本發(fā)明屬于電離輻射導(dǎo)致的造血系統(tǒng)損傷的預(yù)防及治療領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及制備膜微粒的方法以及膜顆粒在預(yù)防或治療電離輻射導(dǎo)致的造血系統(tǒng)損傷以及促進(jìn)紅系細(xì)胞分化中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

電離輻射是由直接或間接電離粒子使受作用物質(zhì)發(fā)生電離現(xiàn)象的輻射。

電離輻射對(duì)機(jī)體的損傷可分為急性放射損傷和慢性放射損傷。機(jī)體大部分或全身短時(shí)間內(nèi)暴露于相對(duì)高劑量輻射(對(duì)于人體高于1Gy)可引起機(jī)體的急性損傷。急性損傷平時(shí)見于核事故和放射治療病人，通常稱作放射病(radiation sickness)或急性放射綜合征(acute radiation syndrome，ARS)。相對(duì)快速增殖的細(xì)胞及相應(yīng)組織和器官易感輻射損傷。包括皮膚、造血系統(tǒng)、胃腸道系統(tǒng)、血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等在內(nèi)的幾乎所有器官、系統(tǒng)均易發(fā)生病理改變，其中以神經(jīng)系統(tǒng)、造血系統(tǒng)和消化系統(tǒng)的改變最為明顯。而較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)分散接受一定劑量的照射，可引起慢性放射性損傷，如皮膚損傷、造血障礙、白細(xì)胞減少、生育力受損等。另外，輻射還可以致癌和引起胎兒的死亡和畸形。

臨床上用于預(yù)防或減輕輻射損傷的方法包括采用輻射防護(hù)劑、輻射緩解劑或輻射后治療刺激組織再生[Bentzen,S.M.Preventing or reducing late side effects of radiation therapy:radiobiology meets molecular pathology.Nat.Rev.Cancer 2006,6,702-713.Coleman,C.N.；Stone,H.B.；Moulder,J.E.；Pellmar,T.C.Medicine.Modulation of radiation injury.Science 2004,304,693-694.Whitnall,M.H.；Pellmar,T.C.In:New directions in development of pharmacological countermeasures for the acute radiation syndrome；Research Signpost:Trivandrum,India,2007.Chao,N.J.Accidental or intentional exposure to ionizing radiation:biodosimetry and treatment options.Exp.Hematol.2007,35,24-27.Waselenko,J.K.；MacVittie,T.J.；Blakely,W.F.；Pesik,N.；Wiley,A.L.；Dickerson,W.E.；Tsu,H.；Confer,D.L.；Coleman,C.N.；Seed,T.；Lowry,P.；Armitage,J.O.；Dainiak,N.Medical management of the acute radiation syndrome:recommendations of the Strategic National Stockpile Radiation Working Group.Ann.Intern.Med.2004,140,1037-1051.]。然而，迄今仍無(wú)批準(zhǔn)用于治療ARS的藥物。挽救造血衰竭是電離輻射損傷的關(guān)鍵治療策略之一，包括采用造血生長(zhǎng)因子或造血干細(xì)胞移植[Saha S,Bhanja P,Kabarriti R,Liu L,Alfieri AA,Guha C.Bone Marrow Stromal Cell Transplantation Mitigates Radiation-Induced Gastrointestinal Syndrome in Mice.PLoS One 2011；6:e24072.]，但后者受制于合適供者的可獲取性。

在再生療法和免疫治療的大背景下，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem/stromal cell，MSC)的治療潛力及安全性被廣為研究。已經(jīng)有大量報(bào)道采用MSC用于各種臨床試驗(yàn)及研究[Lalu,M.M.,McIntyre,L.,Pugliese,C.,et al.(2012).Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells(SafeCell):a systematic review and meta-analysis of clinical trials.PloS One,7,e47559.]?？偟膩?lái)看，MSC可通過其旁分泌機(jī)制發(fā)揮有益的治療作用，其核心機(jī)制在于包含生物活性成分的膜微?；蛭⑴?microvesicle(MV)，也稱為外泌體(exosome)或微顆粒(microparticle))。

MV包括來(lái)自于胞內(nèi)內(nèi)涵體(endosome)的外泌體(exosome)以及來(lái)自于細(xì)胞質(zhì)膜的脫落囊泡，前者大小一般為40～100nm，后者大小一般為100nm～1um。MV可通過表面受體相互作用以及轉(zhuǎn)移傳遞蛋白、mRNA和miRNA等參與細(xì)胞間通訊和調(diào)節(jié)靶細(xì)胞活動(dòng)，包括血管生成[Lee,J.K.,Park,S.R.,Jung,B.K.,et al.(2013).Exosomes derived from mesenchymal stem cells suppress angiogenesis by downregulating VEGF expression in breast cancer cells.PloS One,8,e84256.]、細(xì)胞增殖[Looze,C.,Yui,D.,Leung,L.,et al.(2009).Proteomic profiling of human plasma exosomes identifies PPARgamma as an exosomeassociated protein.Biochemical and Biophysical Research Communications,378,433–438.]和免疫調(diào)節(jié)[Robbins,P.D.,&Morelli,A.E.(2014).Regulation of immune responses by extracellular vesicles.Nature Reviews Immunology,14,195–208.]等。已有報(bào)道表明，MV可應(yīng)用于急性腎損傷、心肌梗死、肝纖維化、肺動(dòng)脈高壓、后肢缺血、腫瘤生長(zhǎng)抑制等[Akyurekli C,Le Y,Richardson RB,Fergusson D,Tay J,Allan DS.A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles.Stem Cell Rev.2015,11(1):150-60.]。但迄今未有MV用于預(yù)防及治療電離輻射損傷的報(bào)道。

此外，現(xiàn)有膜微粒制備技術(shù)如超速離心技術(shù)(UC)、密度梯度離心技術(shù)(DGC)、高效液相色譜技術(shù)(HPLC)等均需要精密昂貴儀器設(shè)備，并且工藝步驟繁瑣，有效處理體積極小，效率低下。因此，在本領(lǐng)域中，存在對(duì)于快速高效制備膜微粒的方法的需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)、尤其是臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stromal cells,UCMSCs)來(lái)源的MV可有效預(yù)防或治療電離輻射所致造血系統(tǒng)損傷。因此，本發(fā)明旨在提供一種制備膜微粒的新方法，并采用該方法所制備的膜微粒用于電離輻射導(dǎo)致的造血系統(tǒng)損傷的預(yù)防與治療。

miR-486是miRNA基因家族的成員。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在造血細(xì)胞過表達(dá)miR-486后收集膜微粒，其miR-486的表達(dá)與對(duì)照細(xì)胞收集膜微粒相比明顯升高。用過表達(dá)miR-486膜微粒處理造血細(xì)胞后可以促進(jìn)造血紅系分化能力。因此，本發(fā)明還旨在提供一種誘導(dǎo)紅系分化的新方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明涉及如下技術(shù)方案。

在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種制備膜微粒的方法，所述方法包括用聚乙二醇即PEG處理細(xì)胞培養(yǎng)物的上清。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括以下步驟：

a)收集細(xì)胞培養(yǎng)物上清；

b)將所述培養(yǎng)物上清離心；

c)收集并用聚乙二醇即PEG處理步驟b)中經(jīng)離心的上清；

d)離心步驟c)所獲得的上清，并棄去經(jīng)離心的上清，保留沉淀；

e)用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸沉淀，獲得膜微粒。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞或成纖維細(xì)胞或造血細(xì)胞。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟a)之前進(jìn)一步包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以釋放膜微粒的步驟。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)步驟包括在低氧低營(yíng)養(yǎng)條件下培養(yǎng)細(xì)胞例如間充質(zhì)干細(xì)胞或成纖維細(xì)胞或造血細(xì)胞。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟b)和d)中各自獨(dú)立地采用轉(zhuǎn)速小于或等于10,000rpm的低速離心機(jī)進(jìn)行離心。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟b)和d)中各自獨(dú)立地以2,000rpm至10,000rpm、2,500rpm至8,000rpm、2,600rpm至7,000rpm、2,700rpm至6,000rpm、2,800rpm至5,000rpm、2,900rpm至4,000rpm、或3,000rpm至3,500rpm的速度離心。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟b)中在約4℃離心5-15分鐘，例如10分鐘。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟d)中在約4℃離心25-35分鐘，例如30分鐘。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，PEG的分子量范圍為2000-8000。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，PEG選自由下列組成的組：PEG8000、PEG7000、PEG6000、PEG5000、PEG4000、PEG3000和PEG2000。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟c)中，以2:1至6:1的PEG/血清體積比加入PEG。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，PEG/血清體積比為6:1、5:1、4:1、3:1或2:1。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為臍帶、臍帶血、骨髓、胎盤組織、脂肪組織或牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞、或其組合。優(yōu)選地，所述細(xì)胞培養(yǎng)物為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，無(wú)血清培養(yǎng)基為α-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基。

在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及膜微粒在制備用于預(yù)防或治療電離輻射導(dǎo)致的造血系統(tǒng)損傷的藥物中的用途。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述膜微粒獲自間充質(zhì)干細(xì)胞或成纖維細(xì)胞。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述膜微粒獲自臍帶、臍帶血、骨髓、胎盤組織、脂肪組織或牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述膜微粒獲自臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述膜微粒是經(jīng)PEG處理的膜微粒。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述膜微粒是通過本文所述的方法制備的。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述膜微粒與另外的治療劑聯(lián)合應(yīng)用。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，另外的治療劑選自包括激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子(包括但不限于粒細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte Colony Stimulating Factor，G-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)、血小板生成素(thrombopoietin，TPO)、干細(xì)胞因子(stem cell fator,SCF)、白介素(interleukin、IL)、甲狀旁腺素(parathyroid hormone，PTH)等)；非細(xì)胞因子藥物，包括但不限于5-雄烯二醇(5-Androstenediol，5ADE)、褪黑素(Melatonin)、染料木素(Genistein)、化合物CBLB502等；輻射防護(hù)劑(Radioprotector)，包括但不限于阿米福汀(Amifostine)；以及抗氧化劑，包括但不限于維生素E(Vitamin E)等。

在第三個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種預(yù)防或治療受試者中電離輻射導(dǎo)致的造血系統(tǒng)損傷的方法，所述方法包括向所述受試者施用預(yù)防或治療有效量的本發(fā)明的膜微粒，優(yōu)選經(jīng)PEG處理的膜微粒。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述造血系統(tǒng)損傷包括但不限于骨髓造血干細(xì)胞(HSC)耗竭；外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板和/或血紅蛋白水平低下；以及造血組織(例如肝臟、脾臟等)損傷等。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述受試者為人。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，采用治療或預(yù)防有效量的膜微粒，例如但不限于，對(duì)于人而言，約0.75-20mg/kg體重，或者對(duì)于小鼠而言，0.75ug～10ug/g體重。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述膜微粒與另外的治療劑聯(lián)合應(yīng)用。

在第四個(gè)方面，本發(fā)明涉及膜微粒，其用于預(yù)防或治療電離輻射導(dǎo)致的造血系統(tǒng)損傷。

在第五個(gè)方面，本發(fā)明涉及膜微粒在誘導(dǎo)造血細(xì)胞紅系分化中的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及膜微粒在誘導(dǎo)造血細(xì)胞紅系分化中的非治療用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及膜微粒在制備誘導(dǎo)造血細(xì)胞紅系分化的藥物中的用途。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，膜微粒是經(jīng)PEG處理的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，膜微粒是通過本發(fā)明的方法制備獲得的。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，膜微粒獲自造血細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，膜微粒獲自TF-1細(xì)胞。

附圖說明

圖1顯示電離輻射前后外周血白細(xì)胞(WBC)水平(N＝9，*p＜0.05)。

圖2顯示電離輻射前后外周血血小板(PLT)水平(N＝9，*p＜0.05)。

圖3顯示電離輻射前后外周血紅細(xì)胞(RBC)水平(N＝9)。

圖4顯示電離輻射前后外周血血紅蛋白(HGB)水平(N＝9)。

圖5顯示過表達(dá)miR-486膜微粒處理TF-1后miR-486的表達(dá)。

圖6顯示過表達(dá)miR-486膜微粒處理TF-1后的紅系分化能力。

具體實(shí)施方式

在本文中，除非另有說明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。

在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種制備膜微粒的方法，所述方法包括用聚乙二醇即PEG處理細(xì)胞培養(yǎng)物的上清。

本發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在提取膜微粒的過程中，采用PEG處理細(xì)胞培養(yǎng)物上清可簡(jiǎn)化膜微粒的制備工藝，從而無(wú)需精密昂貴的儀器設(shè)備例如超速離心機(jī)、高效液相色譜儀等?？捎糜诒景l(fā)明的PEG可以是分子量范圍為2000-8000的PEG。優(yōu)選地，PEG選自由下列組成的組：PEG8000、PEG7000、PEG6000、PEG5000、PEG4000、PEG3000和PEG2000。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以以2：1至6:1的PEG/血清(v/v)加入PEG。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，PEG/血清體積比為約6:1、約5:1、約4:1、約3:1或約2:1。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括以下步驟：a)收集細(xì)胞培養(yǎng)物上清；b)將所述培養(yǎng)物上清離心；c)收集并用聚乙二醇即PEG處理步驟b)中經(jīng)離心的上清；d)離心步驟c)所獲得的上清，并棄去經(jīng)離心的上清，保留沉淀；和e)用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸沉淀，獲得膜微粒。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞或成纖維細(xì)胞或造血細(xì)胞。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟a)之前進(jìn)一步包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以釋放膜微粒的步驟。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)步驟包括在低氧低營(yíng)養(yǎng)條件下培養(yǎng)細(xì)胞例如所述間充質(zhì)干細(xì)胞或成纖維細(xì)胞或造血細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易選擇可用于誘導(dǎo)細(xì)胞例如間充質(zhì)干細(xì)胞或成纖維細(xì)胞或造血細(xì)胞凋亡的條件。例如，誘導(dǎo)步驟包括在細(xì)胞培養(yǎng)至約80％融合時(shí)，改變培養(yǎng)條件為無(wú)血清、低氧(94％N₂、5％CO₂和1％O₂)培養(yǎng)72h。

取決于細(xì)胞類型和上清液體積，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇合適的離心速度。例如，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟b)和d)中各自獨(dú)立地采用轉(zhuǎn)速小于或等于10,000rpm的低速離心機(jī)進(jìn)行離心。例如，步驟b)和d)中各自獨(dú)立地以2,000rpm至10,000rpm、2,500rpm至8,000rpm、2,600rpm至7,000rpm、2,700rpm至6,000rpm、2,800rpm至5,000rpm、2,900rpm至4,000rpm、或3,000rpm至3,500rpm的速度離心。

取決于細(xì)胞類型和上清液體積，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇合適的離心操作溫度和時(shí)間。例如，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟b)中在約4℃離心5-15分鐘，例如10分鐘。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟d)中在約4℃離心25-35分鐘，例如30分鐘。

可用于步驟c)的PEG可以是分子量范圍為2000-8000的PEG。優(yōu)選地，PEG選自由下列組成的組：PEG8000、PEG7000、PEG6000、PEG5000、PEG4000、PEG3000和PEG2000。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟c)中，以2：1至6:1的PEG/血清體積比加入PEG。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，PEG/血清體積比為6:1、5:1、4:1、3:1或2:1。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可用于本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞為臍帶、臍帶血、骨髓、胎盤組織、脂肪組織或牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞、或其組合。優(yōu)選地，所述細(xì)胞培養(yǎng)物為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可用于本發(fā)明的造血細(xì)胞為TF-1細(xì)胞、Mo7e細(xì)胞等。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟e)中無(wú)血清培養(yǎng)基可以為α-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基。

本發(fā)明的方法所獲得的膜微?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的方法進(jìn)行鑒定，例如電鏡觀察，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)、動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定等。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及膜微粒在制備用于預(yù)防或治療電離輻射導(dǎo)致的造血系統(tǒng)損傷的藥物中的用途。造血系統(tǒng)損傷包括但不限于骨髓造血干細(xì)胞(HSC)耗竭；外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板和/或血紅蛋白水平低下；以及造血組織(例如肝臟、脾臟等)損傷等。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可用于本發(fā)明的膜微?？梢允谦@自間充質(zhì)干細(xì)胞或成纖維細(xì)胞的膜微粒。優(yōu)選地，膜微?？色@自臍帶、臍帶血、骨髓、胎盤組織、脂肪組織或牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞。最優(yōu)選地，膜微粒獲自臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，膜微?？梢允墙?jīng)PEG處理的膜微粒?？捎糜诒景l(fā)明的PEG可以是分子量范圍為2000-8000的PEG。優(yōu)選地，PEG選自由下列組成的組：PEG8000、PEG7000、PEG6000、PEG5000、PEG4000、PEG3000和PEG2000。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以以2：1至6:1的PEG/血清(v/v)加入PEG。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，PEG/血清體積比為約6:1、約5:1、約4:1、約3:1或約2:1。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，膜微粒是通過本文所述的方法制備的。

本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)實(shí)際應(yīng)用的情況確定本發(fā)明的膜微粒的治療或預(yù)防有效量，例如根據(jù)膜微粒的來(lái)源、待治療對(duì)象的年齡、體重、和疾病嚴(yán)重程度等因素，這在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。例如但不限于，對(duì)于人而言，治療或預(yù)防有效量可以為約0.75-20mg/kg體重；對(duì)于小鼠而言，治療或預(yù)防有效量可以為0.75ug～10ug/g體重。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，膜微粒還可以與另外的治療劑聯(lián)合應(yīng)用。例如，另外的治療劑選自包括激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子(包括但不限于粒細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte Colony Stimulating Factor，G-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)、血小板生成素(thrombopoietin，TPO)、干細(xì)胞因子(stem cell fator,SCF)、白介素(interleukin、IL)、甲狀旁腺素(parathyroid hormone，PTH)等)；非細(xì)胞因子藥物，包括但不限于5-雄烯二醇(5-Androstenediol，5ADE)、褪黑素(Melatonin)、染料木素(Genistein)、化合物CBLB502等；輻射防護(hù)劑(Radioprotector)，包括但不限于阿米福汀(Amifostine)；以及抗氧化劑，包括但不限于維生素E(Vitamin E)等。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種預(yù)防或治療受試者例如人中電離輻射導(dǎo)致的造血系統(tǒng)損傷的方法，所述方法包括向所述受試者施用預(yù)防或治療有效量的本發(fā)明的膜微粒，優(yōu)選經(jīng)PEG處理的膜微粒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述造血系統(tǒng)損傷包括但不限于骨髓造血干細(xì)胞(HSC)耗竭；外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板和/或血紅蛋白水平低下；以及造血組織(例如肝臟、脾臟等)損傷等?？捎糜谠撝委熁蝾A(yù)防方法的膜微粒可以為上文描述的膜微粒。

本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)實(shí)際應(yīng)用的情況確定本發(fā)明的膜微粒的治療或預(yù)防有效量，例如根據(jù)膜微粒的來(lái)源、待治療對(duì)象的年齡、體重、和疾病嚴(yán)重程度等因素，這在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。例如但不限于，對(duì)于人而言，治療或預(yù)防有效量可以為約0.75-20mg/kg體重；對(duì)于小鼠而言，治療或預(yù)防有效量可以為0.75ug～10ug/g體重。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述膜微粒與可以與上文描述的另外的治療劑聯(lián)合應(yīng)用。

本發(fā)明的膜微?？梢酝ㄟ^任何合適的方式來(lái)施用。示例性的施用方式包括但不限于，靜脈內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，肺內(nèi)，囊內(nèi)，肌內(nèi)，氣管內(nèi)，皮下，眼內(nèi)，鞘內(nèi)，透皮或局部施用。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過靜脈注射來(lái)施用所述膜微粒。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述膜微粒被施用一次。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述膜微粒被施用多次。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述膜微粒以選自下述的頻率施用：每天三次，每天兩次，每天一次，每?jī)商煲淮?，?天一次，或每周一次。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及膜微粒，其用于預(yù)防或治療電離輻射導(dǎo)致的造血系統(tǒng)損傷。所述膜微?？梢允潜疚拿枋龅哪の⒘＃缃?jīng)PEG處理的膜微粒，或者通過本發(fā)明的制備方法獲得的膜微粒。

在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及膜微粒在誘導(dǎo)造血細(xì)胞紅系分化中的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及膜微粒在誘導(dǎo)造血細(xì)胞紅系分化中的非治療用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及膜微粒在制備誘導(dǎo)造血細(xì)胞紅系分化的藥物中的用途。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，膜微粒是經(jīng)PEG處理的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，膜微粒是通過本發(fā)明的方法制備獲得的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，膜微粒可獲自造血細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，膜微粒獲自TF-1細(xì)胞。

本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)實(shí)際應(yīng)用的情況確定本發(fā)明的膜微粒的促進(jìn)分化有效量，例如根據(jù)膜微粒的來(lái)源、待治療對(duì)象的年齡、體重、和疾病嚴(yán)重程度等因素，這在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。例如但不限于，對(duì)于人而言，促進(jìn)分化有效量可以為約0.75-20mg/kg體重；對(duì)于小鼠而言，促進(jìn)分化有效量可以為0.75ug～10ug/g體重。

近年來(lái)，miRNA已被證明通過調(diào)控重要造血相關(guān)基因的表達(dá)參與血細(xì)胞生成調(diào)控，是造血生成的重要調(diào)節(jié)因素之一。大量文獻(xiàn)顯示miRNA與造血細(xì)胞紅系分化相關(guān),包括早期紅系細(xì)胞的成熟和增殖，例如miR-15a、miR-16-1、miR-126、miR-144、miR-451以及miR-210[Bianchi N,Zuccato C,Gambari R,et al.Involvement of mi RNA in erythroid differentiation[J].Epigenomics,2012,4(1):51-65.]。miR-221和miR-222下調(diào)能夠促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞向紅系分化[Felli N,Fontana L,Pelosi E,et al.Micro RNAs 221and 222inhibit normal erythropoiesis and erythroleukemic cell growth via kit receptor down2modulation[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(50):18081218086.]。miRNA介導(dǎo)基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程，在調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的不同階段發(fā)揮作用。因此，不受限于理論，我們推測(cè)膜微粒可能通過miRNA調(diào)控紅系分化，參與了造血損傷的修復(fù)。

現(xiàn)參照下列意在舉例說明本發(fā)明(而非限定本發(fā)明)的實(shí)施例來(lái)描述本發(fā)明。

實(shí)施例

實(shí)施例中未指明其來(lái)源的試劑、試劑盒或儀器均為市場(chǎng)上商購(gòu)可得的常規(guī)產(chǎn)品。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，實(shí)施例以舉例方式描述本發(fā)明，且不意欲限制本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1：膜微粒的提取和鑒定

按照表1所描述的細(xì)胞、PEG和條件，采用下述方法提取膜微粒并進(jìn)行鑒定。收集臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或TF-1細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用低速離心機(jī)以3000rpm、4℃離心10分鐘，收集上清。按表1所示的比例分別加入PEG6000或PEG3000，混勻，4℃靜置12小時(shí)。然后，采用低速離心機(jī)以3000rpm、4℃離心30分鐘，棄上清。用適量α-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基重懸沉淀，檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，于-80℃保存。

表1

任選地，在細(xì)胞培養(yǎng)至約80％融合時(shí)，改變培養(yǎng)條件為無(wú)血清、低氧(94％N₂、5％CO₂和1％O₂)培養(yǎng)72h，以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，釋放膜微粒。

通過miRNA和蛋白質(zhì)定量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)通過本申請(qǐng)的方法獲得的膜微粒與現(xiàn)有膜微粒制備技術(shù)如超速離心技術(shù)(UC)、密度梯度離心技術(shù)(DGC)、高效液相色譜技術(shù)(HPLC)所獲得的膜微粒含量相當(dāng)，并且不需要精密昂貴的儀器設(shè)備，工藝步驟簡(jiǎn)單，有效處理體積極小，效率高。

實(shí)施例2：膜微粒治療輻射損傷c57BL小鼠

將36只8周齡、約20克的雌性c57BL小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(注射αMEM)、EGF組(注射10ug EGF/只小鼠)、低劑量膜微粒組(每只注射200μg實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)1獲得的通過PEG6000純化獲得的膜微粒，以下稱為200ug UCMSC MV組)、高劑量膜微粒組(每只注射400ug實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)1獲得的通過PEG6000純化獲得的膜微粒，以下稱為400ug UCMSC MV組)。每組9只，分別稱體重，眼眶采血并檢測(cè)外周血中白細(xì)胞(WBC)、血小板(PLT)、紅細(xì)胞(RBC)及血紅蛋白(HGB)的水平。表2為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及各組注射劑量。

表2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射劑量(/只，在200uLαMEM中)

48小時(shí)后(即D0)，采用7Gy、102.36cGy/分鐘輻射這四組小鼠6分鐘50秒。輻射完畢后1小時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行眼眶采血并檢測(cè)外周血中白細(xì)胞(WBC)、血小板(PLT)、紅細(xì)胞(RBC)及血紅蛋白(HGB)水平。

小鼠眼眶采血后對(duì)各組分別進(jìn)行腹腔注射200ug/只αMEM、10ug/只EGF、200ug/只UCMSC MV和400ug/只UCMSC MV。之后連續(xù)6天、即合計(jì)連續(xù)7天(D0～D6)每天按表2對(duì)各組分別進(jìn)行腹腔注射。

自輻射完畢開始，分別在第0天(D0)、第2天(D2)、第4天(D4)、第6天(D6)、第13天(D13)、第16天(D16)和第20天(D20)進(jìn)行眼眶采血并檢測(cè)外周血中白細(xì)胞(WBC)、血小板(PLT)、紅細(xì)胞(RBC)及血紅蛋白(HGB)水平。

血常規(guī)主要檢測(cè)指標(biāo)為外周血白細(xì)胞(WBC)、血小板(PLT)、紅細(xì)胞(RBC)及血紅蛋白(HGB)水平。檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組、EGF組、低劑量膜微粒組(200ug UCMSC MV組)相比，高劑量膜微粒組(400ug UCMSC MV組)可明顯治療或恢復(fù)小鼠造血功能。結(jié)果見圖1、2、3和4。

實(shí)施例3：過表達(dá)miR-486的膜微粒誘導(dǎo)TF-1細(xì)胞紅系分化

過表達(dá)miR-486的TF-1膜微粒及其對(duì)照病毒TF-1膜微粒的獲得

用5MOI過表達(dá)miR-486的慢病毒或者對(duì)照病毒感染TF-1細(xì)胞，48小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。通過實(shí)施例1的方法提取膜微粒。

采用常規(guī)方法提取所獲得的過表達(dá)miR-486的TF-1膜微粒的RNA，并檢測(cè)膜微粒中miR-486的表達(dá)。結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-486的TF-1膜微粒中miR-486表達(dá)明顯升高(圖5)。

TF-1細(xì)胞的處理

采用800ng的過表達(dá)miR-486的TF-1膜微粒及其對(duì)照病毒TF-1膜微粒處理TF-1細(xì)胞8天。

采用常規(guī)方法提取經(jīng)膜微粒處理的TF-1的RNA，并檢測(cè)其miR-486的表達(dá)。結(jié)果顯示用過表達(dá)miR-486的TF-1膜微粒處理TF-1細(xì)胞8天后可以顯著促進(jìn)TF-1細(xì)胞中miR-486的表達(dá)。

經(jīng)膜微粒處理的TF-1細(xì)胞的紅系分化

將上述經(jīng)膜微粒處理的TF-1細(xì)胞用PBS洗滌2遍后，與CD235a抗體避光溫育。然后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD235a的表達(dá)。結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-486的TF-1膜微粒處理TF-1細(xì)胞顯著促進(jìn)TF-1細(xì)胞CD235a的表達(dá)，從而證明了其具有促進(jìn)TF-1細(xì)胞紅系分化的能力(圖6)。

以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和修改，這些改進(jìn)和修改也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。