手性是自然界的本質(zhì)屬性之一，構(gòu)成生命有機(jī)體的分子都屬于不對(duì)稱的手性分子。在制藥行業(yè)中，把具有藥理活性作用的對(duì)映純化合物稱作手性藥物。不同構(gòu)型的藥物作用于生物體時(shí)，其所發(fā)揮的作用截然不同，在藥物活性，代謝過(guò)程及毒性等方面也存在著顯著差異，20世紀(jì)60年代中期在歐洲爆發(fā)的“反應(yīng)停事件”已經(jīng)充分表明研究單一對(duì)映體形式的藥物是非常必要的。

L-正纈氨酸(L-norvaline)是一種非蛋白質(zhì)支鏈氨基酸，作為許多藥物合成的前體物質(zhì)，其在制藥行業(yè)具有非常廣泛的應(yīng)用。培哚普利，作為一種治療高血壓和心力衰竭的有效藥物，就是通過(guò)以L-正纈氨酸為重要中間體而合成。當(dāng)前主要通過(guò)化學(xué)方法合成L-正纈氨酸?；瘜W(xué)方法存在較多缺陷，例如工藝路線復(fù)雜，收率低，產(chǎn)品手性純度低等缺點(diǎn)。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，生物轉(zhuǎn)化方法正廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和食品等相關(guān)領(lǐng)域。由于酶本身作為一種手性催化劑，且酶法轉(zhuǎn)化具有選擇性大，區(qū)域選擇性和對(duì)映異構(gòu)選擇性高，反應(yīng)條件溫和，環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)，因此，利用酶法轉(zhuǎn)化合成L-正纈氨酸具有非常廣泛的應(yīng)用前景。

D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,DAAO,E.C.1.4.3.3)是一種以黃素腺嘌呤(FAD)為輔基的典型黃素蛋白酶類，可氧化D-氨基酸的氨基生成相應(yīng)的酮酸，氨和過(guò)氧化氫(H₂O₂)。該酶可應(yīng)用于D氨基酸的定性定量分析，生物傳感器，L氨基酸和α-酮酸的生產(chǎn)，目前DAAO主要應(yīng)用于兩部酶法生產(chǎn)7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)。由于7-ACA是合成頭孢菌素的重要原料，且頭孢菌素市場(chǎng)需求量大，因此DAAO越來(lái)越受人們關(guān)注。亮氨酸脫氫酶(Leucine dehydrogenase,LeuDH,E.C.1.4.1.9)是一種NAD⁺依賴型的氧化還原酶，其能可逆催化L-亮氨酸和一些支鏈L-氨基酸反應(yīng)生成對(duì)應(yīng)的酮酸及其類似物，該酶在芽孢桿菌中有較高表達(dá)水平，主要參與體內(nèi)L-氨基酸的代謝。Sanwal和Zink于1961年首次在芽孢桿菌Bacillus cereus中發(fā)現(xiàn)該酶并將其純化出來(lái)；Hermier等人研究發(fā)現(xiàn)該酶在芽孢桿菌的芽孢形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。LeuDH還可用于支鏈脂肪酸及其酮酸類似物的測(cè)定。近年來(lái)，不同來(lái)源的LeuDH基因工程菌已經(jīng)被成功構(gòu)建，實(shí)現(xiàn)了LeuDH的高密度表達(dá)和規(guī)模化制備，然而，LeuDH的大規(guī)模應(yīng)用需要添加NADH作為輔酶，NADH價(jià)格昂貴，不適合工業(yè)上大規(guī)模使用，因此，構(gòu)建高效的NADH再生系統(tǒng)是解決LeuDH規(guī)模化應(yīng)用的關(guān)鍵。NAD⁺依賴型的甲酸脫氫酶(Formate dehydrogenase,FDH,E.C.1.2.1.2)屬于D-2羥基酸脫氫酶類，可以將甲酸氧化為CO2的同時(shí)將NAD+還原為NADH,因此該酶被廣泛應(yīng)用于NADH再生，且該酶的適宜pH值范圍廣，產(chǎn)物CO2可直接從反應(yīng)體系中分離出去，有利于后續(xù)目的產(chǎn)物分離，因此FDH已成為輔酶再生領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)之一?；贒AAO，LeuDH和FDH的不同催化功能，本發(fā)明成功構(gòu)建了利用粗酶液將D-正纈氨酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-正纈氨酸的方法，首先利用DAAO將D-正纈氨酸氧化成2-氧代戊酸，然后通過(guò)LeuDH將2-氧代戊酸轉(zhuǎn)化成L-正纈氨酸，同時(shí)將NADH氧化為NAD⁺,最后利用FDH將NAD⁺重新轉(zhuǎn)化成NADH,實(shí)現(xiàn)NADH的再生，另外，D-正纈氨酸被DAAO氧化的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生過(guò)氧化氫(H₂O₂),通過(guò)外源添加過(guò)氧化氫酶來(lái)除去生成的H₂O₂。

本發(fā)明通過(guò)表達(dá)載體pXMJ19實(shí)現(xiàn)了將來(lái)源于Trigonopsis variabilis的DAAO基因daao成功在谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum ATCC13032中進(jìn)行高效表達(dá)；通過(guò)表達(dá)載體pET-28a(+)實(shí)現(xiàn)了將分別來(lái)源于Bacillus cereus的LeuDH基因leudh和來(lái)源于Candida boidinii的FDH基因fdh成功在大腸桿菌Escherichia coli BL21中進(jìn)行高效表達(dá)，并利用這三株基因工程菌的粗酶液作為生物催化劑，以混合型DL-正纈氨酸(純度>99％，D型和L型比例為1:1)為底物，實(shí)現(xiàn)L-正纈氨酸的高效生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要研究?jī)?nèi)容：本發(fā)明利用分子技術(shù)克隆了來(lái)自Trigonopsis variabilis的D-氨基酸氧化酶基因daao，構(gòu)建重組表達(dá)載體pXMJ19-daao，并通過(guò)電轉(zhuǎn)化方法將其轉(zhuǎn)化至C.glutamicum ATCC13032中，成功構(gòu)建了基因工程菌株C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-daao；又成功克隆了分別來(lái)源于Bacillus cereus的亮氨酸脫氫酶基因leudh和來(lái)源于Candida boidinii的甲酸脫氫酶基因fdh，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a(+)-leudh和pET-28a(+)-fdh，并通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化方法將其轉(zhuǎn)化至E.coli BL21中，成功構(gòu)建基因工程菌E.coli BL21/pET-28a(+)-leudh和E.coli BL21/pET-28a(+)-fdh。酶活力測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)DAAO，LeuDH和FDH的酶活分別為0.30U/mL，8.13U/mL和0.22U/mL。基于獲得的基因工程菌，通過(guò)細(xì)胞破碎獲得每株工程菌的粗酶液，用于轉(zhuǎn)化D-正纈氨酸生產(chǎn)L-正纈氨酸進(jìn)行了初步研究，在25h內(nèi)，L-正纈氨酸的產(chǎn)量為54.09g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到96.3％。

本發(fā)明采取的技術(shù)方案：

酶液轉(zhuǎn)化D-正纈氨酸生產(chǎn)L-正纈氨酸，是通過(guò)構(gòu)建C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-daao，E.coli BL21/pET-28a(+)-leudh和E.coli BL21/pET-28a(+)-fdh三株基因工程菌，并通過(guò)細(xì)胞破碎獲得三個(gè)酶的粗酶液，以混合型DL-正纈氨酸為底物，構(gòu)建轉(zhuǎn)化化法生產(chǎn)L-正纈氨酸的最佳轉(zhuǎn)化體系，實(shí)現(xiàn)高效生產(chǎn)L-正纈氨酸的方法。

1.D-氨基酸氧化酶，亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI中Trigonopsis variabilis全基因組核酸序列中daao基因序列，設(shè)計(jì)daao基因的PCR引物P1和P2。

F：5’-GGGGTACCAAAGGAGGGAAATCATGGGATCCCAAAAGAGGGTT-3’(Kpn Ⅰ)

R：5’-CGGAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGAGCTTAGACTCGCGGGC-3’(EcoR I)

根據(jù)NCBI中Bacillus cereus全基因組核酸序列中l(wèi)eudh基因序列，設(shè)計(jì)leudh基因的PCR引物P3和P4。

F：5’-ACCGGGATCCATGACATTAGAAATCTTCG-3’(BamH Ⅰ)

R：5’-CGCGTCGACTTAGCGACGGCTAATAATATC-3’(Sal Ⅰ)

根據(jù)NCBI中Candida boidinii全基因組核酸序列中fdh基因序列，設(shè)計(jì)fdh基因的PCR引物P5和P6。

F：5’-ACCGGGATCCATGAAGATCGTTTTAGTC-3’(BamH Ⅰ)

R：5’-CGCGTCGACTTATTTCTTATCGTGTTTAC-3’(Sal Ⅰ)

2.重組表達(dá)載體pXMJ19-daao，pET-28a(+)-leudh和pET-28a(+)-fdh的構(gòu)建

參照博大泰克公司膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)回收daao，leudh和fdh的PCR產(chǎn)物，膠回收產(chǎn)物分別按一定比例與pMD18-T vector過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，使用氨芐青霉素抗性平板篩選重組菌，第一種重組質(zhì)粒經(jīng)Kpn Ⅰ/EcoR I酶切釋放出大小為2.7kb和1107bp的基因條帶，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pMD18-T-daao；第二種重組質(zhì)粒經(jīng)BamH Ⅰ/Sal Ⅰ酶切釋放出大小為2.7kb和(1098)bp的基因條帶，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pMD18-T-leudh；第三種重組質(zhì)粒經(jīng)BamH Ⅰ/Sal Ⅰ酶切釋放出大小為2.7kb和(1095)bp的基因條帶，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pMD18-T-fdh。

提取保存于E.coli JM109中的質(zhì)粒pMD18-T-daao和pXMJ19，質(zhì)粒pMD18-T-daao和pXMJ19經(jīng)Kpn Ⅰ/EcoR I雙酶切，膠回收純化，16℃過(guò)夜連接，將連接物熱擊轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，用氯霉素抗性平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)Kpn Ⅰ/EcoR I雙酶切后釋放出大小為6.6kb和1107bp的基因片段，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，重組質(zhì)粒命名為pXMJ19-daao。

提取保存于E.coli JM109中的質(zhì)粒pMD18-T-leudh，pMD18-T-fdh和載體pET-28a(+)，質(zhì)粒和載體經(jīng)BamH Ⅰ/Sal Ⅰ雙酶切，膠回收純化，16℃過(guò)夜連接，將連接物熱擊轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，用卡那霉素抗性平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，重組質(zhì)粒pET-28a(+)-leudh經(jīng)BamH Ⅰ/Sal Ⅰ雙酶切后釋放出大小為6.6kb和1098bp的基因片段，重組質(zhì)粒pET-28a(+)-fdh經(jīng)BamH Ⅰ/Sal Ⅰ雙酶切后釋放出大小為6.6kb和1095bp的基因片段，證明重組質(zhì)粒pET-28a(+)-leudh和pET-28a(+)-fdh構(gòu)建成功。

3.基因工程菌C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-daao，E.coli BL21/pET-28a(+)-leudh和E.coli BL21/pET-28a(+)-fdh的構(gòu)建及驗(yàn)證

將經(jīng)驗(yàn)證構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pMA5-daao通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至菌株C.glutamicum ATCC13032中；挑取在具有氯霉素抗性平板上長(zhǎng)出的菌落，搖瓶發(fā)酵，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證；將重組質(zhì)粒pET-28a(+)-leudh和pET-28a(+)-fdh通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至E.coli BL21中，挑取在具有卡那霉素抗性平板上長(zhǎng)出的菌落，搖瓶發(fā)酵，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

4.重組菌株酶活力測(cè)定

DAAO酶活測(cè)定方法：配制0.1M底物D-正纈氨酸(0.1M磷酸鹽緩沖液，pH 8.0)，取磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH8.0)1mL，加入0.1M的D-正纈氨酸0.1mL，400U/mL的過(guò)氧化氫酶0.1mL和適量粗酶液，于37℃水浴15min后加入2mg/mL的對(duì)二硝基苯肼0.48mL，重新放入37℃水浴10min后加入3M的NaOH 1.7mL顯色，然后檢測(cè)在550nm處的吸光值。

酶活定義單位為每分鐘氧化D-正纈氨酸生成1umol 2-氧代戊酸所需的酶量。

LeuDH酶活測(cè)定方法：配置84.7mM戊酮酸溶液，3mg/mL NADH溶液及900mM氯化銨溶液(pH 9.5)，取1.2mL氯化銨溶液置于石英比色皿中，再依次加入120μL NADH溶液，10μL戊酮酸溶液及2μL粗酶液，在340nm下檢測(cè)每分鐘的吸光值變化，酶活定義單位為1min催化1umol NADH轉(zhuǎn)化成NAD⁺所需的酶量。

FDH酶活測(cè)定方法：配制17mg/mL的甲酸鈉溶液(pH 7.5)，3mg/mL的NAD⁺溶液,取1.48mL的甲酸鈉溶液置于石英比色皿中，依次加入80μL NAD⁺溶液和10μL粗酶液，在340nm下檢測(cè)每分鐘的吸光值變化，酶活定義單位為1min催化1umol NAD⁺轉(zhuǎn)化成NADH所需的酶量。

5.DAAO，LeuDH和FDH粗酶液轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-正纈氨酸

以重組菌C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-daao，E.coli BL21/pET-28a(+)-leudh和E.coli BL21/pET-28a(+)-fdh的粗酶液為生物催化劑。以一定濃度的混合型DL-正纈氨酸為底物，在最佳轉(zhuǎn)化體系下進(jìn)行轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-正纈氨酸。用高效液相色譜法測(cè)定轉(zhuǎn)化液中D-正纈氨酸和L-正纈氨酸的含量。

氨基酸分析色譜條件：

(a)色譜柱：Chiralcel OD-3R色譜柱150*4.6*3

(b)柱溫：40℃

(c)流動(dòng)相：A相：量取1毫升H₃PO₄，加入至1000毫升水中，配成0.1％的H₃PO₄溶液。

B相：100％乙腈

(d)檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器338nm

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：

(1)本發(fā)明首次在C.glutamicum ATCC13032中克隆表達(dá)了來(lái)源于Trigonopsis variabilis的D-氨基酸氧化酶基因daao，重組菌中DAAO的酶活的達(dá)到0.3U/mL。

(2)本發(fā)明基于DAAO基因在C.glutamicum ATCC13032中的高效表達(dá)，LeuDH和FDH在E.coli BL21中的高效表達(dá)，研究了酶法轉(zhuǎn)化產(chǎn)L-正纈氨酸，并在25h內(nèi)獲得了80.09g/L的L-正纈氨酸，D-正纈氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到98.3％。本次發(fā)明采用酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-正纈氨酸，具有產(chǎn)物專一性強(qiáng)、轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點(diǎn)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：D-氨基酸氧化酶，亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI中Trigonopsis variabilis全基因組核酸序列中daao基因序列，設(shè)計(jì)daao基因的PCR引物P1和P2。

F：5’-GGGGTACCAAAGGAGGGAAATCATGGGATCCCAAAAGAGGGTT-3’(Kpn Ⅰ)

R：5’-CGGAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGAGCTTAGACTCGCGGGC-3’(EcoR I)

根據(jù)NCBI中Bacillus cereus全基因組核酸序列中l(wèi)eudh基因序列，設(shè)計(jì)leudh基因的PCR引物P3和P4。

F：5’-ACCGGGATCCATGACATTAGAAATCTTCG-3’(BamH Ⅰ)

R：5’-CGCGTCGACTTAGCGACGGCTAATAATATC-3’(Sal Ⅰ)

根據(jù)NCBI中Candida boidinii全基因組核酸序列中fdh基因序列，設(shè)計(jì)fdh基因的PCR引物P5和P6。

F：5’-ACCGGGATCCATGAAGATCGTTTTAGTC-3’(BamH Ⅰ)

R：5’-CGCGTCGACTTATTTCTTATCGTGTTTAC-3’(Sal Ⅰ)

實(shí)施例2：D-氨基酸氧化酶基因daao的克隆

以Trigonopsis variabilis總DNA為模板，利用上面提供的引物做PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性，5min，一個(gè)循環(huán)；94℃變性，1min，58℃退火，1min，72℃延伸，90s，34個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR擴(kuò)增體系：模板1μL，上下游引物各0.4μL，dNTP Mix 4μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，滅菌的雙蒸水37μL，Ex Taq DNA聚合酶1μL。采用凝膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收，電泳檢驗(yàn)回收產(chǎn)物的濃度。回收產(chǎn)物存放在1.5ml的離心管中，-20℃冰箱保存?zhèn)溆??；厥债a(chǎn)物與pMD18-T Vector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coil JM109，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含氨芐青霉素的LB平板，經(jīng)37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取菌落到10ml液體LB培養(yǎng)基中，37℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，命名為pMD18-T-daao，經(jīng)酶切驗(yàn)證連接成功后，加入甘油至終濃度15％～20％(w/v)，-70℃冰箱保藏。

實(shí)施例3：亮氨酸脫氫酶基因leudh和甲酸脫氫酶基因fdh的克隆

分別以Bacillus cereus和Candida boidinii的總DNA為模板，利用上面提供的引物做PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性，5min，一個(gè)循環(huán)；94℃變性，1min，58℃退火，1min，72℃延伸，90s，34個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR擴(kuò)增體系：模板1μL，上下游引物各0.4μL，dNTP Mix 4μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，滅菌的雙蒸水37μL，Ex Taq DNA聚合酶1μL。采用凝膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收，電泳檢驗(yàn)回收產(chǎn)物的濃度?；厥债a(chǎn)物存放在1.5ml的離心管中，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩；厥债a(chǎn)物與pMD18-T Vector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coil JM109，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含氨芐青霉素的LB平板，經(jīng)37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取菌落到10ml液體LB培養(yǎng)基中，37℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，分別命名為pMD18-T-leudh和pMD18-T-fdh，經(jīng)酶切驗(yàn)證連接成功后，加入甘油至終濃度15％～20％(w/v)，-70℃冰箱保藏。實(shí)施例3：重組質(zhì)粒pXMJ19-daao的構(gòu)建

提取保存于E.coli JM109中的質(zhì)粒pMD18-T-daao和pXMJ19，并分別用KpnⅠ/EcoR I進(jìn)行雙酶切，利用凝膠回收試劑盒回收后進(jìn)行連接，連接體系：目的基因酶切產(chǎn)物7μL，pXMJ19酶切產(chǎn)物1μL，T4DNA連接酶buffer 1μL，T4DNA連接酶1μL，16℃過(guò)夜連接。將連接好的重組質(zhì)粒pXMJ9-daao轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coil JM109，用LB氯霉素抗性培養(yǎng)基，挑取陽(yáng)性菌落。37℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，命名為pXMJ9-daao，酶切驗(yàn)證正確后，加入甘油至終濃度15％～20％(w/v)，-70℃冰箱保藏備用。

實(shí)施例4：重組質(zhì)粒pET-28a(+)-leudh和pET-28a(+)-fdh的構(gòu)建

提取保存于E.coli JM109中的質(zhì)粒pMD18-T-leudh，pMD18-T-fdh和pET-28a(+)，并分別用BamHⅠ/SalⅠ進(jìn)行雙酶切，利用凝膠回收試劑盒回收后進(jìn)行連接，連接體系：目的基因酶切產(chǎn)物7μL，pET-28a(+)酶切產(chǎn)物1μL，T4DNA連接酶buffer 1μL，T4DNA連接酶1μL，16℃過(guò)夜連接。將連接好的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-leudh和pET-28a(+)-fdh轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coil JM109，用LB卡那霉素抗性培養(yǎng)基，挑取陽(yáng)性菌落。37℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，命名為pET-28a(+)-leudh和pET-28a(+)-fdh，酶切驗(yàn)證正確后，加入甘油至終濃度15％～20％(w/v)，-70℃冰箱保藏備用。

實(shí)施例4：重組質(zhì)粒pXMJ9-daao轉(zhuǎn)化C.glutamicum ATCC13032

感受態(tài)制備：挑取C.glutamicum ATCC13032接種于一支10ml LBG(LB+0.5％葡萄糖)液體培養(yǎng)基，30℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜，取500μL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接入含3％甘氨酸和0.1％吐溫-80的50ml液體LB培養(yǎng)基中，使得初始細(xì)胞OD₆₀₀達(dá)到0.3于30℃，200r/min培養(yǎng)到細(xì)胞OD₆₀₀達(dá)到0.9。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后將菌液預(yù)冷15min，然后離心收集菌體。用預(yù)冷的10％甘油洗滌菌體4次，最后用0.2ml 10％甘油重懸細(xì)胞，用1.5ml管分裝，每管80ul直接用于電轉(zhuǎn)化。

電轉(zhuǎn)：1800V電轉(zhuǎn)5ms，電轉(zhuǎn)后加入800ul LB培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)2-3h

重組菌獲得：涂布于氯霉素抗性LBG培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，得到重組菌C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-daao。

實(shí)施例5：C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-daao D-氨基酸氧化酶活力測(cè)定

將實(shí)施例4構(gòu)建的重組菌C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-daao，與出發(fā)菌株C.glutamicum ATCC13032分別接種于10ml含氯霉素的LBG培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日按1％的接種量轉(zhuǎn)接于50ml LBG培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)4h后至OD₆₀₀為0.8時(shí)加入終濃度為0.8mM的IPTG，30℃誘導(dǎo)12h，取發(fā)酵液于4℃，10000r/min離心10min，pH 7.5的磷酸鹽緩沖液(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄)清洗2次，最后用5ml pH 7.5磷酸鹽緩沖液懸浮。超聲波破碎處理制備粗酶液。

取磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH8.0)1mL，加入0.1M的D-正纈氨酸0.1mL，400U/mL的過(guò)氧化氫酶0.1mL和適量粗酶液，于37℃水浴15min后加入2mg/mL的對(duì)二硝基苯肼0.48mL，重新放入37℃水浴10min后加入3M的NaOH 1.7mL顯色，然后檢測(cè)在550nm處的吸光值。

酶活定義單位為每分鐘氧化D-正纈氨酸生成1umol 2-氧代戊酸所需的酶量。

結(jié)果表明重組菌C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-daao表達(dá)的DAAO酶活為0.3U/mL，而原始菌C.glutamicum ATCC13032并沒(méi)有檢測(cè)到DAAO的酶活，從而實(shí)現(xiàn)了在C.glutamicum ATCC13032中DAAO酶活力的從無(wú)到有。

實(shí)施例6：重組質(zhì)粒pET-28a(+)-leudh和pET-28a(+)-fdh轉(zhuǎn)化E.coli BL21

E.coli BL21感受態(tài)制備：(1)從LB平板上挑取新活化的單菌落，接種于10mL的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h左右，再將該菌懸液以1％的接種量接種于50mL的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)2-3h，直至OD₆₀₀達(dá)到0.5左右。(2)將菌液置于冰水浴中15min，使菌液迅速冷卻。(3)分裝菌液于若干個(gè)1.5mL離心管中，8000rpm離心1min后棄去上清，用0.1M的CaCl₂溶液洗細(xì)胞2-3次。(4)經(jīng)過(guò)清洗的菌液用80μL CaCl₂和40μL50％的甘油懸浮后，于-40℃長(zhǎng)期保存。

轉(zhuǎn)化：將10μL重組質(zhì)粒pET-28a(+)-leudh和pET-28a(+)-fdh各加入到兩管E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻后置于冰上45min，然后42℃水浴熱激90s后再置于冰上5min，然后加入800μLLB液體培養(yǎng)基后置于37℃培養(yǎng)1h后，8000rpm離心1min棄去上清，將剩余菌液涂布于含卡那霉素抗性的LB平板上，37℃培養(yǎng)后挑取陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，得到重組菌E.coli BL21/pET-28a(+)-leudh和E.coli BL21/pET-28a(+)-fdh。

實(shí)施例7：E.coli BL21/pET-28a(+)-leudh亮氨酸脫氫酶活力測(cè)定

將實(shí)施例4構(gòu)建的重組菌E.coli BL21/pET-28a(+)-leudh與出發(fā)菌株E.coliBL21/pET-28a(+)分別接種于10ml含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日按1％的接種量轉(zhuǎn)接于50ml LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2h后至OD₆₀₀為0.8時(shí)加入終濃度為0.8mM的IPTG，28℃誘導(dǎo)9h后將菌液于4℃，10000r/min離心10min，pH 7.5的磷酸鹽緩沖液(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄)清洗2次，最后用5ml pH 7.5磷酸鹽緩沖液懸浮。超聲波破碎處理制備粗酶液。

配置84.7mM戊酮酸溶液，3mg/mL NADH溶液及900mM氯化銨溶液(pH 9.5)，取1.2mL氯化銨溶液置于石英比色皿中，再依次加入120μL NADH溶液，10μL戊酮酸溶液及2μL粗酶液，在340nm下檢測(cè)每分鐘的吸光值變化，酶活定義單位為1min催化1umol NADH轉(zhuǎn)化成NAD⁺所需的酶量。

結(jié)果表明重組菌E.coli BL21/pET-28a(+)-leudh的酶活為8.13U/mL，而原始菌E.coli BL21/pET-28a(+)并沒(méi)有檢測(cè)到亮氨酸脫氫酶的酶活，從而實(shí)現(xiàn)了在E.coli BL21中亮氨酸脫氫酶酶活力的從無(wú)到有。

實(shí)施例8：E.coli BL21/pET-28a(+)-fdh甲酸脫氫酶活力測(cè)定

將實(shí)施例4構(gòu)建的重組菌E.coli BL21/pET-28a(+)-fdh與出發(fā)菌株E.coli BL21/pET-28a(+)分別接種于10ml含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日按1％的接種量轉(zhuǎn)接于50ml LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2h后至OD₆₀₀為0.8時(shí)加入終濃度為0.8mM的IPTG，28℃誘導(dǎo)9h后將菌液于4℃，10000r/min離心10min，pH 7.5的磷酸鹽緩沖液(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄)清洗2次，最后用5ml pH 7.5磷酸鹽緩沖液懸浮。超聲波破碎處理制備粗酶液。

配制17mg/mL的甲酸鈉溶液(pH 7.5)，3mg/mL的NAD⁺溶液,取1.48mL的甲酸鈉溶液置于石英比色皿中，依次加入80μL NAD+溶液和10μL粗酶液，在340nm下檢測(cè)每分鐘的吸光值變化，酶活定義單位為1min催化1umol NAD+轉(zhuǎn)化成NADH所需的酶量。

結(jié)果表明重組菌E.coli BL21/pET-28a(+)-fdh的酶活為0.22U/mL，而原始菌E.coli BL21/pET-28a(+)并沒(méi)有檢測(cè)到甲酸脫氫酶的酶活，從而實(shí)現(xiàn)了在E.coli BL21中甲酸脫氫酶酶活力的從無(wú)到有。

實(shí)施例9：利用D-氨基酸氧化酶，亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶通過(guò)動(dòng)力學(xué)拆分生產(chǎn)L-正纈氨酸。

將通過(guò)超聲破碎所獲得的D-氨基酸氧化酶，亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶粗酶液按照酶活添加量為2:1:0.5的比例加入到2L底物緩沖液中(0.1M磷酸鹽緩沖液)，初始DL-正纈氨酸底物濃度為5g/L，通過(guò)分批補(bǔ)料策略依次向反應(yīng)體系中補(bǔ)料，30℃轉(zhuǎn)化25h，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化25后，轉(zhuǎn)化液中的L-正纈氨酸的含量為80.09g/L，L-正纈氨酸產(chǎn)率為98.3％。

<110> 江南大學(xué)

<120>一種利用酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-正纈氨酸的方法

<160> 1

<210> 1

<211> 1071

<212> D-氨基酸氧化酶基因

<213> Trigonopsis variabilis

<400> 1

1 ATGGCTAAAA TCGTTGTTAT TGGTGCCGGT GTAGCCGGTT TAACTACAGC TCTTCAACTT

61 CTTCGTAAAG GACATGAGGT TACAATTGTG TCCGAGTTTA CGCCCGGTGA TCTTAGTATC

121 GGATATACCT CGCCTTGGGC AGGTGCCAAC TGGCTCACAT TTTACGATGG AGGCAAGTTA

181 GCCGACTACG ATGCCGTCTC TTATCCTATC TTGCGAGAGC TGGCTCGAAG CAGCCCCGAG

241 GCTGGAATTC GACTCATCAA CCAACGCTCC CATGTTCTCA AGCGTGATCT TCCTAAACTG

301 GAAGGTGCCA TGTCGGCCAT CTGTCAACGC AACCCCTGGT TCAAAAACAC AGTCGATTCT

361 TTCGAGATTA TCGAGGACAG GTCCAGGATT GTCCACGATG ATGTGGCTTA TCTAGTCGAA

421 TTTGCTTCCG TTTGCATCCA CGCCGGAGTC TACTTGAACT GGCTGATGTC CCAATGCTTA

481 TCGCTCGGCG CCACGGTGGA TAAACGTCGA GTGAACCATA TCAAGGATGC CAATTTACTA

541 CACTCCTCAG GATCACGCCC CGACGTGATT GTCAACTGTA GTGGTCTCTT TGCCCGGTTC

601 TTGGGAGGCG TCGAGGACAA GAAGATGTAC CCTATTCGAG GACAAGTCGT CCTTGTTCGA

661 AACTCTCTTC CTTTTATGGC CTCCTTTTCC AGCACTCCTG AAAAAGAAAA TGAAGACGAA

721 GCTCTATATA TCATGACCCG ATTCGATGGT ACTTCTATCA TTGGCGGTTG TTTCCAACCC

781 AACAACTGGT CATCCGAACC CGATCCTTCT CTCACCCATC GAATCCTGTC TAGAGCCCTC

841 GACCGATTCC CGGAACTGAC CAAAGATGGC CCTCTTGACA TTGTGCGCGG ATGCGTTGGC

901 CACCGTCCTG GTAGAGAGGG CGGTCCCCGA GTAGAATTAG AGAAGATCCC CGGCGTTGGC

961 TTTGTTGTCC ATAACTATGG TGCCGCCGGT GCTGGTTACC AGTCCTCTTA CGGCATGGCT

1021 GATGAAGCTG TTTCTTACGT CGAAAGAGCT CTTACTCGTC CAAACCTTTA G