本發(fā)明屬于中藥的技術領域，具體涉及一種玫瑰茄花萼多糖及其制備方法與應用。

背景技術：

免疫調節(jié)作用是多糖最重要的生物活性功能，一直是人們研究的熱點。免疫細菌多糖和人工合成的化合物，其不良反應和副作用已引起人們廣泛注意。而大多數(shù)高等植物來源的多糖均為無不良反應的物質，不會對機體產生較大的副作用，因此，從植物中分離的多糖在生物醫(yī)學上引起極大關注。目前已對百余種植物多糖進行了活性相關的研究報道。研究表明植物多糖可通過與免疫細胞表面的多種受體結合、激活不同的信號通路來調控動物機體內的免疫系統(tǒng)，包括：刺激巨噬細胞、T/B淋巴細胞、自然殺傷細胞的分泌或增殖；調節(jié)細胞因子的釋放；促進抗體的分泌；激活補體系統(tǒng)等。

對這些活性物質的作用機制也在不斷發(fā)展，其中多糖對非特異性誘導的免疫機制更受到人們的重視。植物多糖是最理想的免疫候選藥物。

玫瑰茄(Hibiscus Sabdariffa L.,Roselle)是錦葵科木槿屬一年生或多年生草本植物，又名洛神花、紅角葵、洛神葵、山茄等。玫瑰茄花擁有歷史悠久的食、藥雙重使用價值，植物的花萼、種子、莖和葉子都可利用。近年來研究及臨床證實，玫瑰茄具有抗氧化、抗腫瘤和增強免疫功能、降脂減肥、保護肝臟和心血管系統(tǒng)等多種藥用活性。目前，國內外對玫瑰茄的研究主要集中在玫瑰茄食用色素以及醇提水提物方面的活性，如對色素成分鑒定、色素穩(wěn)定性、水醇及其花色苷提物物活性等研究較多，而對玫瑰茄多糖類物質的研究卻鮮見報導。

技術實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術的不足和缺點，本發(fā)明的首要目的在于提供一種玫瑰茄花萼多糖的制備方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述制備方法得到的玫瑰茄花萼多糖。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述玫瑰茄花萼多糖的應用。

本發(fā)明的目的通過下述方案實現(xiàn)：

一種玫瑰茄花萼粗多糖的制備方法，包含如下步驟：

(1)將玫瑰茄(Hibiscus Sabdariffa L.)花萼粉碎后過篩，得到玫瑰茄花萼粉；蒸餾水加熱回流提取玫瑰茄花萼粉，然后將提取液離心，取上層澄清液，過濾，將濾液減壓濃縮，得到多糖溶液；

(2)將多糖溶液和經(jīng)過預處理的大孔吸附樹脂混合，脫色處理，然后過濾出多糖溶液，并用水反復洗出樹脂中吸附的多糖，將脫色后的多糖溶液合并，減壓濃縮，得到濃縮糖液；

(3)在濃縮糖液中加入沉淀劑進行沉淀，然后離心，棄去上清液，收集沉淀物并干燥，得到玫瑰茄花萼粗多糖(HSP-C)。

步驟(3)中所述沉淀劑為無水乙醇或體積分數(shù)為90～100％的乙醇溶液，所述沉淀劑的加入量為濃縮糖液體積的3～5倍。

步驟(1)中所述的熱水回流提取的水料比為15:1～30:1(m/m)；

步驟(1)中所述加熱回流的溫度為75～100℃；所述的熱水回流提取的時間為2～4h，熱水回流提取的次數(shù)為2～4次；

步驟(1)中所述的離心的轉速為3000～5000r/min；所述的離心的時間為8～12min；過濾的次數(shù)為2～4次；

步驟(2)所述脫色處理的條件為于40～60℃水浴2～4h。

步驟(2)中所述的大孔吸附樹脂選用為D354FD樹脂；

步驟(2)中所述的大孔吸附樹脂的預處理的方法為：將大孔吸附樹脂先用蒸餾水浸泡12～24h，然后先用質量分數(shù)為3～5％的鹽酸溶液浸泡0.5～3h，蒸餾水洗至中性，再用質量分數(shù)為3～5％的氫氧化鈉溶液浸泡0.5～3h，蒸餾水洗至中性，得到經(jīng)過預處理的大孔吸附樹脂；

步驟(1)和(2)中所述減壓濃縮的溫度為40～60℃；

步驟(3)中所述的沉淀的溫度為0～4℃，沉淀的時間為8～24h；

步驟(3)中所述的離心的轉速為3000～5000r/min；所述的離心的時間為12～15min；

步驟(3)中所述的干燥的溫度為40～60℃，干燥至恒重。

一種玫瑰茄花萼粗多糖(HSP-C)，通過上述制備方法制備得到；

四種玫瑰茄花萼精制多糖(HSP-I，HSP-II，HSP-III和HSP-IV)，通過將上述玫瑰茄花萼粗多糖進一步純化得到。

所述的四種玫瑰茄花萼精制多糖(HSP-I，HSP-II，HSP-III和HSP-IV)都為均一組分，其分子量(Mn)依次分別為8733Da，14190Da，44408Da和70422Da。

所述的玫瑰茄花萼精制多糖(HSP-I，HSP-II，HSP-III和HSP-IV))通過如下步驟制備得到：

(1)將經(jīng)過預處理的DEAE-52樹脂于40～60℃旋轉蒸發(fā)除氣泡后轉入Z型層析柱中，用恒流泵泵送蒸餾水以使填料裝柱均勻，平衡后流速5～10s/滴；

(2)將玫瑰茄花粗多糖配制成多糖溶液，轉入層析柱中，依次用蒸餾水、0.1mol/L NaCl、0.2mol/L NaCl、0.3mol/L NaCl溶液洗脫，流速5～10s/滴，分別收集各流份，苯酚-硫酸法跟蹤檢測洗脫液，測定490nm下的吸光度，繪制洗脫曲線，同一吸收峰內的洗脫液合并；然后旋蒸濃縮，透析，真空冷凍干燥，經(jīng)過DEAE-52離子交換柱層析后得到四個組分，分別命名為HSP-I，HSP-II，HSP-III和HSP-IV；

步驟(1)中所述的DEAE-52樹脂預處理的方法為：將DEAE-52樹脂用4～30℃的蒸餾水浸泡12～24h；然后用0.3～0.5mol/L的鹽酸溶液浸泡0.5～2h，蒸餾水洗至中性；再用0.3～0.5mol/L的NaOH溶液浸泡0.5～2h，蒸餾水洗至中性，得到經(jīng)過預處理的DEAE-52樹脂；

步驟(2)中所述的旋蒸濃縮的溫度為40～60℃。

所述的玫瑰茄花萼粗多糖或玫瑰茄花萼精制多糖在制備免疫增強藥物中的應用；

所述的玫瑰茄花萼粗多糖或玫瑰茄花萼精制多糖可作為新型的免疫增強藥物，應用于治療免疫缺乏癥的藥物。

一種免疫增強藥物，含有上述玫瑰茄花萼粗多糖或玫瑰茄花萼精制多糖。

本發(fā)明的原理：植物來源的多糖能通過促進小鼠脾細胞增殖和調節(jié)巨噬細胞的免疫功能體現(xiàn)出各種有益的藥理作用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)和確證植物多糖HSP-C，HSP-I，HSP-II，HSP-III和HSP-IV(尤其是HSP-II)，具有顯著的免疫增強活性，且使用劑量低，在同樣劑量下的毒副作用也較低。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果：

(1)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)玫瑰茄花萼粗多糖及其精制多糖能顯著促進小鼠脾細胞增殖，增強淋巴細胞的免疫調節(jié)功能，進而改善機體的免疫水平；

(2)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)玫瑰茄花萼粗多糖及精制多糖能顯著增強RAW264.7巨噬細胞NO的釋放；

(3)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)玫瑰茄精制多糖(HSP-II)能顯著增強RAW264.7巨噬細胞IL-6及TNF-α的釋放；

(4)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)玫瑰茄花萼精制多糖(HSP-II)能顯著增加RAW264.7巨噬細胞IL-1β、iNOS和IL-6mRNA的表達；

(5)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)玫瑰茄花萼精制多糖(HSP-II)能顯著增加RAW264.7巨噬細胞p-ERK,p-JNK,p-P38和p-P65的表達，提示其可能通過激活MAPKs和NF-κBp65信號通路發(fā)揮免疫調節(jié)作用；

(6)玫瑰茄花萼粗多糖及精制多糖的用藥劑量比較低，而且在有效用藥劑量范圍內毒性較低。

附圖說明

圖1是實施例4的離子交換柱層析洗脫曲線圖；

圖2是實施例4制備得到的玫瑰茄花萼精制多糖(HSP-I，HSP-II，HSP-III和HSP-IV)的紫外掃描光譜圖；

圖3是實施例4制備得到的玫瑰茄花萼精制多糖(HSP-I，HSP-II，HSP-III和HSP-IV)的紅外光譜圖；其中A:HSP-I；B:HAP-II；C:HAP-III；D:HAP-IV；

圖4是實施例4制備得到的玫瑰茄花萼精制多糖(HSP-I，HSP-II，HSP-III和HSP-IV)的GPC圖譜；其中A:HSP-I；B:HAP-II；C:HAP-III；D:HAP-IV；

圖5是玫瑰茄花萼多糖(HSP-C，HSP-I，HSP-II，HSP-III和HSP-IV)對小鼠脾細胞增殖的影響圖；其中圖A為玫瑰茄花萼精制多糖刺激小鼠脾細胞增殖的影響，圖B為玫瑰茄花萼精制多糖協(xié)同ConA刺激小鼠脾細胞增殖的影響，圖C為玫瑰茄花萼精制多糖協(xié)同LPS刺激小鼠脾細胞增殖的影響；

圖6是玫瑰茄花萼多糖(HSP-C，HSP-I，HSP-II，HSP-III和HSP-IV)對RAW264.7巨噬細胞釋放NO的影響圖；

圖7是玫瑰茄花萼精制多糖(HSP-II)對RAW264.7巨噬細胞釋放IL-6的影響圖；

圖8是玫瑰茄花萼精制多糖(HSP-II)對RAW264.7巨噬細胞釋放TNF-α的影響圖；

圖9是玫瑰茄花萼精制多糖(HSP-II)對RAW264.7巨噬細胞iNOS mRNA表達的影響圖，其中，*：與control組比較，P<0.05；**：與control組比較，P<0.01；

圖10是玫瑰茄花萼精制多糖(HSP-II)對RAW264.7巨噬細胞IL-6mRNA表達的影響圖，其中，*：與control組比較，P<0.05；**：與control組比較，P<0.01；

圖11是玫瑰茄花萼精制多糖(HSP-II)對RAW264.7巨噬細胞IL-1βmRNA表達的影響圖，其中，*：與control組比較，P<0.05；**：與control組比較，P<0.01；

圖12是玫瑰茄花萼精制多糖(HSP-II)對RAW264.7巨噬細胞p-ERK蛋白表達的影響圖，其中，*：與control組比較，P<0.05；**：與control組比較，P<0.01；其中圖A-1為p-ERK蛋白表達曝光圖，圖A-2為p-ERK蛋白相對表達量；

圖13是玫瑰茄花萼精制多糖(HSP-II)對RAW264.7巨噬細胞p-JNK蛋白表達的影響圖，其中，*：與control組比較，P<0.05；**：與control組比較，P<0.01；其中圖B-1為p-JNK蛋白表達曝光圖，圖B-2為p-JNK蛋白相對表達量；

圖14是玫瑰茄花萼精制多糖(HSP-II)對RAW264.7巨噬細胞p-P38蛋白mRNA表達的影響圖，其中，*：與control組比較，P<0.05；**：與control組比較，P<0.01；其中圖C-1為p-P38蛋白表達曝光圖，圖C-2為p-P38蛋白相對表達量；

圖15是玫瑰茄花萼精制多糖(HSP-II)對RAW264.7巨噬細胞p-P65蛋白mRNA表達的影響圖，其中，*：與control組比較，P<0.05；**：與control組比較，P<0.01；其中圖D-1為p-P65蛋白表達曝光圖，圖D-2為p-P65蛋白相對表達量。

具體實施方式

下面結合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例中，小鼠巨噬細胞RAW 264.7購自中科院上海生命科學研究院細胞資源中心；玫瑰茄花萼購于廣州清平藥材市場，產地為云南。

實施例1

從玫瑰茄花萼中制備得到玫瑰茄花萼粗多糖(HSP-C)：

(1)玫瑰茄花萼粉碎后過20目篩，稱取100g，用蒸餾水加熱回流提取，其中，水料比為30:1(質量比)，回流提取溫度為75℃，回流提取時間為4h，回流提取次數(shù)3次；然后合并提取液，4000rpm下離心10min，取上層澄清液，濾紙過濾3次，將濾液用旋轉蒸發(fā)儀在40℃下減壓濃縮至200mL，得到多糖溶液；

(2)將D354FD樹脂先用蒸餾水浸泡12h，然后用質量分數(shù)為5％的鹽酸溶液浸泡0.5h，水洗至中性，再用質量分數(shù)為5％的氫氧化鈉溶液浸泡0.5h，然后蒸餾水洗至中性，得到經(jīng)過預處理的D354FD樹脂備用；

(3)將步驟(1)制備得到的多糖溶液和經(jīng)過預處理的D354FD樹脂等體積混合，置于50℃恒溫水浴鍋中恒溫水浴3h進行脫色，間隔攪拌，然后用200目的濾布過濾出多糖溶液，并用水反復清洗4次洗出樹脂中吸附的多糖，將脫色后的多糖液合并，用旋轉蒸發(fā)儀在40℃下減壓濃縮至200mL，得到濃縮糖液；

(4)在步驟(3)制備得到的濃縮糖液中加入4倍體積無水乙醇，邊加邊磁力攪拌，于4℃條件下醇沉8h，然后4000rpm下離心分離15min，棄去上清液，取出沉淀物于45℃烘干，得到玫瑰茄花萼粗多糖(HSP-C)。

實施例2

從玫瑰茄花萼中制備得到玫瑰茄花萼粗多糖(HSP-C)：

(1)玫瑰茄粉碎后過20目篩，稱取100g，然后蒸餾水加熱回流提取，其中，水料比30:1(質量比)，回流提取溫度為85℃，回流提取時間為3h，回流提取次數(shù)2次；然后合并提取液，3000rpm下離心8min，取上層澄清液，濾紙過濾2次，將濾液用旋轉蒸發(fā)儀在50℃下減壓濃縮至200mL，得到多糖溶液；

(2)將D354FD樹脂先用蒸餾水浸泡24h，然后用質量分數(shù)為5％的鹽酸溶液浸泡2h，蒸餾水洗至中性，再用質量分數(shù)為5％的氫氧化鈉溶液浸泡2h，蒸餾水洗至中性，得到經(jīng)過預處理的D354FD樹脂備用；

(3)將步驟(1)制備得到的多糖溶液和經(jīng)過預處理的D354FD樹脂等體積混合，置于40℃恒溫水浴鍋中恒溫水浴2h進行脫色，間隔攪拌，然后用200目的濾布過濾出多糖溶液，并用水反復洗出樹脂中吸附的多糖，將脫色后的多糖液合并，用旋轉蒸發(fā)儀在50℃下減壓濃縮至200mL，得到濃縮糖液；

(4)在步驟(3)中制備得到的濃縮糖液中加入3倍體積的無水乙醇，邊加邊磁力攪拌，于0℃條件下醇沉12h，然后3000rpm下離心分離12min，棄去上清液，取出沉淀物于50℃烘干，得到玫瑰茄花萼粗多糖(HSP-C)。

實施例3

從玫瑰茄花萼中制備得到玫瑰茄花萼粗多糖(HSP-C)：

(1)玫瑰茄粉碎后過20目篩，稱取100g，用蒸餾水加熱回流提取，其中，水料比為30:1(質量比)，回流提取溫度為95℃，回流提取時間為2h，回流提取次數(shù)4次，然后合并提取液，5000r/min下離心12min，取上層澄清液，濾紙過濾4次，將濾液用旋轉蒸發(fā)儀在60℃下減壓濃縮至200mL，得到多糖溶液；

(2)將D354FD樹脂先用蒸餾水浸泡18h，然后用質量分數(shù)為5％的鹽酸溶液浸泡3h，蒸餾水洗至中性，再用質量分數(shù)為5％的氫氧化鈉溶液浸泡3h，蒸餾水洗至中性，得到經(jīng)過預處理的D354FD樹脂備用；

(3)將(1)中制備得到的多糖溶液和經(jīng)過預處理的D354FD樹脂等體積混合，置于60℃恒溫水浴鍋中恒溫水浴4h進行脫色，間隔攪拌，之后用200目的濾布過濾出多糖溶液，并用水反復洗出樹脂中吸附的多糖，將脫色后的多糖液合并，用旋轉蒸發(fā)儀在60℃下減壓濃縮至200mL，得到濃縮糖液；

(4)在步驟(3)制備得到的濃縮糖液中加入5倍體積的無水乙醇，邊加邊磁力攪拌，于4℃條件下醇沉24h，然后5000rpm下離心分離14min，棄去上清液，取出沉淀物于60℃烘干，得到玫瑰茄花萼粗多糖(HSP-C)。

實施例4

玫瑰茄花萼精制多糖(HSP-I，HSP-II，HSP-III和HSP-IV)的制備：

(1)DEAE-52預處理：取70g的DEAE-52，用蒸餾水4℃浸泡24h，然后小心將上層水倒出，除去雜質，再用0.5mol/L的鹽酸溶液浸泡0.5h，將上層酸液小心倒出，抽濾至干后用蒸餾水洗脫至中性，再用0.5mol/L的NaOH溶液浸泡0.5h，小心倒出上層堿液，抽濾至干后用蒸餾水洗至中性備用；

(2)將經(jīng)過預處理的DEAE-52于48℃旋轉蒸發(fā)除氣泡后玻璃棒引流轉入2.6×30cm規(guī)格的Z型層析柱中，用恒流泵泵送蒸餾水以使填料裝柱均勻，平衡后7s/滴；

(3)稱取100mg實施例1中制備得到的玫瑰茄花萼粗多糖(HSP-C)，配制成多糖溶液，玻璃棒引流至層析柱中，依次用蒸餾水、0.1mol/L NaCl、0.2mol/L NaCl、0.3mol/L NaCl溶液洗脫，自動收集各流份，每根管收集大約5mL，苯酚-硫酸法跟蹤檢測洗脫液，測定490nm處的吸光度，繪制洗脫曲線，同一吸收峰內的洗脫液合并；然后洗脫液40℃旋蒸濃縮，真空冷凍干燥，其中，HSP-c經(jīng)過DEAE-52離子交換柱層析后得到四個組分，分別命名為HSP-I，HSP-II，HSP-III和HSP-IV，其中，圖1為本實施例的離子交換柱層析洗脫曲線圖。

實施例5

玫瑰茄精制多糖(HSP-I，HSP-II，HSP-III和HSP-IV)的制備：

(1)DEAE-52預處理：取70g的DEAE-52，用蒸餾水20℃浸泡12h，然后小心將上層水倒出，除去雜質，再用0.5mol/L的鹽酸溶液浸泡1h，將上層酸液小心倒出，抽濾至干后用蒸餾水洗脫至中性，再用0.5mol/L的NaOH溶液浸泡1h，小心倒出上層堿液，抽濾至干后用蒸餾水洗至中性備用；

(2)將經(jīng)過預處理的DEAE-52于48℃旋轉蒸發(fā)除氣泡后玻璃棒引流轉入2.6×30cm規(guī)格的Z型層析柱中，用恒流泵泵送蒸餾水以使填料裝柱均勻，平衡后7s/滴；

(3)稱取100mg實施例1中制備得到的玫瑰茄花萼粗多糖(HSP-C)，配制成多糖溶液，玻璃棒引流至層析柱中，依次用蒸餾水、0.1mol/L NaCl、0.2mol/L NaCl、0.3mol/L NaCl溶液洗脫，自動收集各流份，每根管收集大約5mL，苯酚-硫酸法跟蹤檢測洗脫液，測定490nm處的吸光度，繪制洗脫曲線，同一吸收峰內的洗脫液合并；然后洗脫液50℃旋蒸濃縮，真空冷凍干燥，其中，HSP-c經(jīng)過DEAE-52離子交換柱層析后得到四個組分，分別命名為HSP-I，HSP-II，HSP-III和HSP-IV，其中，本實施例的離子交換柱層析洗脫結果同實施例4。

實施例6

玫瑰茄精制多糖(HSP-I，HSP-II，HSP-III和HSP-IV)的制備：

(1)DEAE-52預處理：取70g的DEAE-52，用蒸餾水25℃浸泡20h，然后小心將上層水倒出，除去雜質，再用0.5mol/L的鹽酸溶液浸泡0.8h，將上層酸液小心倒出，抽濾至干后用蒸餾水洗脫至中性，再用0.5mol/L的NaOH溶液浸泡0.8h，小心倒出上層堿液，抽濾至干后用蒸餾水洗至中性備用；

(2)將經(jīng)過預處理的DEAE-52于48℃旋轉蒸發(fā)除氣泡后玻璃棒引流轉入2.6×30cm規(guī)格的Z型層析柱中，用恒流泵泵送蒸餾水以使填料裝柱均勻，平衡后7s/滴；

(3)稱取100mg實施例1中制備得到的玫瑰茄粗多糖(HSP-C)，配制成多糖溶液，玻璃棒引流至層析柱中，依次用蒸餾水、0.1mol/L NaCl、0.2mol/L NaCl、0.3mol/L NaCl溶液洗脫，自動收集各流份，每根管收集大約5mL，苯酚-硫酸法跟蹤檢測洗脫液，測定490nm處的吸光度，繪制洗脫曲線同一吸收峰內的洗脫液合并；然后洗脫液60℃旋蒸濃縮，真空冷凍干燥，其中，HSP-c經(jīng)過DEAE-52離子交換柱層析后得到四個組分，分別命名為HSP-I，HSP-II，HSP-III和HSP-IV，其中，本實施例的離子交換柱層析洗脫結果同實施例4。

實施例7紫外掃描圖譜和紅外光譜掃描

(1)分別取實施例4～6中制備得到的玫瑰茄精制多糖(HSP-I，HSP-II，HSP-III和HSP-IV)4mg，配制成1mg/mL的多糖溶液，以蒸餾水為對照，于190～500nm處測其吸光度值。

(2)分別取實施例4～6中制備得到的玫瑰茄精制多糖(HSP-I，HSP-II，HSP-III和HSP-IV)2mg，與KBr混合研細成均勻薄層狀，在4000～400cm^-1波數(shù)范圍內進行紅外掃描。

圖2是實施例4制備得到的玫瑰茄花萼精制多糖(HSP-I，HSP-II，HSP-III和HSP-IV)的紫外掃描光譜圖；圖3是實施例4制備得到的玫瑰茄花萼精制多糖(HSP-I，HSP-II，HSP-III和HSP-IV)的紅外光譜圖；其中A:HSP-I；B:HAP-II；C:HAP-III；D:HAP-IV。

結果分析：

(1)多糖紫外光譜分析結果：實施例4中制備得到的玫瑰茄精制多糖均在200～280nm有較強的吸收，表明樣品中可能含有不飽和羰基和羧基，在280nm和260nm均無明顯吸收峰，說明四種多糖均不含蛋白質和核酸，或者兩者含量都比較少(圖2)。實施例5和實施例6的檢測結果同實施例4。

(2)多糖紅外光譜分析結果：

實施例4中制備得到的玫瑰茄精制多糖HSP-I(圖3-A)，HSP-II(圖3-B)，HSP-III(圖3-C)和HSP-IV(圖3-D)依次在波數(shù)3399、3393、3398、3398cm-¹處的強吸收峰是糖類分子間或分子內的O-H伸縮振動峰，在波數(shù)2927、2930、2932、2932cm-¹處存在的稍弱的吸收峰為次甲基或甲基的C-H的伸縮振動，在波數(shù)1417cm-¹和1331cm-¹附近的雙峰為C-H的變角振動，此為糖類化合物的特征吸收峰。四種多糖在波數(shù)1647～1620cm-¹處明顯吸收峰是羰基C＝O的伸縮振動，加之1200～1000cm-¹的C-OH伸縮振動，印證HSP-I、HSP-II、HSP-III和HSP-IV中含有糖醛酸，進一步說明四種多糖均是酸性多糖。此外，四種多糖在1200～1000cm-¹的有3～4個吸收峰表示HSP-I、HSP-II、HSP-III和HSP-IV糖環(huán)構型為吡喃型(呋喃型在此區(qū)間有兩個吸收峰)。在波數(shù)917cm^-1和890cm-¹附近的吸收峰是四氫吡喃環(huán)的非對稱伸縮振動所造成的C-O-C骨架振動和β-D-葡萄吡喃糖C-H的變角振動，在764cm-¹處為D-吡喃葡萄糖環(huán)的振動，表明四個組分均含有β-D-吡喃葡萄糖環(huán)。此外，玫瑰茄花萼四種精制多糖在820cm-¹的特征吸收峰，表示存在鼠李糖苷(圖3)。實施例5和實施例6的檢測結果同實施例4。

實施例8 HSP-I，HSP-II，HSP-III和HSP-IV的分子量及純度鑒定

采用高效液相色譜儀分別對實施例4～6制備得到的玫瑰茄花萼精制多糖(HSP-I，HSP-II，HSP-III和HSP-IV)的分子量及其純度進行測定。色譜條件：TSK G-5000PXL column(7.8×300mm)和TSK G-3000PXL column(7.8×300mm)串聯(lián)，流動相為0.02mol/L的KH₂PO₄緩沖溶液，流速為0.6mL/min，2414示差檢測器，柱溫35℃。

結果分析：

實施例4制備得到的玫瑰茄花萼精制多糖(HSP-I，HSP-II，HSP-III和HSP-IV)的GPC圖譜如圖4所示。實施例4制備得到的HSP-I(圖4-A)，HSP-II(圖4-B)，HSP-III(圖4-C)和HSP-IV(圖4-D)的GPC圖均為單一對稱峰，表明HSP-I，HSP-II，HSP-III和HSP-IV都是均一多糖，其峰位分子質量(Mp)分別為8733Da，14190Da，44408Da和137448Da；數(shù)均分子質量(M_n)分別為513Da，10431Da，32418Da和113870Da；重均分子質量(M_w)分別為8072Da，18667Da，50978Da和175780Da；Z均分子質量(M_z)分別為10984Da，29174Da，70422Da和307262Da(圖4)。實施例5和6結果同實施例4。

實施例9玫瑰茄花萼多糖對小鼠脾細胞增殖影響

制備小鼠脾細胞懸液：先用乙醚使小鼠迷暈，用無菌鑷子使其頸椎脫臼處死，接著用75％的乙醇完全浸沒小鼠2min后，轉移至超凈工作臺，無菌條件下分離出小鼠脾臟。將分離的脾臟置于浸泡有無菌的PBS溶液的200目的上面，用玻璃棒均勻研磨。之后以1000rpm離心5min沉淀脾臟細胞，倒棄上清液，加入配置好的裂解液，巴士滴管吹打1～2min后立即加入4mL的PBS用以平衡脾臟細胞的滲透壓。細胞懸液再次于1000rpm離心5min，之后倒棄上清后用適量的RPMI-1640完全培養(yǎng)液溶解，巴士滴管吹打均勻，即得到小鼠單個脾臟細胞懸液。血細胞計數(shù)板計數(shù)，以RPMI-1640完全培養(yǎng)液稀釋調整脾細胞濃度為20萬個/mL，50μL/孔接種于96孔板中，再分別加入40μL/孔的各濃度多糖樣品(以100μL溶液體系計的各多糖樣品濃度為50、100、200、400μg/mL)(實施例1制備得到的玫瑰茄花萼粗多糖HSP-C，和實施例4制備玫瑰茄花萼精制多糖HSP-I，HSP-II，HSP-III和HSP-IV)，每個濃度6個復孔。按以下方式給藥分組：10μL/孔的完全培養(yǎng)液+40μL的HSP樣品溶液(以100μL溶液體系計的各多糖樣品濃度為50、100、200、400μg/mL)組；10μL/孔的LPS(終濃度10μg/mL)+40μL/孔的HSP樣品溶液協(xié)同組；10μL/孔的ConA(終濃度5μg/mL)+40μL/孔的HSP樣品溶液協(xié)同組；以40μL/孔完全培養(yǎng)液代替各濃度多糖樣品，分別加入10μL完全培養(yǎng)液作為空白組，加入10μL LPS或者ConA作為對照，另設100μL完全培養(yǎng)液用于調零組。各樣品的每個濃度設6個復孔。給藥后，96孔板置于37℃、5％CO₂細胞培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)68h，之后各孔加入20μL的5mg/mL的MTT工作液。于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h后，按100μL/孔加入酸性異丙醇，放置12h，設置酶標儀程序震蕩60s后在570nm波長下測定各孔的吸光度值。

圖5是玫瑰茄花萼多糖(HSP-C，HSP-I，HSP-II，HSP-III和HSP-IV)對小鼠脾細胞增殖的影響圖；其中圖A為玫瑰茄花萼精制多糖刺激小鼠脾細胞增殖的影響，圖B為玫瑰茄花萼精制多糖協(xié)同ConA刺激小鼠脾細胞增殖的影響，圖C為玫瑰茄花萼精制多糖協(xié)同LPS刺激小鼠脾細胞增殖的影響。

實施例1制備的粗多糖HSP-C，實施例4制備玫瑰茄花萼精制多糖HSP-I，HSP-II，HSP-III和HSP-IV能夠促進ConA和LPS誘導的小鼠脾細胞增殖。

實施例10 Griess法檢測HSP-C，HSP-I，HSP-II，HSP-III和HSP-IV對RAW264.7細胞釋放NO的影響

常規(guī)培養(yǎng)細胞，取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，吹打細胞成單細胞懸液，顯微鏡下用血細胞計數(shù)板計數(shù)后，1000rpm/min，離心5min去上清，培養(yǎng)基重懸并調整細胞濃度，按20萬個/孔的細胞密度接種于24孔培養(yǎng)板，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)，貼壁24h，吸棄上清，按如下分組要求給藥，每組設3個復孔：Control組，脂多糖(LPS，終濃度為1μg/mL)組，多糖樣品組(實施例1制備得到的玫瑰茄花萼粗多糖HSP-C，和實施例4制備玫瑰茄花萼精制多糖HSP-I，HSP-II，HSP-III和HSP-IV，終濃度為31.25、62.5、125、250、400、500μg/mL)組，對照組添加同體積的培養(yǎng)基。給藥后，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)24h。分別取各孔細胞上清100μL，相應加入另一新的96孔板中。每孔加50μL Griess試劑A和50μL Griess試劑B，然后置于37℃培養(yǎng)箱中反應10min，立即置板于多標記微孔板檢測儀上，在550nm波長下檢測各孔吸光度值。

圖6是玫瑰茄花萼多糖(HSP-C，HSP-I，HSP-II，HSP-III和HSP-IV)對RAW264.7巨噬細胞釋放NO的影響圖。

HSP-C，HSP-I、HSP-II、HSP-III和HSP-IV能夠促進RAW264.7巨噬細胞NO的釋放，尤其是HSP-II效果最顯著且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性(圖6)。

實施例11 Elisa法檢測HSP-I，HSP-II，HSP-III和HSP-IV對RAW264.7細胞釋放IL-6及TNF-α的影響

常規(guī)培養(yǎng)細胞，取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，吹打細胞成單細胞懸液，顯微鏡下用血細胞計數(shù)板計數(shù)后，1000r/min，離心5min去上清，培養(yǎng)基重懸并調整細胞濃度，按20萬個/孔的細胞密度接種于24孔培養(yǎng)板，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)，貼壁24h，吸棄上清，按如下分組要求給藥，每組設3個復孔：Control組，脂多糖(LPS，終濃度為1μg/mL)組，多糖樣品組(實施例4制備得到的玫瑰茄精制多糖HSP-II，終濃度為31.25、62.5、125、250、500μg/mL),對照組添加同體積的培養(yǎng)基。給藥后，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)24h。分別取各孔細胞上清按照Mouse IL-6ELISA Kit和Mouse TNF-αELISA Kit操作方法檢測細胞因子的釋放情況。

圖7是玫瑰茄花萼精制多糖(HSP-II)對RAW264.7巨噬細胞釋放IL-6的影響圖；圖8是玫瑰茄花萼精制多糖(HSP-II)對RAW264.7巨噬細胞釋放TNF-α的影響圖。

HSP-II能夠促進RAW264.7巨噬細胞IL-6(圖7)及TNF-α(圖8)的釋放，并呈現(xiàn)梯度依賴性。

實施例12 HSP-II對RAW264.7細胞iNOS、IL-6和IL-1βmRNA表達的影響

常規(guī)培養(yǎng)細胞，取對生長數(shù)期的細胞，按100萬/孔細胞數(shù)接種于6孔板，孵育24h后，吸棄上清，按如下分組要求給藥，每組設3個復孔。Control組，脂多糖(LPS，終濃度為1μg/mL)組，HSP-II組(實施例4制備得到的玫瑰茄精制多糖，終濃度為62.5、125、250、500μg/mL)，對照組添加同體積的培養(yǎng)基。給藥后，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)24h。作用24h后，吸棄細胞上清，PBS洗2次。每孔加入Trizol 1mL，靜置5min，吸管吹打至液體無粘稠物，吸取細胞裂解液轉入EP管，每管加入0.2mL氯仿，蓋上EP管蓋，手持用力上下震蕩10s，室溫靜置5min，4℃以12,000rpm離心15min，離心后轉移上層水相至另一EP管中，加入0.5mL異丙醇，室溫靜置10min，4℃離心機以12,000rpm離心10min，小心吸棄去上清，用冷75％乙醇1mL清洗2次，分別4℃條件下以7,500rpm離心5min，小心吸棄上清，空氣吹干，約15min，加入0～50μL RNase-free純水，60℃加熱10min溶解沉淀。測定mRNA的純度和濃度。并用RevertAid First Strand cnthesis Kit(Thermo公司)反轉錄試劑盒，20μL反應體系，對RNA進行逆轉錄。采用DyNAmo Fla sh SYRB Green qPCR Kit(Thermo公司)試劑盒，ABI實時熒光定量PCR儀(Rrism 7500，Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA,USA)對mRNA進行擴增，擴增后用ABI PRISM 7500SDS軟件中Relative Quantification(ddCt)Study法進行自動分析以獲得目的基因的相對表達量。相關基因mRNA引物序列為GAPDH((forward,5′-TTTGTCAAGCTCATTTCCTGGTATG-3′,reverse,5′-TGGGATAGGGCCTCTCTTGC-3′),IL-1β(forward,5′-TGAAGGGCTGCTTCCAAACCTTTGACC-3′,reverse,5′-TGTCCATTGAGGTGGAGAGCTTTCAGC-3′),IL-6(forward,5′-TACTCGGCAAACCTAGTGCG-3′,reverse,5′–GTGTCCCAACATTCATATTGTCAGT-3′),iNOS(forward,5′-CGGCAA ACATGACTTCAGGC-3′,reverse,5′-GCACATCAAAGCGGCCATAG-3′)。

圖9是玫瑰茄花萼精制多糖(HSP-II)對RAW264.7巨噬細胞iNOS mRNA表達的影響圖，其中，*：與control組比較，P<0.05；**：與control組比較，P<0.01；圖10是玫瑰茄花萼精制多糖(HSP-II)對RAW264.7巨噬細胞IL-6mRNA表達的影響圖，其中，*：與control組比較，P<0.05；**：與control組比較，P<0.01；圖11是玫瑰茄花萼精制多糖(HSP-II)對RAW264.7巨噬細胞IL-1βmRNA表達的影響圖，其中，*：與control組比較，P<0.05；**：與control組比較，P<0.01。

與control組相比，HSP-II可以顯著促進iNOS(圖9)、IL-6(圖10)、和IL-1β(圖11)的分泌(P＜0.05)，并呈現(xiàn)梯度依賴性。

實施例13 HSP-II對RAW264.7細胞p-ERK、p-JNK、P-p38和p-P65蛋白表達的影響

常規(guī)培養(yǎng)細胞，取對生長數(shù)期的RAW264.7細胞，按100萬/孔細胞數(shù)接種于6孔板，孵育24h后，吸棄上清，按如下分組要求給藥，每組設3個復孔。Control組，脂多糖(LPS，終濃度為1μg/mL)組，HSP-II組(實施例4制備得到的玫瑰茄精制多糖，終濃度為125、250、500μg/mL)，對照組添加同體積的培養(yǎng)基。給藥后，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)24h。24h后，吸棄細胞上清，并且用預冷的PBS清洗兩次，收集細胞至1.5mL離心管中，加入60μL的PIPA裂解液(含磷酸酶抑制劑(PhosSTOP，Roche)和蛋白酶抑制劑(cOmplete ULTRA Tablets，Mini，EDTA-free，EASYpack，Roche))，用1mL的注射器吸取裂解液反復吹打細胞至充分混勻，于冰上裂解40min，并每隔10min于渦旋振蕩器上振蕩15-20s。于4℃，12000rpm離心20min，將上清轉移至新的1.5mL EP管，然后采用BCA法檢測蛋白濃度(按照BCA Protein Assay Kit說明書進行)：先將濃度為2mg/mL的BSA溶液予超純去離子水稀釋為系列質量濃度(0μg/mL、25μg/mL、125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL)的標準品溶液，再根據(jù)需要配置一定量的工作液(BCA Solution:4％(體積分數(shù))Cupric Sulfate＝200:4)。取一塊無底物的96孔板，每孔分別加入已稀釋好的系列標準品溶液25μL，以及需要檢測的蛋白溶液25μL(已稀釋10倍)，每組均設置復孔。同時加入200μL/孔工作液，輕輕震蕩混勻，置于37℃孵育30min后，取出，于酶標儀570nm處檢測OD值。根據(jù)標準品蛋白溶液所測OD值繪制標準曲線，計算出待測蛋白溶液濃度。根據(jù)BCA法測得的蛋白濃度，計算出40μg總蛋白所需蛋白體積，同時加5μL 5×SDS-PAGE上樣緩沖液，再補充相應體積的超純去離子水至總體積為25μL，混勻，充分離心，使液體聚集在底部，100℃金屬浴加熱變性10min，離心，置于冰上備用。選擇10％(體積分數(shù))分離膠和5％(體積分數(shù))濃縮膠，將已變性好的蛋白樣品依次加入各泳道，樣品兩側的泳道分別加入5μL Marker。電泳槽中加入足夠量的TGS緩沖液，電泳條件為：100V，約150min，直至溴酚藍指示劑跑至距膠下緣約0.5cm時，停止電泳。然后在冰浴中以100V的電壓轉膜100min。用含5％(質量分數(shù))脫脂奶粉的TBST封閉，緩慢搖蕩1h。一抗抗體分別為：GAPDH(14c10)Rabbit mAb、pERK p-JNK、p-P38和NF-Κb p-P65(均購自CST公司)，二抗抗體為山羊抗兔(HRP標記)，購自聚研生物科技有限公司。按照說明書推薦的稀釋比例(1:1000)，配制一抗，室溫下輕搖孵育4h或4℃靜置過夜。一抗孵育結束后，更換二抗，HRP標記的二抗按相應比例稀釋(1:2000)，室溫輕搖1h。二抗結束后，加入發(fā)光液(購自BioFuture公司)并利用凝膠成像儀蛋白條帶顯影。

圖12是玫瑰茄花萼精制多糖(HSP-II)對RAW264.7巨噬細胞p-ERK蛋白表達的影響圖，其中，*：與control組比較，P<0.05；**：與control組比較，P<0.01；其中圖A-1為p-ERK蛋白表達曝光圖，圖A-2為p-ERK蛋白相對表達量。圖13是玫瑰茄花萼精制多糖(HSP-II)對RAW264.7巨噬細胞p-JNK蛋白表達的影響圖，其中，*：與control組比較，P<0.05；**：與control組比較，P<0.01；其中圖B-1為p-JNK蛋白表達曝光圖，圖B-2為p-JNK蛋白相對表達量。圖14是玫瑰茄花萼精制多糖(HSP-II)對RAW264.7巨噬細胞p-P38蛋白mRNA表達的影響圖，其中，*：與control組比較，P<0.05；**：與control組比較，P<0.01；其中圖C-1為p-P38蛋白表達曝光圖，圖C-2為p-P38蛋白相對表達量。圖15是玫瑰茄花萼精制多糖(HSP-II)對RAW264.7巨噬細胞p-P65蛋白mRNA表達的影響圖，其中，*：與control組比較，P<0.05；**：與control組比較，P<0.01；其中圖D-1為p-P65蛋白表達曝光圖，圖D-2為p-P65蛋白相對表達量。

正常組RAW264.7巨噬細胞內磷酸化的ERK、JNK、P38和P65蛋白表達較低，當不同濃度的HSP-II(終濃度為125、250、500μg/mL)和LPS(終濃度為1μg/mL)作用細胞24h后，細胞內磷酸化的ERK(圖12)、JNK(圖13)、P38(圖14)和P65(圖15)蛋白表達顯著上調(P＜0.01)，從而激活MAPK和NF-κB信號通路(圖12～15)。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。

SEQUENCE LISTING

<110> 華南理工大學

<120> 一種玫瑰茄花萼多糖及其制備方法與應用

<130> 1

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GAPDH的forward

<400> 1

tttgtcaagc tcatttcctg gtatg 25

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GAPDH的reverse

<400> 2

tgggataggg cctctcttgc 20

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-1β的forward

<400> 3

tgaagggctg cttccaaacc tttgacc 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-1β的reverse

<400> 4

tgtccattga ggtggagagc tttcagc 27

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-6的forward

<400> 5

tactcggcaa acctagtgcg 20

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-6的reverse

<400> 6

gtgtcccaac attcatattg tcagt 25

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> iNOS的forward

<400> 7

cggcaaacat gacttcaggc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> iNOS的reverse

<400> 8

gcacatcaaa gcggccatag 20