本發(fā)明涉及微流控芯片的
技術(shù)領(lǐng)域：
：，具體地說是一種用于細胞捕獲、熒光染色的微流控芯片。
背景技術(shù)：
：：微流控芯片技術(shù)是把生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)分析過程的樣本制備、反應(yīng)、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上，自動完成分析全過程；其是生命科學(xué)、化學(xué)科學(xué)與信息科學(xué)信號檢測和處理方法研究的重要技術(shù)平臺。近年來，微流控芯片憑借其通道尺寸(10～100um)與單個細胞直徑(10～20um)大小相近，便于對細胞進行操作，反應(yīng)更迅速高效；微流控芯片形成的相對封閉環(huán)境，更接近生理狀態(tài)下細胞的生存環(huán)境；微流控芯片與多個操作單元靈活組合，使得細胞進樣、培養(yǎng)、捕獲、裂解和分離檢測等過程集于一塊芯片即可完成，操作更加簡便且無需專業(yè)技術(shù)；芯片為平板式幾何構(gòu)型，更方便進行觀察等特性，使得微流控芯片在細胞生物學(xué)研究，如細胞捕獲、篩分、富集、計數(shù)、培養(yǎng)等方面的應(yīng)用越來越廣(姚琳,白亮,吳亮其,等.微流控芯片技術(shù)在細胞生物學(xué)研究中的應(yīng)用進展[J].中國細胞生物學(xué)學(xué)報,2011,33(11):1254-66.)。微流控芯片技術(shù)在細胞分離應(yīng)用越來越廣，基于不同細胞種群間固有特性見的差異，在微流控芯片中實現(xiàn)細胞的分離，諸如通過細胞的粒徑尺寸間的差異實現(xiàn)對細胞的篩選分離，通過細胞表面的特異性抗體來特異性結(jié)合磁珠實現(xiàn)對細胞的正向富集或負向篩選；且微流控芯片技術(shù)在細胞操作、分離富集應(yīng)用也展現(xiàn)出其獨特的優(yōu)勢：試劑樣本消耗少，反應(yīng)迅速高效、節(jié)省時間，靈敏度、分辨率高，功能集成性強可適用于多種檢測，可實現(xiàn)自動化操作避免人為操作間的差異性，相對封閉空間避免交叉性污染(BhagatAAS,BowH,HouHW,etal.Microfluidicsforcellseparation[J].Medical&biologicalengineering&computing,2010,48(10):999-1014.)。循環(huán)腫瘤細胞，(CirculatingTumorCell，簡稱CTC)，是指由原發(fā)腫瘤或繼發(fā)腫瘤自發(fā)進入或診斷操作帶入外周血的腫瘤細胞，具有高活力和轉(zhuǎn)移潛能的CTC可以在循環(huán)系統(tǒng)中存活，并在合適的環(huán)境中增殖，導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。CTC的活檢分析可用以早期診斷、風(fēng)險分級、療效評估和肺癌復(fù)發(fā)的早期檢查。但是外周血中的CTC含量極低，腫瘤轉(zhuǎn)移患者每毫升全血中僅有1～10個CTC，因此對CTC細胞進行準確的捕獲和計數(shù)具有重要的意義。近年來用于捕獲CTC的方法有：利用外力場如磁場、電場、流體場等，并且基于細胞間的物理特性差異如大小、密度等對血液樣本進行反向篩選，去除大部分的白細胞，保證7.5ml的血液樣本中含有<10,000個細胞。但是考慮到CTC種群的異質(zhì)性，且富集捕獲的血液樣本中依然含有不少的白細胞，因此會采用免疫熒光染色對CTC鑒定、確認(HongB,ZuY.Detectingcirculatingtumorcells:currentchallengesandnewtrends[J].Theranostics,2013,3(6):377-394)?；诿庖邿晒馊旧珜Ω患东@的血液樣本進行腫瘤細胞特異性蛋白熒光標記，已成為常用的CTC檢測手段(ZhengS,LinHK,LuB,etal.3Dmicrofilterdeviceforviablecirculatingtumorcell(CTC)enrichmentfromblood[J].Biomedicalmicrodevices,2011,13(1):203-213)。比如通過免疫熒光染色方法標記細胞角蛋白抗原(cytokeratin，CK)，來識別上皮循環(huán)腫瘤細胞，即CTC呈CK陽性、CD45陰性、DAPI陽性；而白細胞為CD45陽性、CK陰性、DAPI陽性(LinHK,ZhengS,WilliamsAJ,etal.Portablefilter-basedmicrodevicefordetectionandcharacterizationofcirculatingtumorcells[J].ClinicalCancerResearch,2010,16(20):5011-5018)。最后可直接進行熒光鏡檢掃描，對免疫熒光染色后的CTC進行分析和計數(shù)。其中，細胞免疫熒光技術(shù)是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)，其是基于抗原抗體反應(yīng)的原理，將已知的抗原或抗體標記上熒光基團，再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢查細胞膜或胞內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)，利用熒光顯微鏡鏡檢觀察熒光所在的細胞，從而對細胞進行定性或定量測定。按照樣本特性，可分為兩類：(1)用于熒光標記固定在玻片上的細胞，如細胞爬片或直接涂片，(2)細胞懸液免疫熒光分析，通過流式細胞儀進行檢測分析。對富集捕獲后的含有CTC的血液樣本進行免疫熒光染色處理，根據(jù)細胞物理狀態(tài)可分為：細胞固定在玻片后進行熒光染色即固定染色，和直接在細胞懸液中進行熒光染色即液體染色。無論是那種染色方法，細胞熒光染色一般包括如下步驟：PFA或乙醇固定、細胞透膜、細胞封閉、一抗孵育、避光環(huán)境下二抗孵育、染核及每步操作之間的PBS反復(fù)清洗等(WellerP,NelI,HassenkampP,etal.Detectionofcirculatingtumorcellsubpopulationsinpatientswithheadandnecksquamouscellcarcinoma(HNSCC)[J].PloSone,2014,9(12):e113706)。然而，在玻片上進行固體染色一般需要在多聚賴氨酸包被的載體表面進行操作，對操作人員的實驗技能有一定的要求。并且由于以上每步操作之間都需要對玻片進行反復(fù)的清洗處理，容易造成玻片上細胞的丟失，另外處理過程中玻片上的細胞暴露于空氣中，也容易造成污染。而液體染色需要通過流式細胞儀進行檢測，成本較高，而且至少需要10次以上的離心操作，不僅耗費了較長的時間和人力，并且在棄去上清的過程中也容易造成細胞的損失。綜上所述，現(xiàn)有的細胞捕獲、染色方法存在以下問題：樣本經(jīng)過細胞捕獲后，需要人工操作進行細胞染色，不僅操作步驟繁瑣，而且需要操作人員具有較強的實驗技能，人工操作帶來的誤差較大，影響測定結(jié)果的準確性。并且對于微流控芯片捕獲目標細胞來說，由于捕獲目標細胞較大，流道容易堵塞造成目標細胞破裂，或者細胞逃逸，造成捕獲效率低。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的主要目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足提供一種用于細胞捕獲、熒光染色的微流控芯片，以實現(xiàn)目標細胞的富集、捕獲和染色一體化、自動化，減小人為干擾，并且捕獲效率高。本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：一種用于細胞捕獲、熒光染色的微流控芯片，所述微流控芯片包括基底和設(shè)于基底上的細胞流道，所述基底上設(shè)有樣本進口和廢液出口，所述細胞流道的一端為細胞入口，細胞流道的另一端為細胞出口，所述細胞入口與樣本進口相連，所述細胞出口與廢液出口相連；所述細胞入口處還連接有染色液通道，所述染色液通道的另一端設(shè)有染色液入口；所述細胞流道由若干并排布置的微通道依次首尾相連而成；所述微通道內(nèi)設(shè)有細胞捕獲裝置。優(yōu)選的，所述細胞捕獲裝置為沿微通道頭部至尾部方向設(shè)置的微柱排，所述微柱排由若干呈線型分布的微柱組成，相鄰的微柱間留有狹縫，每個微柱的靠近細胞入口一側(cè)端面的直徑不大于靠近細胞出口一側(cè)端面的直徑。所述細胞捕獲裝置也可以為陣列微柱或者梯形微柱等其他微流控芯片中用于捕獲細胞的裝置。更進一步的，也可以在微柱表面包被抗體，從而增大捕獲效率。優(yōu)選的，所述微柱的截面為凸字形。優(yōu)選的，所述微柱排沿微通道的頭部至尾部方向，一端與微通道頭部相接，另一端與微通道尾部之間留有開口。優(yōu)選的，所述微柱排沿微通道的頭部至尾部方向，與細胞入口一側(cè)的側(cè)壁距離逐漸減小。在樣本細胞的流經(jīng)方向逐漸增大壓力，可以迫使細胞通過細胞捕獲裝置的微柱，增加捕獲效率。優(yōu)選的，所述微流控芯片還包括設(shè)于基底上的加強捕獲流道，所述加強捕獲流道的兩端分別設(shè)有加強捕獲入口和加強捕獲出口，所述加強捕獲入口與所述細胞出口相連，所述加強捕獲出口與廢液出口相連；所述加強捕獲流道內(nèi)設(shè)有若干與細胞流道內(nèi)微柱排同向的微柱排，所述微柱排一端與加強捕獲流道相接，另一端與加強捕獲流道相對一側(cè)留有開口。所述加強捕獲流道可以進一步的捕獲樣本內(nèi)的目標細胞。優(yōu)選的，所述微流控芯片還包括設(shè)于基底上的預(yù)篩選流道，所述預(yù)篩選流道的兩端分別設(shè)有預(yù)篩選入口和預(yù)篩選出口，所述預(yù)篩選入口與樣本進口相連，所述預(yù)篩選出口與細胞入口相連，所述預(yù)篩選流道內(nèi)設(shè)有豎直于基底外的圓形或方形的預(yù)篩選微柱，所述預(yù)篩選微柱呈陣列分布。更優(yōu)選的，相鄰預(yù)篩選微柱的間距稍大于循環(huán)腫瘤細胞的粒徑，從而可以使樣本在經(jīng)過預(yù)篩選流道后盡可能呈單細胞狀態(tài)，過濾掉聚集成團的碎屑雜質(zhì)或成團的細胞簇，避免造成后續(xù)流道的堵塞。優(yōu)選的，所述微流控芯片還包括設(shè)于基底上的線型排布流道，所述線型排布流道的兩端分別設(shè)有排布入口和排布出口，所述排布入口與樣本進口相連，所述排布出口與細胞入口相連，所述線型排布流道為非對稱型蛇形流道。所述細胞流經(jīng)線型排布流道時，由于慣性的作用，細胞逐漸向流道的中部移動，從而保持在排布出口處的細胞在流道的中部呈線型分布。進一步的，所述基底為PDMS材料，所述細胞流道、預(yù)篩選流道、線型排布流道和加強捕獲流道通過刻蝕于基底上。所述PDMS材料是指聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)。進一步的，所述微流控芯片還包括與基底相接的上蓋，所述上蓋在染色液入口、樣本進口和廢液出口處設(shè)有通孔。最優(yōu)選的，本發(fā)明的微流控芯片依次包括預(yù)篩選流道、線型排布流道、細胞流道和加強捕獲流道，所述樣本進口與預(yù)篩選入口相連，預(yù)篩選出口與排布入口相連，排布出口與細胞入口相連，細胞出口與加強捕獲入口相連，加強捕獲出口與廢液出口相連。該微流控芯片通過預(yù)篩選流道過濾掉碎屑和細胞團，通過線型排布流道使細胞為線型，然后通過細胞流道將細胞粒徑較大的目標細胞捕獲到相鄰微柱間隔的狹縫中。進一步的，在同一微流控芯片中，可并行設(shè)置1、2或4個等獨立的細胞流道，對不同的樣本進行并行處理，增加工作效率。還可以通過搭建自動微流工作站，包括試劑倉、自動機械臂、多位切換閥、控制器等，通過預(yù)編程序?qū)崿F(xiàn)自動化控制過程。本發(fā)明的有益效果為：(1)本發(fā)明提供了一種用于細胞捕獲、熒光染色的微流控芯片，通過并排布置的微通道以及設(shè)置在微通道內(nèi)的微柱排加長捕獲距離，提高捕獲效率。并且通過改變微柱排的傾斜方向，在樣本細胞的流經(jīng)方向逐漸增大壓力，可以迫使細胞通過細胞捕獲裝置的微柱，進一步增加捕獲效率。(2)本發(fā)明在目標細胞的捕獲富集完成后，可以通過染色液入口輸入染色液、緩沖液等對目標細胞進行熒光染色、細胞清洗、抗體孵育等操作，這些操作都在芯片內(nèi)完成，避免了外界環(huán)境對細胞的污染，以及避免了在染色、清洗過程細胞的損失，尤其對于極其稀少的循環(huán)腫瘤細胞。(3)基于本發(fā)明微流控芯片的免疫熒光染色，由于細胞在染色過程中始終保持在溶液中，并且細胞流道可以達到微米級，因此可以大大增強細胞的染色效率，縮短反應(yīng)時間。并且無需進行固體染色的清洗操作，液體染色的離心操作，降低細胞在操作過程中損傷的可能性，保護細胞的完整性。同時，染色過程僅需通過注射器或微量注射針或者微流注射泵完成染色液進樣，可以降低昂貴試劑的使用量，節(jié)省成本。本發(fā)明的微流控芯片的捕獲效率高，對細胞損傷小，并且可以實現(xiàn)目標細胞的富集、捕獲和染色一體化，同時與微流注射泵等結(jié)合實現(xiàn)自動化，減小人為干擾，增加檢測結(jié)果的靈敏性和可靠性，不僅可以用于含量稀少的循環(huán)腫瘤細胞的捕獲和染色，也同樣可以用于其他細胞的捕獲和染色，例如白細胞等。本發(fā)明的微流控芯片無需復(fù)雜工藝，通過常規(guī)方法即可制備得到，成本低，具有很強的實用性。附圖說明圖1為本發(fā)明的整體結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明的預(yù)篩選流道結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為本發(fā)明的線型排布流道部分結(jié)構(gòu)示意圖；圖4為本發(fā)明的細胞流道和加強捕獲流道結(jié)構(gòu)示意圖；圖5為本發(fā)明的微通道結(jié)構(gòu)示意圖。1-基底、2-樣本進口、3-廢液出口、4-預(yù)篩選流道、5-預(yù)篩選入口、6-預(yù)篩選出口、7-預(yù)篩選微柱、8-線型排布流道、9-排布入口、10-排布出口、11-細胞流道、12-細胞入口、13-細胞出口、14-微通道、15-微柱排、16-染色液通道、17-染色液入口、18-加強捕獲流道、19-加強捕獲入口、20-加強捕獲出口、21-微柱、22-白細胞、23-循環(huán)腫瘤細胞(CTC)。具體實施方式以下結(jié)合附圖以CTC的捕獲和熒光染色為例，通過具體實施例來進一步說明本發(fā)明：下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。如圖1所示，本發(fā)明的微流控芯片包括基底1和上蓋(圖中未畫出)。基底1上依次包括預(yù)篩選流道4、線型排布流道8、細胞流道11和加強捕獲流道18?；?的一端設(shè)有樣本進口2，另一端設(shè)有廢液出口3。所述預(yù)篩選流道4的兩端分別設(shè)有預(yù)篩選入口5和預(yù)篩選出口6，所述線型排布流道8的兩端分別設(shè)有排布入口9和排布出口10，所述細胞流道11的兩端分別設(shè)有細胞入口12和細胞出口13，所述加強捕獲流道18的兩端分別設(shè)有加強捕獲入口19和加強捕獲出口20。所述樣本進口2與預(yù)篩選入口5相連，預(yù)篩選出口6與排布入口9相連，排布出口10與細胞入口12相連，細胞出口13與加強捕獲入口19相連，加強捕獲出口20與廢液出口3相連。如圖2所示，所述預(yù)篩選入口5與樣本進口2相連，所述預(yù)篩選出口6通過線型排布流道8與細胞入口12相連。所述預(yù)篩選流道4內(nèi)設(shè)有豎直于基底1外的圓形或方形的預(yù)篩選微柱7，所述預(yù)篩選微柱7呈陣列分布。更優(yōu)選的，相鄰預(yù)篩選微柱7間的間距為30～60μm，陣列大小為(20～50)×(50～200)。根據(jù)流場運動，相鄰預(yù)篩選微柱7間距僅能通過1～3個細胞，細胞樣本溶液在通過預(yù)篩選流道4的時候，陣列預(yù)篩選微柱7可將粘附在一起的細胞盡量打散呈現(xiàn)單細胞狀，且過濾掉聚集成團的碎屑雜質(zhì)或成團的細胞簇，避免造成后續(xù)流道的堵塞。如圖3所示，所述排布入口9與預(yù)篩選出口6相連，所述排布出口10與細胞入口12相連，所述線型排布流道8為非對稱型蛇形流道。線型排布流道8的寬度優(yōu)選在50μm～200μm，可以使進口雜亂無章的細胞，在微流慣性力作用下，逐漸向線型排布流道8的中心區(qū)域移動，在排布出口10處樣本呈單細胞、線型分布在流道的中心區(qū)域。如圖4、5所示，所述細胞入口12與排布出口10相連，細胞出口13與加強捕獲入口19相連。所述細胞入口12處還連接有染色液通道16，所述染色液通道16的另一端設(shè)有染色液入口17。所述細胞流道11由若干并排布置的微通道14依次首尾相連而成。所述微通道14內(nèi)沿微通道14頭部至尾部方向設(shè)置的微柱排15，所述微柱排15由若干呈線型分布的微柱21組成，相鄰的微柱21間留有狹縫。每個微柱21靠近細胞入口12一側(cè)端面的直徑不大于靠近細胞出口13一側(cè)端面的直徑，例如為凸字形或梯形等，優(yōu)選為凸字形。狹縫呈U型，用于捕獲和固定目標細胞，狹縫的寬度可以根據(jù)需要捕獲的目標細胞直徑進行設(shè)置。所述微通道14的數(shù)量可以根據(jù)樣本中細胞的個數(shù)進行調(diào)整和確定，例如如果樣本中細胞較多，則可以較多的設(shè)置并排的微通道14，以及增加微柱排15中微柱21的數(shù)量等。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知曉的是，細胞的分離效率和微通道14及微柱21的數(shù)量在一定范圍內(nèi)呈正比關(guān)系，但微通道14及微柱21達到一定數(shù)量后，分離效率不再增加，反而會增大通道的流阻，對狹縫中的細胞造成損害。當(dāng)細胞樣本流經(jīng)細胞流道11時，微柱排15兩側(cè)的壓差會驅(qū)使細胞溶液由狹縫一側(cè)向另一側(cè)方向移動，粒徑較大的目標細胞例如CTC則被捕獲在狹縫處，而粒徑較小的白細胞則可由狹縫處通過，從而實現(xiàn)對目標細胞例如CTC的捕獲固定。更優(yōu)選的，微柱排15沿微通道14的頭部至尾部方向，一端與微通道14頭部相接，另一端與微通道14尾部之間留有開口。細胞樣本的溶液在微柱排15靠近細胞入口12一側(cè)方向的流道上壓力漸小，且壓力大于另一側(cè)的流道，即保證溶液在細胞流道11內(nèi)不會發(fā)生液體回流。而且通過布置若干并排的微通道14保證相鄰微通道14捕獲的獨立性，以及樣本流向的規(guī)律性和可控性，防止細胞在細胞流道11內(nèi)聚集成團。對于每個微通道14而言，微柱排15靠近細胞出口13一側(cè)側(cè)壁的距離優(yōu)選為靠近細胞入口一側(cè)側(cè)壁距離的2～3倍，保證狹縫流過的溶液流量。更進一步優(yōu)選的，微柱排15沿微通道14的頭部至尾部方向，與細胞入口12一側(cè)的側(cè)壁距離逐漸減小。例如，微柱排15與細胞入口12一側(cè)的側(cè)壁距離由80μm漸窄至60μm、與細胞出口13一側(cè)的側(cè)壁距離由180μm漸寬至60μm，從而保證由樣本溶液從微柱排15一側(cè)流過與從微柱21之間流過的比例，進一步保證目標細胞捕獲的連續(xù)性。如圖4所示，所述細胞出口13與加強捕獲入口19相連，加強捕獲出口20與廢液出口3相連，所述加強捕獲流道18內(nèi)設(shè)有若干與細胞流道11內(nèi)微柱排同向的微柱排15，所述微柱排15一端與加強捕獲流道相接，另一端與加強捕獲流道15相對一側(cè)留有開口。樣本溶液在經(jīng)過細胞流道11后，大部分的目標細胞如CTC被捕獲固定，但也有可能存在小部分的目標細胞如CTC未從微柱21之間的狹縫通過，因此未被捕獲固定，進入加強捕獲流道18。由于加強捕獲流道為設(shè)有微柱排15的整體腔體，減小了流動阻力，因此樣本溶液在從加強捕獲出口20流出前都需要穿過加強捕獲流道內(nèi)捕獲狹縫，進一步提高了捕獲效率。所述基底1可以為PDMS材料等微流控芯片常用材料制得，所述細胞流道11、預(yù)篩選流道4、線型排布流道8和加強捕獲流道18及微柱排14等均可以通過刻蝕于基底1上，所述各通道的深度優(yōu)選為30μm～100μm。基底1上方還設(shè)有與基底1相接的上蓋，以保證整個芯片的密封性，上蓋僅在染色液入口17、樣本進口2和廢液出口3處設(shè)有通孔，用于樣本溶液、染色液等的流進和流出。在本發(fā)明的實施案例中，樣本為經(jīng)過裂解紅細胞處理后或富集分離后的腫瘤患者細胞樣本。一般而言，常規(guī)CTCs檢測血量為7.5mL，1mL的血樣中的CTCs含量大約在1～10個。在經(jīng)過CD45磁珠負向篩選去除白細胞后，細胞樣本體積約為100μL，細胞個數(shù)小于10000個。對大多上皮癌種來講，通常情況下CTCs的粒徑(12～25μm，平均直徑為15μm)大于白細胞的粒徑(8～9μm)。通過微流注射泵，將細胞樣本以5～40μL/min的流速由樣本進口2通入本發(fā)明的微流控芯片。細胞樣本依次流經(jīng)預(yù)篩選流道4、線型排布流道8、細胞流道11和加強捕獲流道18后，從廢液出口3流出。然后以40～200μL/min的流速通入300μL～1mL的PBS緩沖溶液進行清洗后，CTCs捕獲固定在微流控芯片細胞流道11中微柱排15的狹縫中，而白細胞則由廢液出口3流出，實現(xiàn)對CTCs的富集與捕獲固定。然后通過染色液入口17向染色液通道16中以10～50ul/s通入細胞固定液、透膜液、封閉液、一抗工作液、二抗工作液以及染色液等染色工作液并進行5～20min的避光孵育，并交替由樣本進口2通入PBS緩沖液對所有流道進行清洗處理。實現(xiàn)對固定在狹縫中的CTCs的免疫熒光染色。最后將微流控芯片轉(zhuǎn)至熒光顯微鏡進行熒光掃描鏡檢即可。也可以收集染色后的細胞，再進行單細胞分析等檢測。本發(fā)明的微流控芯片的捕獲效率高，對細胞損傷小，并且可以實現(xiàn)目標細胞的富集、捕獲固定和染色一體化，同時與微流注射泵等結(jié)合實現(xiàn)自動化，減小人為干擾，增加檢測結(jié)果的靈敏性和可靠性；且可通過對微柱間距及數(shù)量，可對含量較少的細胞樣本，不限于CTC，還包括白細胞等，對細胞進行富集捕獲。本發(fā)明的微流控芯片無需復(fù)雜工藝，通過常規(guī)方法即可制備得到，成本低，具有很強的實用性。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員知悉，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對這些特征和實施例進行各種改變或等同替換。另外，在發(fā)明的教導(dǎo)下，可以對這些特征和實施例進行修改以適應(yīng)具體的情況及材料而不會脫離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明不受此處所公開的具體實施例的限制，所有落入本申請的權(quán)利要求范圍內(nèi)的實施例都屬于本發(fā)明的保護范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3 當(dāng)前第1頁1 2 3