本發(fā)明涉及檢測(cè)用試劑盒，具體是通過涉及通過平原血漿循環(huán)microrna-369-3p、microrna-449b-3p、microrna-136-3p和microrna-4791表達(dá)量來預(yù)測(cè)急性高山病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。，從而用于評(píng)定人體急性高山病的易感性。

背景技術(shù)：

急性高山病(acutemountainsickness，ams)，又稱作急性輕癥高原反應(yīng)，是發(fā)生在長期生活于低海拔地區(qū)的人，在未適應(yīng)新環(huán)境的情況下快速進(jìn)入2500m以上高原后1-3天產(chǎn)生，包括失眠、頭痛、眩暈、食欲缺乏、情緒不安及嘔吐等一系列癥狀，其中劇烈的頭疼是ams的典型癥狀。而ams根據(jù)上升速度和具體海拔的不同，其發(fā)病率高達(dá)50％至85％(bartschpandswensoner(2013)，clinicalpractice：acutehigh-altitudeillnesses，《nengljmed》，368(24)，2294-302.)，對(duì)于進(jìn)入高原的人群而言，ams會(huì)嚴(yán)重影響其工作和生活能力。更嚴(yán)重的是，如果ams沒有得到有效的控制與治療，很可能發(fā)展成為具有高致死率的高原腦水腫(highaltitudecerebraledema，hace)(booscjetal.(2016)，highaltitudeandacutemountainsicknessandchangesincirculatingendothelin-1，interleukin-6，andinterleukin-17a，《highaltitudemedicine&biology》，17(1)，25-31.)。

ams有明顯的遺傳傾向性及個(gè)體易感性，高原低壓低氧的環(huán)境因素和遺傳因素均可以影響ams的發(fā)生。多年以來，ams的遺傳傾向性及個(gè)體易感性一直是國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)，盡管有人已經(jīng)提出使用低氧敏感基因egln1和hif-1an的snp位點(diǎn)對(duì)ams易感人群進(jìn)行預(yù)測(cè)，但是目前看來這些標(biāo)記物在準(zhǔn)確性和特異性等方面都不盡如人意(zhange，zhangj，jinj，qinj，lih，huangl：variantsofthelowoxygensensorsegln1andhif-1anassociatedwithacutemountainsickness.《internationaljournalofmolecularsciences》，2014，15(12)：21777-21787.)。我國高原面積遼闊(約占國土面積的1/5)近年以來，青藏高原平均海拔在4000米以上，隨著國內(nèi)外高原旅游業(yè)及高原經(jīng)濟(jì)建設(shè)的蓬勃發(fā)展，越來越多的平原世居人群進(jìn)入高原，而ams的發(fā)生已給人們的生活和工作造成十分嚴(yán)重的影響，所以亟待尋找到在平原對(duì)ams的發(fā)病易感性進(jìn)行預(yù)測(cè)的有效方法。

microrna是一類廣泛存在于真核生物中的內(nèi)源性小分子非編碼rna，長度為18～24個(gè)核苷酸。microrna通過轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞分化、增殖、凋亡等生命活動(dòng)，在胚胎發(fā)育、機(jī)體代謝、疾病發(fā)生發(fā)展等多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。近年來，研究人員在血液、唾液、尿液等多種體液中檢測(cè)到microrna，提出循環(huán)microrna的概念。并且，microrna的表達(dá)水平的高低和其遺傳基因的差異性高度相關(guān)，近年來，大量的研究表明，循環(huán)microrna對(duì)腫瘤、高血壓、卒中及一系列疾病的提前診斷和發(fā)病預(yù)測(cè)都有很好的特異性和敏感性。再者血液等體液標(biāo)本易于獲得，臨床可操作性強(qiáng)且創(chuàng)傷性小，而且循環(huán)microrna穩(wěn)定性好，檢測(cè)便利，因此，循環(huán)microrna具有作為ams無創(chuàng)性生物標(biāo)志物的潛能，適用于ams易感性人群篩查(ghaivandwangk(2016)，recentprogresstowardtheuseofcirculatingmicrornasasclinicalbiomarkers，《archtoxicol》.)。

而關(guān)于循環(huán)microrna與ams易感性之間的相關(guān)性，尚未見報(bào)道。

更未見一種用于檢測(cè)血中microrna-369-3p、microrna-449b-3p、microrna-136-3p和microrna-4791表達(dá)水平來預(yù)測(cè)ams發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的報(bào)道。同樣運(yùn)用microrna-369-3p、microrna-449b-3p、microrna-136-3p和microrna-4791聯(lián)合的方法預(yù)測(cè)ams發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)亦未見報(bào)道。

通過平原世居者平原血漿循環(huán)microrna的芯片譜篩查，結(jié)合其高原缺氧暴露后的ams發(fā)病情況，發(fā)現(xiàn)平原血漿循環(huán)microrna-136-3p、microrna-4791在ams易感者和ams耐受者之間存在著差異。再通過sybr(即sybrgreen染料，縮寫sybr)實(shí)時(shí)熒光定量pcr(聚合酶鏈反應(yīng))的方法檢測(cè)了平原血漿循環(huán)microrna-369-3p、microrna-449b-3p、microrna-136-3p和microrna-4791表達(dá)水平，證實(shí)了平原血漿循環(huán)microrna-369-3p、microrna-449b-3p、microrna-136-3p和microrna-4791表達(dá)水平和ams的易感性之間存在著相關(guān)性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于尋找與ams相關(guān)的平原血漿新型生物學(xué)標(biāo)志物，而另一個(gè)目的在于提供平原血漿microrna-369-3p、microrna-449b-3p、microrna-136-3p和microrna-4791在制備平原預(yù)測(cè)ams發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒中的運(yùn)用。該試劑盒能用于平原人在進(jìn)入高原前對(duì)ams易感者的篩選，指導(dǎo)ams的預(yù)防，減輕ams的威脅。

發(fā)明人通過對(duì)13例ams患者和9例健康對(duì)照的血漿microrna表達(dá)譜進(jìn)行對(duì)比分析，后對(duì)41例ams患者和46例健康對(duì)照的血漿microrna-369-3p、microrna-449b-3p、microrna-136-3p和microrna-4791表達(dá)水平進(jìn)行比較，研究上述4個(gè)microrna與ams的相關(guān)性，尋找出了敏感可信的ams易感生物遺傳標(biāo)記。步驟是使用edta-na抗凝管采集22名擬從平原快速進(jìn)入高原人群的外周血2ml，3000×g，25攝氏度下分離10分鐘后提取上層血漿-80攝氏度下保存?zhèn)溆茫ㄟ^microrna表達(dá)譜芯片(mircurytmlnaarray(v.18.0))對(duì)血漿中microrna表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，待人群進(jìn)入高原后，根據(jù)ams國際通用診斷標(biāo)準(zhǔn)路易斯湖評(píng)分診斷系統(tǒng)區(qū)分ams和健康人群，比較ams和健康人群microrna表達(dá)譜，篩選ams易感相關(guān)microrna，發(fā)現(xiàn)上述4個(gè)microrna在ams易感者和健康人群中表達(dá)存在顯著差異。

使用qpcr技術(shù)在另一獨(dú)立人群中對(duì)上述4個(gè)microrna在ams易感者(41例)和健康對(duì)照組(46例)中的表達(dá)分布進(jìn)行檢測(cè)。整個(gè)過程中血漿rna提取采用德國凱杰技術(shù)有限公司的血漿microrna柱式抽提試劑盒(mirneasyserum/plasmakit，貨號(hào)：217184)提取，然后采用實(shí)時(shí)熒光定量pcr(hairpin-ittmmirnasrt-pcrquantitationkit，貨號(hào)：e01008)的方法進(jìn)行對(duì)上述4個(gè)microrna和外參cel-mir-39進(jìn)行擴(kuò)增；在分別計(jì)算每例標(biāo)本的microrna-369-3p、microrna-449b-3p、microrna-136-3p和microrna-4791相對(duì)cel-mir-39的歸一化表達(dá)水平，結(jié)果經(jīng)過spss19.0進(jìn)行檢驗(yàn)，以p＜0.05為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)ams易感組標(biāo)本(41例)和正常人群(46例)血漿microrna-369-3p、microrna-449b-3p、microrna-136-3p和microrna-4791的表達(dá)水平存在著顯著差異(表1)

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，找到平原血漿microrna標(biāo)志物可以篩選出ams易感者和耐受者。通過檢測(cè)人平原血漿中的microrna-369-3p、microrna-449b-3p、microrna-136-3p和microrna-4791的含量，通過表達(dá)量高低來區(qū)分ams易感者和耐受者，進(jìn)而預(yù)測(cè)進(jìn)入高原后ams的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案是：檢測(cè)平原人血漿microrna-369-3p、microrna-449b-3p、microrna-136-3p和microrna-4791的含量，以區(qū)分ams易感者和耐受者，上述4個(gè)microrna具體信息見表2。

本發(fā)明的效益是：篩選出的micrornas對(duì)ams有很好的預(yù)測(cè)效能，能夠在平原預(yù)測(cè)到達(dá)高原后ams的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，指導(dǎo)ams的預(yù)防和治療，減輕ams的威脅。

本發(fā)明除了上述技術(shù)方案以外，還做了如下的改進(jìn)。

本發(fā)明還包括，血漿microrna(microrna-369-3p、microrna-449b-3p、microrna-136-3p和microrna-4791)在制備預(yù)測(cè)ams發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒中的作用。

附圖說明

圖1.ams易感者和耐受者的血漿中microrna-369-3p表達(dá)水平(即與cel-mir-39相比microrna-369-3p的歸一化水平)。

圖2.ams易感者和耐受者的血漿中microrna-449b-3p表達(dá)水平(即與cel-mir-39相比microrna-449b-3p的歸一化水平)。

圖3.ams易感者和耐受者的血漿中microrna-136-3p表達(dá)水平(即與cel-mir-39相比microrna-136-3p的歸一化水平)。

圖4.ams易感者和耐受者的血漿中microrna-4791表達(dá)水平(即與cel-mir-39相比microrna-4791的歸一化水平)。

其中ams是ams易感者、non-ams為耐受者。*：p＜0.05，即有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，**：p＜0.01，即有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，***：p＜0.001，即有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖5.為ams易感者血漿microrna-369-3p、microrna-449b-3p、microrna-136-3p和microrna-4791的工作特征曲線(receiveroperatingcharacteristiccurve，簡稱roc曲線)，該圖中的很好的顯示了ams易感者的roc曲線、曲線下面積(areaunderthecurve，auc)、靈敏性(sensitivity)、特異性(specificity)，其中auc反映了預(yù)測(cè)效能。

圖6.為ams易感者血漿microrna-369-3p、microrna-449b-3p、microrna-136-3p和microrna-4791進(jìn)行聯(lián)合預(yù)測(cè)的的工作特征曲線(receiveroperatingcharacteristiccurve，簡稱roc曲線)，該圖中的很好的顯示了ams易感者的roc曲線、曲線下面積(areaunderthecurve，auc)、靈敏性(sensitivity)、特異性(specificity)，其中auc反映了預(yù)測(cè)效能(auc＝0.5，沒有預(yù)測(cè)效能；0.5＜auc＜0.7很小的預(yù)測(cè)價(jià)值；0.7＜auc＜0.9相當(dāng)準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)價(jià)值；0.9＜auc＜1，很準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)價(jià)值)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述，所列舉的實(shí)施例僅僅是用來解釋本發(fā)明，并非用于限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1血漿標(biāo)本microrna-369-3p、microrna-449b-3p、microrna-136-3p和microrna-4791的表達(dá)與ams發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性研究。

一、材料與標(biāo)本收集描述

ams易感者血漿標(biāo)本收集自急進(jìn)高原人群中的ams患者進(jìn)入高原前，合計(jì)41例。正常人群的血漿標(biāo)本收集自急進(jìn)高原人群中的正常健康人群進(jìn)入高原前，合計(jì)46例。ams的診斷是通過國際通用診斷標(biāo)準(zhǔn)-路易斯湖評(píng)分來確認(rèn)的。所有人群在取血之前沒有服用任何預(yù)防性藥物。每個(gè)樣本用edta-na抗凝管合計(jì)收集2ml血液。

二、樣品處理和rna提取

在靜脈血采集后10min內(nèi)，在3000×g，25攝氏度下離心10分鐘之后，用無rna酶和無細(xì)菌的吸頭取上層血漿于無rna酶和無細(xì)菌的ep管中-80℃保存?zhèn)溆?。血漿中的rna通過德國凱杰技術(shù)有限公司的血漿microrna柱式抽提試劑盒(mirneasyserum/plasmakit，貨號(hào)：217184)按照說明書操作步驟進(jìn)行提取和純化。

三、實(shí)時(shí)熒光定量pcr(sybr染料法)

運(yùn)用中國上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司的microrna實(shí)時(shí)熒光定量pcr試劑盒(hairpin-ittmmirnasrt-pcrquantitationkit，貨號(hào)：e01008)對(duì)目的microrna(microrna-369-3p、microrna-449b-3p、microrna-136-3p和microrna-4791)和外參cel-mir-39進(jìn)行擴(kuò)增；分別得到ct值(cyclethreshold)，通過公式：表達(dá)量＝2ct(cel-mir-39)-ct(目的microrna)在分別計(jì)算每例標(biāo)本的目的microrna的表達(dá)水平，具體操作過程見說明書。每個(gè)樣本重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。目的microrna與cel-mir-39引物序列見表3.

四、統(tǒng)計(jì)分析方法。

運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件spss19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。正態(tài)性檢驗(yàn)采用shapiro-wilk法，顯著性差異用mann-whitney檢驗(yàn)(mann-whitneytest)，工作特征曲線(receiveroperatingcharacteristiccurve，簡稱roc曲線)及線下面積(areaunderthecurve，auc)用于評(píng)價(jià)目的microrna單獨(dú)的預(yù)測(cè)效能。當(dāng)p＜0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

運(yùn)用二元logistic回歸，建立4個(gè)目的microrna的相關(guān)方程，得到預(yù)測(cè)概率p，并以預(yù)測(cè)概率p為檢驗(yàn)變量進(jìn)行roc曲線分析，繼而評(píng)價(jià)4個(gè)目的microrna聯(lián)合運(yùn)用的預(yù)測(cè)效能。當(dāng)p＜0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

六、結(jié)果分析

1.ams易感者與ams耐受者，血漿microrna-369-3p的表達(dá)量相比，p＜0.001，有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.ams易感者與ams耐受者，血漿microrna-449b-3p的表達(dá)量相比，p＜0.001，有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3.ams易感者與ams耐受者，血漿microrna-136-3p的表達(dá)量相比，p＜0.001，有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

4.ams易感者與ams耐受者，血漿microrna-4791的表達(dá)量相比，p＜0.001，有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

5.血漿microrna-369-3p對(duì)ams易感者與ams耐受者的預(yù)測(cè)效能通過roc曲線可以知道，microrna-369-3p對(duì)ams易感者與ams耐受者的預(yù)測(cè)效效能良好，auc為0.859(95％ci，0.783-0.985)。

6.血漿microrna-449b-3p對(duì)ams易感者與ams耐受者的預(yù)測(cè)效能通過roc曲線可以知道，microrna-449b-3p對(duì)ams易感者與ams耐受者的預(yù)測(cè)效能良好，auc為0.859(95％ci，0.783-0.985)。

7.血漿microrna-136-3p對(duì)ams易感者與ams耐受者的預(yù)測(cè)效能通過roc曲線可以知道，microrna-136-3p對(duì)ams易感者與ams耐受者的預(yù)測(cè)效能是良好，auc為0.724(95％ci，0.617-0.830)。

8.血漿microrna-4791對(duì)ams易感者與ams耐受者的預(yù)測(cè)效能通過roc曲線可以知道，microrna-4791對(duì)ams易感者與ams耐受者的預(yù)測(cè)效能良好，auc為0.748(95％ci，0.644-0.852)。

9.聯(lián)合運(yùn)用4個(gè)血漿microrna對(duì)ams易感者與ams耐受者的預(yù)測(cè)效能通過roc曲線可以知道，聯(lián)合運(yùn)用4個(gè)血漿microrna對(duì)ams易感者與ams耐受者的預(yù)測(cè)效能是很好，優(yōu)于其單獨(dú)運(yùn)用，auc為0.993(95％ci，0.978-1.000)。七、結(jié)論

血漿中microrna-369-3p、microrna-449b-3p、microrna-136-3p和microrna-4791對(duì)ams易感者與ams耐受者有很好的預(yù)測(cè)效能，能夠預(yù)測(cè)ams的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，并且四者的聯(lián)合運(yùn)用的預(yù)測(cè)效能優(yōu)于分別單獨(dú)使用。

表1ams易感組和ams耐受組血漿目的microrna的表達(dá)水平

***ams易感組vs.ams耐受組：p＜0.001，數(shù)據(jù)以中位數(shù)(25％-75％分位數(shù))表示

表2microrna基本信息

表3目的microrna、cel-mir-39引物信息