本發(fā)明涉及基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體的說是涉及一種重組質(zhì)粒和重組工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：微生物轉(zhuǎn)化法是利用微生物細(xì)胞產(chǎn)生的一種或者多種酶把一種化合物變成結(jié)構(gòu)相關(guān)的更有經(jīng)濟價值的產(chǎn)物，其本質(zhì)是利用微生物本身所產(chǎn)生的酶對外源底物進(jìn)行的催化反應(yīng)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前最常用的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，大腸桿菌由于遺傳背景簡單，容易培養(yǎng)，以及由大量可供選擇的克隆載體與表達(dá)載體，使之成為人們克隆表達(dá)外源基因的主要菌株。甾體激素(steroidhormone)，包括腎上腺皮質(zhì)激素和性激素，它是一類維持生命、保持正常生活、促進(jìn)性器官發(fā)育、維持生育的重要生物活性物質(zhì)。甾體激素藥物是指分子結(jié)構(gòu)中含有甾體結(jié)構(gòu)的激素類藥物，是臨床上一類重要的藥物，主要包括腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticohormones)和性激素(sexhormone)兩大類。皮質(zhì)激素類藥物用于臨床的有醋酸可的松(cortisoneacetate)、氫化可的松(hydrocortisone)等。21-脫氧皮質(zhì)醇(21-Deoxycortisol，4-Pregnene-11beta,17alpha-diol-3,20-dione，C21H30O4，分子量346.4605)是一種重要的甾體激素，同時也是一種重要的甾體激素合成的中間體，它是由17α-羥孕酮(17α-Hydroxyprogesterone，17alpha-Hydroxy-4-pregnene-3,20-dione，C21H30O3，分子量330.4611)11位被氧化成β構(gòu)型的羥基而得到。目前還未有生物全合成或者生物轉(zhuǎn)化生成21-脫氧皮質(zhì)醇的文獻(xiàn)及專利發(fā)表。因此，在大腸桿菌中將17α-羥孕酮生物轉(zhuǎn)化為21-脫氧皮質(zhì)醇是一個非常具有前景的能夠運用于工業(yè)上的技術(shù)。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種重組質(zhì)粒，使得所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中能夠?qū)?7α-羥孕酮生物轉(zhuǎn)化為21-脫氧皮質(zhì)醇并具有較高產(chǎn)量，可應(yīng)用于轉(zhuǎn)化生成21-脫氧皮質(zhì)醇的重組工程菌的構(gòu)建中。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種重組工程菌，使得所述重組工程菌能夠?qū)?7α-羥孕酮生物轉(zhuǎn)化為21-脫氧皮質(zhì)醇并具有較高產(chǎn)量，可應(yīng)用于21-脫氧皮質(zhì)醇的微生物轉(zhuǎn)化中。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種重組質(zhì)粒，在基礎(chǔ)質(zhì)粒上包括T7啟動子、T7終止子、11位β羥化酶基因CYP11B1、電子傳遞體基因Adx、電子傳遞體基因AdR，所述11位β羥化酶能基因CYP11B1、電子傳遞體基因Adx、電子傳遞體基因AdR位于T7啟動子和T7終止子之間。本發(fā)明將11位β羥化酶基因CYP11B1、電子傳遞體基因Adx、電子傳遞體基因AdR通過T7啟動子和終止子開啟表達(dá)，由此構(gòu)建出重組質(zhì)粒，利用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到工程菌中可實現(xiàn)將17α-羥孕酮生物轉(zhuǎn)化為21-脫氧皮質(zhì)醇并具有較高產(chǎn)量。其中，作為優(yōu)選，所述基礎(chǔ)質(zhì)粒為pET21a質(zhì)粒，其上包含T7啟動子和T7終止子，是一種商品化質(zhì)粒，在構(gòu)建時較為方便，本發(fā)明同時也可使用額外添加T7啟動子和T7終止子的其他適合質(zhì)粒。在本發(fā)明的具體實施方式中，所述11位β羥化酶基因CYP11B1為人源(Homosapiens)、牛源(BosTaurus)、褐家鼠來源(Rattusnorvegicus)，羊源(Ovisaries)、袋獾來源(Sarcophilusharrisii)、狐蝠源(PteropusAlecto)或日本鬼傘科蘑菇來源(Coprinopsiscinereaokayama7#130)的野生型CYP11B1或突變型CYP11B1；為了方便表述，在本發(fā)明中可簡寫為Hs野生型或突變型CYP11B1、Rn野生型或突變型CYP11B1、Bt野生型或突變型CYP11B1、Oa野生型或突變型CYP11B1、Sh野生型或突變型CYP11B1、Pa野生型或突變型CYP11B1、Cc野生型或突變型CYP11B1。在本發(fā)明的具體實施方式中，所述電子傳遞體基因Adx、電子傳遞體基因AdR均為牛源(BosTaurus)基因。作為優(yōu)選，上述突變型的各來源CYP11B1都將疏水端N端編碼23位的氨基酸突變成為了編碼親水性精氨酸的核苷酸序列，具體所述人源、牛源、褐家鼠來源，羊源、袋獾來源、狐蝠源以及日本鬼傘科蘑菇來源的突變型CYP11B1核苷酸序列依次如SEQIDNO:1-7所示；所述牛源Adx是編碼4到108位氨基酸的核苷酸序列，具體所述電子傳遞體基因Adx、電子傳遞體基因AdR核苷酸序列依次如SEQIDNO:8-9所示；上述各基因均適當(dāng)規(guī)避常用限制性酶切位點后通過人工合成得到，在本發(fā)明具體實施方式中，為了改善轉(zhuǎn)入的大腸桿菌工程菌高效生物轉(zhuǎn)化效率，SEQIDNO:1-9所示核苷酸序列還經(jīng)過大腸桿菌密碼子優(yōu)化。同時，本發(fā)明根據(jù)所述重組質(zhì)粒所能實現(xiàn)的技術(shù)效果提出了其在將17α-羥孕酮生物轉(zhuǎn)化為21-脫氧皮質(zhì)醇中的應(yīng)用和/或在制備將17α-羥孕酮生物轉(zhuǎn)化為21-脫氧皮質(zhì)醇的工程菌中的應(yīng)用；作為優(yōu)選，所述工程菌為大腸桿菌，更優(yōu)選地為MG1655(DE3)菌株，該菌株是MassachusettsInstituteofTechnology的KristalaL.J.Prather教授文章中發(fā)布的菌株(TsengHC,HarwellCL,MartinCH,etal.Biosynthesisofchiral3-hydroxyvaleratefromsinglepropionate-unrelatedcarbonsourcesinmetabolicallyengineeredE.coli[J].Microbialcellfactories,2010,9(1):1)，文中詳細(xì)記載了將市售MG1655大腸桿菌通過基因工程技術(shù)改造為一類能夠有效表達(dá)異源蛋白的菌株，統(tǒng)一命名為MG1655(DE3)。本發(fā)明還對應(yīng)提供了所述重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括：將11位β羥化酶基因CYP11B1、電子傳遞體基因Adx、電子傳遞體基因AdR通過酶切方式連接到包含T7啟動子和T7終止子的基礎(chǔ)質(zhì)粒上，所述11位β羥化酶能基因CYP11B1、電子傳遞體基因Adx、電子傳遞體基因AdR位于T7啟動子和T7終止子之間，獲得重組質(zhì)粒。作為優(yōu)選，所述構(gòu)建方法包括：分別在11位β羥化酶基因CYP11B1、電子傳遞體基因Adx和電子傳遞體基因AdR5’端添加NdeI酶切位點、3’端添加SpeI酶切位點，然后分別將三個外源基因通過SpeI和NdeI酶切后，連入添加有SpeI酶切位點的pET21a質(zhì)粒中，得到pET21a-CYP11B1質(zhì)粒、pET21a-Adx質(zhì)粒和pET21a-AdR質(zhì)粒，所述SpeI酶切位點位于NdeI和BamHI酶切位點之間；將pET21a-CYP11B1質(zhì)粒、pET21a-Adx質(zhì)粒和pET21a-AdR質(zhì)粒中任意兩個質(zhì)粒分別進(jìn)行XbaI和BamHI酶切獲得兩個目的基因，將兩個目的基因逐個與進(jìn)行SpeI和BamHI酶切的剩余質(zhì)粒連接，獲得重組質(zhì)粒。在上述構(gòu)建方法中，本發(fā)明采用biobrick的構(gòu)建策略，利用SpeI與XbaI是同尾酶，經(jīng)過處理后會留下相同的粘性末端的特點，在T4連接酶的作用下將所需要的三個外源基因逐個連接到基礎(chǔ)質(zhì)粒上，并且保證已連接的外源基因不受后續(xù)酶切影響。更為優(yōu)選地，所述構(gòu)建方法包括：分別在11位β羥化酶基因CYP11B1、電子傳遞體基因Adx和電子傳遞體基因AdR5’端添加核苷酸序列CAT、3’端添加核苷酸序列CTAGT，然后分別將三個外源基因通過SpeI和NdeI酶切后，連入添加有SpeI酶切位點的pET21a質(zhì)粒中，得到pET21a-CYP11B1質(zhì)粒、pET21a-Adx質(zhì)粒和pET21a-AdR質(zhì)粒，所述SpeI酶切位點位于NdeI和BamHI酶切位點之間；將pET21a-CYP11B1質(zhì)粒和pET21a-AdR質(zhì)粒分別進(jìn)行XbaI和BamHI酶切獲得CYP11B1、AdR兩個目的基因，先將CYP11B1與進(jìn)行SpeI和BamHI酶切的pET21a-Adx質(zhì)粒連接，獲得pET21a-Adx-CYP11B1質(zhì)粒，然后再將AdR與進(jìn)行SpeI和BamHI酶切的pET21a-Adx-CYP11B1質(zhì)粒連接，獲得重組質(zhì)粒。根據(jù)所述重組質(zhì)粒在制備將17α-羥孕酮生物轉(zhuǎn)化為21-脫氧皮質(zhì)醇的工程菌中的應(yīng)用，本發(fā)明提供了一種重組工程菌，其轉(zhuǎn)化有本發(fā)明所述重組質(zhì)粒。作為優(yōu)選，所述工程菌為大腸桿菌，更優(yōu)選為MG1655(DE3)菌株。作為優(yōu)選，上述重組工程菌還轉(zhuǎn)化有包含幫助外源表達(dá)蛋白正確折疊的基因的質(zhì)粒；更優(yōu)選地，所述質(zhì)粒為包含分子伴侶基因grdES和分子伴侶基因grdEL的質(zhì)粒；在具體的實施方式中，該質(zhì)粒選擇為pGro7質(zhì)粒。將所述重組工程菌應(yīng)用到17α-羥孕酮生物轉(zhuǎn)化為21-脫氧皮質(zhì)醇中，其不但可以成功的生產(chǎn)出21-脫氧皮質(zhì)醇，并且具有較高的產(chǎn)量，其中以人源和牛源的CYP11B1產(chǎn)量最高，野生型可達(dá)到60mg/(L*d)以上，突變型可達(dá)到180mg/(L*d)以上。因此，本發(fā)明提出了所述重組工程菌在將17α-羥孕酮生物轉(zhuǎn)化為21-脫氧皮質(zhì)醇中的應(yīng)用。對應(yīng)的，所述重組工程菌的構(gòu)建方法為將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到工程菌中，轉(zhuǎn)化方法可采用本領(lǐng)域常規(guī)方法，例如電轉(zhuǎn)化法。此外，本發(fā)明還提供了一種將17α-羥孕酮生物轉(zhuǎn)化為21-脫氧皮質(zhì)醇的方法，將所述重組工程菌接種至種子培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，然后再轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，加入L-阿拉伯糖、IPTG、紅血素前體deta-氨基乙酰丙酸、氨芐青霉素誘導(dǎo)表達(dá)，然后收集細(xì)胞并清洗，將細(xì)胞重懸在包含17α-羥孕酮的磷酸緩沖液中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化10-24h，從發(fā)酵液中分離提取21-脫氧皮質(zhì)醇。更為具體地，將所述重組工程菌接種至種子培養(yǎng)基中在37℃、250rpm下活化培養(yǎng)14-16h，然后以初始菌體濃度OD600＝0.05轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中在37℃、250rpm下發(fā)酵培養(yǎng)至OD600＝0.6-0.8，加入4mg/mL的L-阿拉伯糖、1mM的IPTG、1mM紅血素前體deta-氨基乙酰丙酸，50μg/mL氨芐青霉素在27.5℃，200rpm下誘導(dǎo)表達(dá)21h，然后收集細(xì)胞并清洗，將細(xì)胞重懸在包含17α-羥孕酮的磷酸緩沖液中在27.5℃、170rpm下進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化10-24h，轉(zhuǎn)化完成后從發(fā)酵液中分離提取21-脫氧皮質(zhì)醇。其中，所述種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均優(yōu)選為每升蒸餾水中包含12g蛋白胨、24g酵母提取物、4mL甘油、4.62gKH2PO4、25gK2HPO4、50mg氨芐青霉素、50mg氯霉素的培養(yǎng)基。所述包含17α-羥孕酮的磷酸緩沖液優(yōu)選為pH7.4，配制方法如下：6.98gK2HPO4，1.35gKH2PO4溶解于1L的蒸餾水中，加入40mL甘油、50μg/mL氨芐青霉素、50μg/mL氯霉素4mg/mL的L-阿拉伯糖、1mM的IPTG、1mM紅血素前體deta-氨基乙酰丙酸、0.72mg/mL的17α-羥孕酮。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明為17α-羥孕酮生物轉(zhuǎn)化為21-脫氧皮質(zhì)醇提供優(yōu)化的外源基因，選取多種來源的11位β羥化酶基因CYP11B1以及電子傳遞體基因Adx、電子傳遞體基因AdR，整合至T7啟動子和終止子基礎(chǔ)質(zhì)粒上，構(gòu)建出的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至工程菌中能夠?qū)崿F(xiàn)21-脫氧皮質(zhì)醇的高產(chǎn)。附圖說明圖1所示為商品化質(zhì)粒pGro7(A圖)和pET21a(B圖)圖譜；圖2所示為添加有SpeI酶切位點的pET21a質(zhì)粒圖譜；圖3所示為商品化質(zhì)粒pUC57圖譜；圖4-6所示為本發(fā)明所述重組質(zhì)粒構(gòu)建流程示意圖；圖7所示為各種來源的突變型CYP11B1重組大腸桿菌的搖瓶發(fā)酵試驗柱形圖；圖8所示為各種來源的野生型CYP11B1重組大腸桿菌的搖瓶發(fā)酵試驗柱形圖。具體實施方式本發(fā)明公開了一種重組質(zhì)粒和重組工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明所述產(chǎn)品、方法和應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。在本發(fā)明中所涉及的一些質(zhì)粒載體、菌株均可市售獲得，如pET21a質(zhì)?？少徸訲akara，質(zhì)粒圖譜見圖1，在其基礎(chǔ)上添加有SpeI酶切位點的pET21a質(zhì)粒圖譜見圖2；菌株MG1655可購自ATCC；質(zhì)粒pGro7可購自Takara，質(zhì)粒圖譜見圖1；在全合成本發(fā)明所需要的各外源基因過程中，需要將其連接到質(zhì)粒載體上保存，在本發(fā)明具體實施方式中采用pUC57質(zhì)粒，可購自Takara，質(zhì)粒圖譜見圖3。下面結(jié)合實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實施例1：重組質(zhì)粒的構(gòu)建全合成β羥化酶基因CYP11B1、電子傳遞體基因Adx和電子傳遞體基因AdR，同時分別在11位β羥化酶基因CYP11B1、電子傳遞體基因Adx和電子傳遞體基因AdR5’端添加核苷酸序列CAT、3’端添加核苷酸序列CTAGT連接到pUC57質(zhì)粒中保存，然后分別將三個外源基因通過SpeI和NdeI酶切后，連入添加有SpeI酶切位點的pET21a質(zhì)粒中，得到pET21a-CYP11B1質(zhì)粒、pET21a-Adx質(zhì)粒和pET21a-AdR質(zhì)粒，所述SpeI酶切位點位于NdeI和BamHI酶切位點之間；將pET21a-CYP11B1質(zhì)粒和pET21a-AdR質(zhì)粒分別進(jìn)行XbaI和BamHI酶切獲得CYP11B1、AdR兩個目的基因，先將CYP11B1與進(jìn)行SpeI和BamHI酶切的pET21a-Adx質(zhì)粒連接，獲得pET21a-Adx-CYP11B1質(zhì)粒，然后再將AdR與進(jìn)行SpeI和BamHI酶切的pET21a-Adx-CYP11B1質(zhì)粒連接，獲得重組質(zhì)粒(構(gòu)建流程圖見圖4-6)。上述構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)DH5α中，菌落PCR篩選，提質(zhì)粒進(jìn)行單、雙酶切驗證以及測序驗證，以確保目的片段連接正確且堿基序列未發(fā)生突變。實施例2：重組大腸桿菌的構(gòu)建將質(zhì)粒pGro7(含有分子伴侶基因grdES和grdEL，能夠幫助外源表達(dá)蛋白的正確折疊)通過電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到大腸桿菌MG1655(DE3)中，轉(zhuǎn)化后采用LB+Cmr平板(瓊脂粉15g/L，NaCl10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，氯霉素38μg/L)進(jìn)行篩選。在平板上挑出單菌落后，接種到LB+Cmr液體培養(yǎng)基(NaCl10g/L，Pepone10g/L，Yeastextract10g/L，氯霉素38μg/L)中進(jìn)行培養(yǎng)，并保存甘油菌，命名為MG1655(DE3)-pGro7。將MG1655(DE3)-pGro7菌株做成電轉(zhuǎn)感受態(tài)，將按照實施例1方法構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化后采用LB+Cmr+Ampr平板(瓊脂粉15g/L，NaCl10g/L，Pepone10g/L，Yeastextract10g/L，氯霉素38μg/L，氨芐青霉素100μg/L)進(jìn)行篩選。篩選平板上的單菌落，獲得重組大腸桿菌。實施例3：重組大腸桿菌的21-脫氧皮質(zhì)醇搖瓶發(fā)酵種子培養(yǎng)基：12g蛋白胨、24g酵母提取物、4mL甘油、4.62gKH2PO4、25gK2HPO4、50mg氨芐青霉素、50mg氯霉素溶解于1L的蒸餾水中；發(fā)酵培養(yǎng)基：12g蛋白胨、24g酵母提取物、4mL甘油、4.62gKH2PO4、25gK2HPO4、50mg氨芐青霉素、50mg氯霉素溶解于1L的蒸餾水中。將按照實施例2構(gòu)建的重組菌株接種于5mL種子培養(yǎng)基中，在37℃、250rpm培養(yǎng)14-16h，以初始菌體濃度OD600＝0.05分別接種于50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37℃、250rpm條件下培養(yǎng)至OD600＝0.6-0.8，加入4mg/mL的L-阿拉伯糖、1mM的IPTG、1mM紅血素前體deta-氨基乙酰丙酸，50μg/mL氨芐青霉素誘導(dǎo)分子伴侶蛋白和CYP11B1及其電子傳遞體蛋白表達(dá)。27.5℃，200rpm蛋白表達(dá)21h后，8000rpm，1min收集細(xì)胞，將細(xì)胞用4℃無菌PH＝7.4的磷酸緩沖液(6.98gK2HPO4，1.35gKH2PO4溶解于1L的蒸餾水中，121℃，20min滅菌)清洗2遍，將細(xì)菌重懸在50mL無菌PH＝7.4的磷酸緩沖液(6.98gK2HPO4，1.35gKH2PO4溶解于1L的蒸餾水中，加入40mL甘油、50μg/mL氨芐青霉素、50μg/mL氯霉素4mg/mL的L-阿拉伯糖、1mM的IPTG、1mM紅血素前體deta-氨基乙酰丙酸)中，27.5℃170rpm培養(yǎng)24h。底物的添加方法：將17α-羥孕酮溶解于50％β-環(huán)糊精(將500gβ環(huán)糊精溶解于1L蒸餾水)中，配成36mg/mL的母液，每50mL磷酸緩沖液中加入1mL底物母液。實施例4：人源突變型CYP11B1重組大腸桿菌的搖瓶發(fā)酵試驗外源基因：Hs突變型CYP11B1(SEQIDNO:1)、牛源Adx(SEQIDNO:8)、牛源AdR(SEQIDNO:9)；將上述外源基因按照實施例1-3的方法構(gòu)建獲得人源突變型CYP11B1重組大腸桿菌，命名為SyBE_Ec02040086，然后進(jìn)行搖瓶發(fā)酵24h，以MG1655(DE3)菌株和MG1655(DE3)-pGro7菌株作為對照。產(chǎn)物提取及檢測方法：取10mL發(fā)酵液，用等體積的二氯甲烷萃取兩次，12000rpm、4℃離心5min，取下部萃取液5mL用純凈的氮氣吹干，然后加入5mL二氯甲烷渦旋1min溶解，12000rpm、4℃離心5min，取上部無沉淀潔凈萃取液2mL用純凈的氮氣吹干。用1mL甲醇溶解白色的析出物，用2μm濾膜過濾后上紫外液相檢測，21-脫氧皮質(zhì)醇的檢測波長為450nm，結(jié)果見表1。表121-脫氧皮質(zhì)醇產(chǎn)量菌株21-脫氧皮質(zhì)醇產(chǎn)量SyBE_Ec02040086178.945mg/(L*d)MG1655(DE3)0MG1655(DE3)-pGro70由表1可以得知，轉(zhuǎn)化有本發(fā)明所述重組質(zhì)粒的大腸桿菌能夠利用底物17α-羥孕酮，并將其生物轉(zhuǎn)化為21-脫氧皮質(zhì)醇，且具有較高的產(chǎn)量，而未轉(zhuǎn)化質(zhì)粒以及僅轉(zhuǎn)化有pGro7的菌株產(chǎn)量均為0。實施例5：各種來源的突變型CYP11B1重組大腸桿菌的搖瓶發(fā)酵試驗外源基因：Hs突變型CYP11B1、Bt突變型CYP11B1、Rn突變型CYP11B1、Oa突變型CYP11B1、Sh突變型CYP11B1、Pa突變型CYP11B1、Cc突變型CYP11B1(SEQIDNO:1-7)；牛源Adx(SEQIDNO:8)、牛源AdR(SEQIDNO:9)；另外，增加Sa突變型CYP11B1(鼩鼱來源，Sorexaraneus，SEQIDNO:10)、Mo野生型CYP11B1(稻瘟病菌來源，MagnaportheoryzaeP131，SEQIDNO:11)作為對照，其同樣在野生型基因序列基礎(chǔ)上將疏水端N端編碼23位的氨基酸突變成為了編碼親水性精氨酸的核苷酸序列，并經(jīng)過大腸桿菌密碼子優(yōu)化。將上述外源基因按照實施例1-2的方法構(gòu)建獲得各種來源的突變型CYP11B1重組大腸桿菌，重復(fù)構(gòu)建3次，每個來源的突變型CYP11B1重組大腸桿菌為3株，命名如下：MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-HsCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-BtCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-RnCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-OaCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-ShCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-SaCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-PaCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-CcCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-MoCYP11B1-Adx-AdR；然后按照實施例3的方法進(jìn)行搖瓶發(fā)酵(將各來源的3株重組菌株分別進(jìn)行，最后統(tǒng)計各來源重組菌株發(fā)酵結(jié)果的平均值)，結(jié)果見圖7。由圖7可知，各重組菌株中以人源突變型CYP11B1重組大腸桿菌以及牛源突變型CYP11B1重組大腸桿菌產(chǎn)量較高，而作為對照的Sa突變型CYP11B1重組大腸桿菌產(chǎn)量為0，Mo野生型CYP11B1重組大腸桿菌產(chǎn)量較低，表明并不是所有來源的CYP11B1經(jīng)過突變優(yōu)化均能夠?qū)崿F(xiàn)高產(chǎn)量轉(zhuǎn)化目的。實施例6：各種來源的野生型CYP11B1重組大腸桿菌的搖瓶發(fā)酵試驗外源基因：Hs野生型CYP11B1、Rn野生型CYP11B1、Bt野生型CYP11B1、Oa野生型CYP11B1、Sh野生型CYP11B1、Sa野生型CYP11B1、Pa野生型CYP11B1、Cc野生型CYP11B1、Mo野生型CYP11B1；牛源Adx(SEQIDNO:8)、牛源AdR(SEQIDNO:9)；其中，Sa野生型CYP11B1、Mo野生型CYP11B1作為對照，并且經(jīng)過大腸桿菌密碼子優(yōu)化。將上述外源基因按照實施例1-2的方法構(gòu)建獲得各種來源的野生型CYP11B1重組大腸桿菌，重復(fù)構(gòu)建3次，每個來源的野生型CYP11B1重組大腸桿菌為3株，命名如下：MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-HswtCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-BtwtCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-RnwtCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-OawtCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-ShwtCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-SawtCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-PawtCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-CcwtCYP11B1-Adx-AdR；MG1655(DE3)-pGro7-pET21a-MowtCYP11B1-Adx-AdR；然后按照實施例3的方法進(jìn)行搖瓶發(fā)酵(將各來源的3株重組菌株分別進(jìn)行，最后統(tǒng)計各來源重組菌株發(fā)酵結(jié)果的平均值)，結(jié)果見圖8。由圖8可知，各重組菌株中以人源野生型CYP11B1重組大腸桿菌以及牛源突變型CYP11B1重組大腸桿菌產(chǎn)量較高，而作為對照的Sa野生型CYP11B1以及Mo野生型CYP11B1重組大腸桿菌產(chǎn)量均為0，表明并不是所有來源的CYP11B1均能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)化目的。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。SEQUENCELISTING<110>天津大學(xué)<120>一種重組質(zhì)粒和重組工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用<130>MP1616356<160>11<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1512<212>DNA<213>人工序列<400>1atggcgctgcgtgcgaaagcggaagtgtgcatggcggttccgtggctgagcctgcaacgt60gcgcaagcgctgcgtacccgtgcggcgcgtgtgccgcgtaccgttctgccgtttgaagcg120atgccgcgtcgtccgggtaaccgttggctgcgtctgctgcaaatctggcgtgagcaaggc180tacgaagacctgcacctggaagtgcaccagaccttccaagaactgggtccgatttttcgt240tatgatctgggtggcgcgggcatggtgtgcgttatgctgccggaggacgtggaaaagctg300caacaagttgatagcctgcacccgcaccgtatgagcctggagccgtgggtggcgtaccgt360cagcaccgtggtcacaagtgcggcgtttttctgctgaacggtccggagtggcgtttcaac420cgtctgcgtctgaacccggaagtgctgagcccgaacgcggttcaacgttttctgccgatg480gtggacgcggttgcgcgtgatttcagccaggcgctgaagaaaaaggtgctgcaaaacgcg540cgtggtagcctgaccctggacgttcagccgagcatctttcactataccattgaggcgagc600aacctggcgctgttcggcgaacgtctgggtctggttggccatagcccgagcagcgcgagc660ctgaacttcctgcacgcgctggaagtgatgtttaagagcaccgttcagctgatgttcatg720ccgcgtagcctgagccgttggaccagcccgaaagtgtggaaggagcacttcgaagcgtgg780gactgcatctttcaatacggtgataactgcatccagaaaatttatcaagagctggcgttt840agccgtccgcagcaatacaccagcatcgttgcggagctgctgctgaacgcggaactgagc900ccggacgcgattaaggcgaacagcatggaactgaccgcgggcagcgtggataccaccgtt960ttcccgctgctgatgaccctgtttgagctggcgcgtaacccgaacgtgcagcaagcgctg1020cgtcaggaaagcctggctgcggcggcgagcattagcgagcacccgcaaaaagcgaccacc1080gaactgccgctgctgcgtgcggcgctgaaggaaaccctgcgtctgtatccggtgggtctg1140ttcctggaacgtgtggcgagcagcgacctggttctgcaaaactaccacatcccggcgggt1200accctggtgcgtgtttttctgtatagcctgggtcgtaacccggcgctgtttccgcgtccg1260gagcgttacaacccgcagcgttggctggatattcgtggtagcggccgtaacttttatcac1320gtgccgttcggttttggcatgcgtcagtgcctgggccgtcgtctggcggaggcggaaatg1380ctgctgctgctgcaccacgtgctgaaacacctgcaagttgaaaccctgacccaagaagat1440atcaagatggtttacagcttcattctgcgtccgagcatgttcccgctgctgacctttcgt1500gcgatcaactaa1512<210>2<211>1512<212>DNA<213>人工序列<400>2atggcgctgtgggcgaaagcgcgtgtgcgtatggcgggtccgtggctgagcctgcatgaa60gcgcgtctgctgcgtacccgtggtgcggcggcgccgaaagcggttctgccgtttgaggcg120atgccgcgttgcccgggtaacaagtggatgcgtatgctgcaaatctggaaagagcaaagc180agcgaaaacatgcacctggacatgcaccagaccttccaagaactgggcccgatttttcgt240tacgatgtgggtggccgtcacatggtgttcgttatgctgccggaggacgttgaacgtctg300caacaagcggatagccaccacccgcagcgtatgatcctggagccgtggctggcgtatcgt360caagcgcgtggtcacaagtgcggcgtgtttctgctgaacggtccgcagtggcgtctggac420cgtctgcgtctgaacccggatgttctgagcctgccggcgctgcaaaagtacaccccgctg480gttgacggcgttgcgcgtgatttcagccagaccctgaaagcgcgtgtgctgcaaaacgcg540cgtggtagcctgaccctgggtcaccgtgcgcagctgtttcgttacaccatcgaagcgagc600accctggttctgtatggcgagcgtctgggcctgctgacccagcaaccgaacccggacagc660ctgaacttcattcacgcgctggaagcgatgctgaagagcaccgtgcagctgatgtttgtt720ccgcgtcgtctgagccgttggatgagcaccaacatgtggcgtgagcacttcgaagcgtgg780gattacatctttcaatatgcgaaccgtgcgatccagcgtatttaccaagaactggcgctg840ggtcacccgtggcactatagcggcattgtggcggagctgctgatgcgtgcggacatgacc900ctggataccatcaaagcgaacaccattgacctgaccgcgggtagcgttgataccaccgcg960ttcccgctgctgatgaccctgtttgaactggcgcgtaacccggaagtgcagcaagcggtt1020cgtcaggagagcctggtggcggaagcgcgtatcagcgagaacccgcaacgtgcgattacc1080gaactgccgctgctgcgtgcggcgctgaaggaaaccctgcgtctgtatccggttggcatc1140accctggagcgtgaagtgagcagcgacctggttctgcaaaactaccacattccggcgggt1200accctggtgaaagttctgctgtatagcctgggtcgtaacccggcggtgtttgcgcgtccg1260gaaagctaccacccgcagcgttggctggatcgtcaaggtagcggcagccgttttccgcac1320ctggcgttcggttttggcgttcgtcagtgcctgggtcgtcgtgtggcggaagtggaaatg1380ctgctgctgctgcaccacgtgctgaagaacttcctggttgaaaccctggagcaggaagac1440atcaaaatggtgtatcgttttattctgatgccgagcaccctgccgctgttcacctttcgt1500gcgatccaataa1512<210>3<211>1500<212>DNA<213>人工序列<400>3atggcgctgcgtgttaccgcggacgtttggctggcgcgtccgtggcaatgcctgcatcgt60acccgtgcgctgcgtaccaccgcgaaggtggcgccgaagaccctgaaaccgttcgaggcg120atcccgcaatacagccgtaacaagtggctgaaaatgatccagattctgcgtgagcagggt180caagaaaacctgcacctggagatgcaccaggcgttccaagaactgggcccgatctttcgt240cacagcgcgggtggcgcgcaaattgtgagcgttatgctgccggaggacgcggaaaagctg300caccaggttgaaagcatcctgccgcaccgtatgccgctggagccgtgggtggcgcaccgt360gaactgcgtggtctgcgtcgtggcgtttttctgctgaacggtgcggattggcgtttcaac420cgtctgcaactgaacccgaacatgctgagcccgaaagcgattcagagcttcgtgccgttt480gttgacgtggttgcgcgtgattttgtggagaacctgaagaaacgtatgctggaaaacgtt540cacggtagcatgagcatcaacatccaaagcaacatgttcaactacacgatggaggcgagc600cacttcgtgattagcggtgaacgtctgggtctgaccggtcacgatctgaagccggagagc660gttaccttcacccacgcgctgcacagcatgtttaagagcaccacccagctgatgttcctg720ccgaaaagcctgacccgttggaccagcacccgtgtgtggaaagagcacttcgacagctgg780gatatcattagcgaatacgtgaccaagtgcatcaaaaacgtttatcgtgagctggcggaa840ggtcgtcagcaaagctggagcgttattagcgagatggtggcgcagagcaccctgagcatg900gacgcgatccacgcgaacagcatggaactgattgcgggcagcgtggataccaccgcgatc960agcctggttatgaccctgtttgaactggcgcgtaacccggacgtgcagcaagcgctgcgt1020caagagagcctggcggcggaagcgagcattgttgcgaacccgcagaaggcgatgagcgat1080ctgccgctgctgcgtgcggcgctgaaagaaaccctgcgtctgtacccggtgggtagcttc1140gttgaacgtatcgtgcacagcgacctggttctgcaaaactatcacgtgccggcgggtacc1200tttgttatcatttacctgtatagcatgggccgtaacccggcggtgtttccgcgtccggag1260cgttacatgccgcagcgttggctggaacgcaagcgtagctttcaacacctggcgttcggt1320tttggcatgcgtcagtgcctgggccgtcgtctggcggaagtggaaatgctgctgctgctg1380caccacatgctgaaaaccttccaggtggaaac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