caagtttcga ggtcgagtgt cagtcctgct cctcggccac gaagtgcacg cagttgccgg 60

ccgggtcgcg cagggcgaac tcccgccccc acggctgctc gccgatctcg gtcatggccg 120

gcccggaggc gtcccggaag ttcgtggaca cgacctccga ccactcggcg tacagctcgt 180

ccaggccgcg cacccacacc caggccaggg tgttgtccgg caccacctgg tcctggaccg 240

cgctgatgaa cagggtcacg tcgtcccgga ccacaccggc gaagtcgtcc tccacgaagt 300

cccgggagaa cccgagccgg tcggtccaga actcgaccgc tccggcgacg tcgcgcgcgg 360

tgagcaccgg aacggcactg gtcaacttgg ccatggttta gttcctcacc ttgtcgtatt 420

atactatgcc gatatactat gccgatgatt aattgtcaac acggtccgtt cc 472

<210> 4

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ZeoR

<400> 4

Met Ala Lys Leu Thr Ser Ala Val Pro Val Leu Thr Ala Arg Asp Val

1 5 10 15

Ala Gly Ala Val Glu Phe Trp Thr Asp Arg Leu Gly Phe Ser Arg Asp

20 25 30

Phe Val Glu Asp Asp Phe Ala Gly Val Val Arg Asp Asp Val Thr Leu

35 40 45

Phe Ile Ser Ala Val Gln Asp Gln Val Val Pro Asp Asn Thr Leu Ala

50 55 60

Trp Val Trp Val Arg Gly Leu Asp Glu Leu Tyr Ala Glu Trp Ser Glu

65 70 75 80

Val Val Ser Thr Asn Phe Arg Asp Ala Ser Gly Pro Ala Met Thr Glu

85 90 95

Ile Gly Glu Gln Pro Trp Gly Arg Glu Phe Ala Leu Arg Asp Pro Ala

100 105 110

Gly Asn Cys Val His Phe Val Ala Glu Glu Gln Asp

115 120

<210> 5

<211> 10094

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BAC

<400> 5

cgctcagaag aactcgtcaa gaaggcgata gaaggcgatg cgctgcgaat cgggagcggc 60

gataccgtaa agcacgagga agcggtcagc ccattcgccg ccaagctctt cagcaatatc 120

acgggtagcc aacgctatgt cctgatagcg gtccgccaca cccagccggc cacagtcgat 180

gaatccagaa aagcggccat tttccaccat gatattcggc aagcaggcat cgtcatgggt 240

cacgacgaga tcctcgccgt cgggcatgct cgccttgagc ctggcgaaca gttcggctgg 300

cgcgagcccc tgatgctctt cgtccagatc atcctgatcg acaagaccgg cttccatccg 360

agtacgtgct cgctcgatgc gatgtttcgc ttggtggtcg aatgggcagg tagccggatc 420

aagcgtatgc agccgccgca ttgcatcagc catgatggat actttctcgg caggagcaag 480

gtgagatgac aggagatcct gccccggcac ttcgcccaat agcagccagt cccttcccgc 540

ttcagtgaca acgtcgagca cagctgcgca aggaacgccc gtcgtggcca gccacgatag 600

ccgcgctgcc tcgtcttgca gttcattcag ggcaccggac aggtcggtct tgacaaaaag 660

aaccgggcgc ccctgcgctg acagccggaa cacggcggca tcagagcagc cgattgtctg 720

ttgtgcccag tcatagccga atagcctctc cacccaagcg gccggagaac ctgcgtgcaa 780

tccatcttgt tcaatcattt tagcttcctt agctcctgaa aatctcgata actcaaaaaa 840

tacgcccggt agtgatctta tttcattatg gtgaaagttg gaacctctta cgtgccgatc 900

aacgtctcat tttcgccaaa agttggccca gggcttcccg gtatcaacag ggacaccagg 960

atttatttat tctgcgaagt gatcttccgt cacaggtatt tattcgcgat aagctcatgg 1020

agcggcgtaa ccgtcgcaca ggaaggacag agaaagcgcg gatctgggaa gtgacggaca 1080

gaacggtcag gacctggatt ggggaggcgg ttgccgccgc tgctgctgac ggtgtgacgt 1140

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ccggtatacc gctgaaagtt ctgcaaagcc tgatgggaca taagtccatc agttcaacgg 1260

aagtctacac gaaggttttt gcgctggatg tggctgcccg gcaccgggtg cagtttgcga 1320

tgccggagtc tgatgcggtt gcgatgctga aacaattatc ctgagaataa atgccttggc 1380

ctttatatgg aaatgtggaa ctgagtggat atgctgtttt tgtctgttaa acagagaagc 1440

tggctgttat ccactgagaa gcgaacgaaa cagtcgggaa aatctcccat tatcgtagag 1500

atccgcatta ttaatctcag gagcctgtgt agcgtttata ggaagtagtg ttctgtcatg 1560

atgcctgcaa gcggtaacga aaacgatttg aatatgcctt caggaacaat agaaatcttc 1620

gtgcggtgtt acgttgaagt ggagcggatt atgtcagcaa tggacagaac aacctaatga 1680

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atccatgctg gttctagaga aggtgttgtg acaaattgcc ctttcagtgt gacaaatcac 1980

cctcaaatga cagtcctgtc tgtgacaaat tgcccttaac cctgtgacaa attgccctca 2040

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caatctaaaa acttgtcaca cttcacatgg atctgtcatg gcggaaacag cggttatcaa 2160

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ctatgaatct tttccttggt ttatcaaacg tgcgcacagt ccatccagag ggctttacag 2520

tgtacatatc aacccatatc tcattccctt ctttatcggg ttacagaacc ggtttacgca 2580

gtttcggctt agtgaaacaa aagaaatcac caatccgtat gccatgcgtt tatacgaatc 2640

cctgtgtcag tatcgtaagc cggatggctc aggcatcgtc tctctgaaaa tcgactggat 2700

catagagcgt taccagctgc ctcaaagtta ccagcgtatg cctgacttcc gccgccgctt 2760

cctgcaggtc tgtgttaatg agatcaacag cagaactcca atgcgcctct catacattga 2820

gaaaaagaaa ggccgccaga cgactcatat cgtattttcc ttccgcgata tcacttccat 2880

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tctgacctac tgagggtaat ttgtcacagt tttgctgttt ccttcagcct gcatggattt 3000

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cagaacagtt cttctttgct tcctcgccag ttcgctcgct atgctcggtt acacggctgc 3300

ggcgagcgct agtgataata agtgactgag gtatgtgctc ttcttatctc cttttgtagt 3360

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ttgcagtaaa ttgcaagatt taataaaaaa acgcaaagca atgattaaag gatgttcaga 3480

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tatgcaataa agcccacttg ctggccgggg cttgacatta ttccttcctg tctggctctg 4080

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cgttaattgc gcgcgtagga gtaatggctc gcggtaatgc cattactttg cctgtatgtg 4800

gtcgggatgt gaagtttact cttgaagtgc tccggggtga tagtgttgag aagacctctc 4860

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tttttcaatg agatgtatag tttatagttt tgcagaaaat aaataaattt catttaactc 6840

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acgataaatg taagtcttgt ttagaataca tttgcatatt aataatttac taactttcta 7080

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ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 7560

gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc 7620

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tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa 7740

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ccactcccag gtccaactgc acctcggttc taagcttgcc gccatggact acaaggacga 8160

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ctactactac gtggacacca agctggacat cacctcccac aacgaggact acaccatcgt 8820

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cgagggcgag ggcgagggcc gcccctacga gggcacccag accgccaagc tgaaggtgac 9060

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<210> 6

<211> 1131

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TK

<400> 6

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gggaaaacca ccaccacgca actgctggtg gccctgggtt cgcgcgacga tatcgtctac 240

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acaaacatcg tgttgggggc ccttccggag gacagacaca tcgaccgcct ggccaaacgc 660

cagcgccccg gcgagcggct tgacctggct atgctggccg cgattcgccg cgtttacgag 720

ctgcttgcca atacggtgcg gtatctgcag ggcggcgggt cgtggcggga ggattgggga 780

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<211> 376

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TK

<400> 7

Met Ala Ser Tyr Pro Cys His Gln His Ala Ser Ala Phe Asp Gln Ala

1 5 10 15

Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr Ala Leu Arg Pro Arg

20 25 30

Arg Gln Gln Glu Ala Thr Glu Val Arg Leu Glu Gln Lys Met Pro Thr

35 40 45

Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly Met Gly Lys Thr Thr

50 55 60

Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg Asp Asp Ile Val Tyr

65 70 75 80

Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Gln Val Leu Gly Ala Ser Glu Thr

85 90 95

Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gln His Arg Leu Asp Gln Gly Glu Ile

100 105 110

Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser Ala Gln Ile Thr Met

115 120 125

Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu Ala Pro His Ile Gly

130 135 140

Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro Pro Ala Leu Thr Leu Ile

145 150 155 160

Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala Arg

165 170 175

Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr Pro Gln Ala Val Leu Ala Phe Val Ala

180 185 190

Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu

195 200 205

Pro Glu Asp Arg His Ile Asp Arg Leu Ala Lys Arg Gln Arg Pro Gly

210 215 220

Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Glu

225 230 235 240

Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gln Gly Gly Gly Ser Trp Arg

245 250 255

Glu Asp Trp Gly Gln Leu Ser Gly Thr Ala Val Pro Pro Gln Gly Ala

260 265 270

Glu Pro Gln Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu

275 280 285

Phe Thr Leu Phe Arg Ala Pro Glu Leu Leu Ala Pro Asn Gly Asp Leu

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Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu Ala Lys Arg Leu Arg

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Pro Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gln Ser Pro Ala Gly Cys

325 330 335

Arg Asp Ala Leu Leu Gln Leu Thr Ser Gly Met Val Gln Thr His Val

340 345 350

Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro Thr Ile Cys Asp Leu Ala Arg Thr Phe

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Ala Arg Glu Met Gly Glu Ala Asn

370 375

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 2A

<400> 8

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 2A

<400> 9

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

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Gly Pro

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> GFP

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ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GFP

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Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

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Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

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Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

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Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

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Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

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Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

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Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210> 12

<211> 1902

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TK-2A-GFP

<400> 12