本發(fā)明涉及一種利用重組鈍齒棒桿菌全細胞轉(zhuǎn)化葡萄糖合成2,3-丁二醇和乳酸的方法，屬于基因工程技術領域。

背景技術：

2,3-丁二醇作為一種平臺化合物，可用于合成甲乙酮和1,3-丁二烯等。除此之外，2,3-丁二醇還可作為燃料添加劑或用于制備油墨、香水、熏蒸劑、增濕劑、軟化劑、增塑劑、炸藥及藥物手性載體等。乳酸可作為食品的風味添加物，同時起到防腐保鮮的功效；另外乳酸也被廣泛應用到化妝品、醫(yī)藥行業(yè)中，具有重要的市場價值。2,3-丁二醇和乳酸的混合產(chǎn)品可以作為醋、酒等食品的風味調(diào)和物質(zhì)。目前2,3-丁二醇和乳酸的主要生產(chǎn)方法分為化學合成法和微生物發(fā)酵法。隨著化石資源的日益枯竭和環(huán)境壓力的增大，利用微生物轉(zhuǎn)化廉價原料發(fā)酵生產(chǎn)大宗化學產(chǎn)品受到越來越多的青睞，因此設計合理的微生物代謝途徑，實現(xiàn)微生物全細胞轉(zhuǎn)化葡萄糖直接合成2,3-丁二醇和乳酸具有重要意義和應用價值。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種構建重組鈍齒棒桿菌，實現(xiàn)其全細胞轉(zhuǎn)化葡萄糖合成2,3-丁二醇和乳酸的方法。將來源于枯草芽孢桿菌alsSD基因轉(zhuǎn)化到鈍齒棒桿菌Corynebacterium crenatum SDNN403中(本菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC NO.0890；申報相關專利：ZL 03112896.3)，構建C.crenatum/pXMJ19-alsSD?；讷@得的基因工程菌，全細胞轉(zhuǎn)化150g/L葡萄糖可以合成2,3-丁二醇25±1.1g/L，乳酸56±1.5g/L。

在發(fā)明過程中用到以下研究方法和微生物培養(yǎng)條件：

1.培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

(1)大腸桿菌：

培養(yǎng)條件：旋轉(zhuǎn)式搖床37℃，160r/min。

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl 10，pH 7.0；固體LB培養(yǎng)基需添加2％的瓊脂；

(2)鈍齒棒桿菌：

培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度30℃，轉(zhuǎn)速180r/min。

種子培養(yǎng)基為LBG培養(yǎng)基，即LB培養(yǎng)基添加0.5％的葡萄糖；

用于電轉(zhuǎn)化的感受態(tài)培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基添加3％的甘氨酸，0.1％的吐溫80，用于C.crenatum感受態(tài)細胞的培養(yǎng)；

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉8，(NH₄)₂SO₄ 40，MgSO₄·7H₂O 0.5，KCl 1，KH₂PO₄ 1.5，MnSO₄·H₂O 0.02，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.02，CaCO₃ 30；

2.染色體基因組DNA的提取和質(zhì)粒DNA的提取

C.crenatum和B.subtilis染色體基因組按照細菌染色體基因組DNA提取試劑盒相關操作說明進行提取。E.coli質(zhì)粒DNA的提取使用試劑盒提取，C.crenatum的重組質(zhì)粒進行提取時需先加入溶菌酶作用細胞壁一段時間之后，再使用試劑盒提取重組質(zhì)粒。

3.大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化

CaCl₂法制備E.coli感受態(tài)細胞；42℃熱擊轉(zhuǎn)化E.coli JM109，經(jīng)過氨芐青霉素抗性平板篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子。

4.C.crenatum感受態(tài)細胞的制備與電轉(zhuǎn)化方法

(1)挑取新鮮斜面上的菌株接種于含0.5％葡萄糖的LB培養(yǎng)基中，30℃，200r/min培養(yǎng)12h；(2)按接種量1％轉(zhuǎn)接入感受態(tài)培養(yǎng)基于30℃，200r/min培養(yǎng)3-5h至OD₅₆₂約為0.9；(3)細胞培養(yǎng)結(jié)束后，先將菌液冰浴20min，離心10min，4℃，8000r/min；(4)預冷的10％甘油洗滌細胞，最終用500μL的10％甘油重新懸浮細胞，1.5mL離心管分裝，每管70μL，感受態(tài)細胞可用于電轉(zhuǎn)化；(5)電轉(zhuǎn)時，添加3μL的重組質(zhì)粒到每管(4)中的感受態(tài)細胞，冰上放置10min，加入預冷的電極杯中電擊，電壓：1.8kV，時間：5ms；(6)之后，加入含0.5％葡萄糖的LB培養(yǎng)基800μL，并放置于46℃水浴鍋中水浴6min，完成后，30℃，200r/min培養(yǎng)2h；(7)后培養(yǎng)結(jié)束后，8000r/min，離心10min，去掉大部分上清，留取200μL，懸浮菌液，涂布Km抗性平板或Cm抗性平板，30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)60h，觀察轉(zhuǎn)化子生長情況。

具體實施方式

實施例1重組菌C.crenatum/pXMJ19-alsSD的構建

以Bacillus subtilis168染色體為模板，分別以PalsSDF和PalsSDR為引物進行PCR，將PCR得到的基因片段alsSD(SEQ ID NO.1)與質(zhì)粒pXMJ19用SmaⅠ與SacⅠ雙酶切，然后膠回收，用T4DNA連接酶連接pXMJ19與alsSD片段，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，構建重組質(zhì)粒pXMJ19-alsSD。引物序列如下：

PalsSDF：ACCGCCCGGGAAAGGAGGGAAATCATGACAAAAGCAACAAAAG

PalsSDR：ACCGGAGCTCTTATTCAGGGCTTCCTTC

將構建好的重組質(zhì)粒pXMJ19-alsSD電擊轉(zhuǎn)化C.crenatum，在Km平板上篩選出陽性菌落，即為重組菌C.crenatum/pXMJ19-alsSD。

實施例4重組菌C.crenatum/pXMJ19-alsSD轉(zhuǎn)化葡萄糖合成2,3-丁二醇和乳酸

(1)種子活化：將C.crenatum/pXMJ19-alsSD按照1％的接種量接種至10mL LBG培養(yǎng)基中，30℃，180r/min培養(yǎng)大約12h；

(2)菌體培養(yǎng)：將種子液按照5％的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，180r/min培養(yǎng)24h左右；

(3)全細胞轉(zhuǎn)化：將培養(yǎng)24h的C.crenatum/pXMJ19-alsSD發(fā)酵液10000r/min離心30min，收集菌體細胞，按照菌體濕重：轉(zhuǎn)化液體積為1：20的比例，將細胞懸浮于全細胞轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液(g/L)：KH₂PO₄ 0.5，K₂HPO₄·3H₂O 0.5，MgSO₄·7H₂O 0.5，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 6，MnSO₄·H₂O4.2，葡萄糖150，轉(zhuǎn)化過程中維持pH在7.0左右。轉(zhuǎn)化60h，可得到25±1.1g/L的2,3-丁二醇和56±1.5g/L的乳酸。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。

序列表

<110> 江南大學

<120> 利用鈍齒棒桿菌全細胞轉(zhuǎn)化葡萄糖合成2,3-丁二醇和乳酸

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2587

<212> DNA

<213> PCR獲得

<400> 1

1 CCCGGGAAAG GAGGGAAATC ATGACAAAAG CAACAAAAGA TGACAAAAGC AACAAAAGAA

61 CAAAAATCCC TTGTGAAAAA CAGAGGGGCG GAGCTTGTTG TTGATTGCTT AGTGGAGCAA

121 GGTGTCACAC ATGTATTTGG CATTCCAGGT GCAAAAATTG ATGCGGTATT TGACGCTTTA

181 CAAGATAAAG GACCTGAAAT TATCGTTGCC CGGCACGAAC AAAACGCAGC ATTCATGGCC

241 CAAGCAGTCG GCCGTTTAAC TGGAAAACCG GGAGTCGTGT TAGTCACATC AGGACCGGGT

301 GCCTCTAACT TGGCAACAGG CCTGCTGACA GCGAACACTG AAGGAGACCC TGTCGTTGCG

361 CTTGCTGGAA ACGTGATCCG TGCAGATCGT TTAAAACGGA CACATCAATC TTTGGATAAT

421 GCGGCGCTAT TCCAGCCGAT TACAAAATAC AGTGTAGAAG TTCAAGATGT AAAAAATATA

481 CCGGAAGCTG TTACAAATGC ATTTAGGATA GCGTCAGCAG GGCAGGCTGG GGCCGCTTTT

541 GTGAGCTTTC CGCAAGATGT TGTGAATGAA GTCACAAATA CGAAAAACGT GCGTGCTGTT

601 GCAGCGCCAA AACTCGGTCC TGCAGCAGAT GATGCAATCA GTGCGGCCAT AGCAAAAATC

661 CAAACAGCAA AACTTCCTGT CGTTTTGGTC GGCATGAAAG GCGGAAGACC GGAAGCAATT

721 AAAGCGGTTC GCAAGCTTTT GAAAAAGGTT CAGCTTCCAT TTGTTGAAAC ATATCAAGCT

781 GCCGGTACCC TTTCTAGAGA TTTAGAGGAT CAATATTTTG GCCGTATCGG TTTGTTCCGC

841 AACCAGCCTG GCGATTTACT GCTAGAGCAG GCAGATGTTG TTCTGACGAT CGGCTATGAC

901 CCGATTGAAT ATGATCCGAA ATTCTGGAAT ATCAATGGAG ACCGGACAAT TATCCATTTA

961 GACGAGATTA TCGCTGACAT TGATCATGCT TACCAGCCTG ATCTTGAATT GATCGGTGAC

1021 ATTCCGTCCA CGATCAATCA TATCGAACAC GATGCTGTGA AAGTGGAATT TGCAGAGCGT

1081 GAGCAGAAAA TCCTTTCTGA TTTAAAACAA TATATGCATG AAGGTGAGCA GGTGCCTGCA

1141 GATTGGAAAT CAGACAGAGC GCACCCTCTT GAAATCGTTA AAGAGTTGCG TAATGCAGTC

1201 GATGATCATG TTACAGTAAC TTGCGATATC GGTTCGCACG CCATTTGGAT GTCACGTTAT

1261 TTCCGCAGCT ACGAGCCGTT AACATTAATG ATCAGTAACG GTATGCAAAC ACTCGGCGTT

1321 GCGCTTCCTT GGGCAATCGG CGCTTCATTG GTGAAACCGG GAGAAAAAGT GGTTTCTGTC

1381 TCTGGTGACG GCGGTTTCTT ATTCTCAGCA ATGGAATTAG AGACAGCAGT TCGACTAAAA

1441 GCACCAATTG TACACATTGT ATGGAACGAC AGCACATATG ACATGGTTGC ATTCCAGCAA

1501 TTGAAAAAAT ATAACCGTAC ATCTGCGGTC GATTTCGGAA ATATCGATAT CGTGAAATAT

1561 GCGGAAAGCT TCGGAGCAAC TGGCTTGCGC GTAGAATCAC CAGACCAGCT GGCAGATGTT

1621 CTGCGTCAAG GCATGAACGC TGAAGGTCCT GTCATCATCG ATGTCCCGGT TGACTACAGT

1681 GATAACATTA ATTTAGCAAG TGACAAGCTT CCGAAAGAAT TCGGGGAACT CATGAAAACG

1741 AAAGCTCTCT AGCACTCTGC GCATCACGAC ACTGTTTTAT GAACAGCACT AAATAAAAGG

1801 AGTGAAGGGA AATATGAAAC GAGAAAGCAA CATTCAAGTG CTCAGCCGTG GTCAAAAAGA

1861 TCAGCCTGTG AGCCAGATTT ATCAAGTATC AACAATGACT TCTCTATTAG ACGGAGTATA

1921 TGACGGAGAT TTTGAACTGT CAGAGATTCC GAAATATGGA GACTTCGGTA TCGGAACCTT

1981 TAACAAGCTT GACGGAGAGC TGATTGGGTT TGACGGCGAA TTTTACCGTC TTCGCTCAGA

2041 CGGAACCGCG ACACCGGTCC AAAATGGAGA CCGTTCACCG TTCTGTTCAT TTACGTTCTT

2101 TACACCGGAC ATGACGCACA AAATTGATGC GAAAATGACA CGCGAAGACT TTGAAAAAGA

2161 GATCAACAGC ATGCTGCCAA GCAGAAACTT ATTTTATGCA ATTCGCATTG ACGGATTGTT

2221 TAAAAAGGTG CAGACAAGAA CAGTAGAACT TCAAGAAAAA CCTTACGTGC CAATGGTTGA

2281 AGCGGTCAAA ACACAGCCGA TTTTCAACTT CGACAACGTG AGAGGAACGA TTGTAGGTTT

2341 CTTGACACCA GCTTATGCAA ACGGAATCGC CGTTTCTGGC TATCACCTGC ACTTCATTGA

2401 CGAAGGACGC AATTCAGGCG GACACGTTTT TGACTATGTG CTTGAGGATT GCACGGTTAC

2461 GATTTCTCAA AAAATGAACA TGAATCTCAG ACTTCCGAAC ACAGCGGATT TCTTTAATGC

2521 GAATCTGGAT AACCCTGATT TTGCGAAAGA TATCGAAACA ACTGAAGGAA GCCCTGAATA

2581 AGAGCTC