本發(fā)明涉及一株銅綠假單胞菌及其應用，屬于食品生物
技術領域：
。
背景技術：
：作為工業(yè)化的微生物細胞工廠，銅綠假單胞菌已廣泛應用于食品，發(fā)酵等領域，但目前在乳制品領域的應用相對較少。乳制品是嬰幼兒食品的重要組成部分，但嬰幼兒乳制品目前存在的主要問題為蛋白過敏。全世界兒童牛乳過敏的發(fā)生率為0.3％-7.5％，乳蛋白過敏主要是由特異性IgE抗體介導的I型超敏反應，可引起呼吸道、消化道、皮膚或全身過敏，主要表現(xiàn)為嘔吐、腹痛和腹瀉等胃腸道不適。特別對于嬰兒，牛乳中主要含有的酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白等作為異種蛋白，有可能成為過敏原。牛乳蛋白主要分為乳清蛋白(whey)和凝乳蛋白(curd)兩部分，凝乳蛋白占乳蛋白總量的80％，αS1-酪蛋白是凝乳蛋白中最主要的一個過敏原，同時乳清蛋白的主要組成是β-乳球蛋白。在保留乳蛋白營養(yǎng)價值和風味的同時有效的降低其抗原性和過敏原性依舊是一個難題，而蛋白酶水解法在有效降低和消除過敏原的同時不會影響產(chǎn)物的營養(yǎng)價值，相比于其他幾種脫敏方法，如加熱處理、糖基化反應和乳酸菌發(fā)酵法等，不僅可以水解部分過敏源，還可生產(chǎn)出具有調(diào)節(jié)免疫功能、抗凝血、降血壓等其他生理功能的多肽。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一株銅綠假單胞菌(Pseudomonasartuginosa)S8，其于2016年9月27日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:M2016533，地址：中國，武漢，武漢大學。所述銅綠假單胞菌CCTCCNO:M2016533是從奶牛場采集了大量土樣，通過高通量篩選獲得的可水解牛乳蛋白的蛋白酶分泌菌株。該菌株的發(fā)酵上清液能有效降解αS1-酪蛋白、β-乳球蛋白，因而可用于去除牛乳蛋白中的過敏原、制備奶制品，包括配方奶粉，降低嬰兒、成人食用奶制品過敏的風險?！芭Ｈ榈鞍住钡谋硎霰焕斫鉃橹傅氖侵辽侔环N乳清蛋白組分或一種酪蛋白組分的含水培養(yǎng)基。作為牛奶底物的非限制的例子，可以是提及的牛奶、牛奶濃縮物、乳制食品基質、乳酸基質等等。生物材料保藏銅綠假單胞菌(Pseudomonasartuginosa)S8，已于2016年9月27日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢，武漢大學，保藏編號為CCTCCNO:M2016533。具體實施方式脫脂奶粉培養(yǎng)基：脫脂奶粉10g.L-1。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0g.L-1，酵母提取物5g.L-1，氯化鈉10g.L-1。CSN1S8酶聯(lián)反應試劑盒，購自上海嵐派生物科技有限公司。BLG酶聯(lián)反應試劑盒，購自上海嵐派生物科技有限公司。實施例1銅綠假單胞菌(CCTCCNO:M2016533)的篩選方法稱取1.0g混勻土樣與5mL無菌水于10mL離心管中混合，震蕩混勻后，分別使用無菌水10,100,1000倍稀釋后涂布脫脂奶粉平板培養(yǎng)基，然后于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)30℃靜置培養(yǎng)24h。挑選有水解圈產(chǎn)生的菌落轉接到新的脫脂奶粉平板培養(yǎng)基，然后于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)30℃靜置培養(yǎng)24h。而后觀察水解圈大小及菌落形態(tài)，將篩選到水解圈最大的的單菌落S8轉接于LB培養(yǎng)基中活化8小時后，再轉接于含20％甘油的LB培養(yǎng)基中，保藏于-80℃。該菌株S8的16SrRNA序列如SEQIDNO.1，菌株鑒定結果表明是銅綠假單胞菌。實施例2銅綠假單胞菌S8(CCTCCNO:M2016533)發(fā)酵液的αS1-酪蛋白去除效率將保藏于-80℃甘油管中的出發(fā)菌株銅綠假單胞菌(CCTCCNO:M2016533)以2％的接種量接入LB培養(yǎng)基，在30℃，220rpm，培養(yǎng)12h。以2％的接種量分別取活化好的銅綠假單胞菌轉接到新鮮的LB培養(yǎng)基中，在30℃，220rpm，培養(yǎng)12h后收集發(fā)酵液，8000rpm離心收集發(fā)酵液上清。將發(fā)酵液上清與αS1-酪蛋白標準品按1：1混合后，再30℃下反應1h。以αS1-酪蛋白標準品為對照，使用CSN1S8酶聯(lián)反應試劑盒，分別檢測樣品的αS1-酪蛋白含量。將將50μl樣品分別加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用，小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。每孔加終止液50μl，終止反應(此時藍色立轉黃色)。以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。表1.銅綠假單胞菌S8(CCTCCNO:M2016533)發(fā)酵液的αS1-酪蛋白去除效率實施例3銅綠假單胞菌S8(CCTCCNO:M2016533)發(fā)酵液的β-乳球蛋白去除效率將保藏于-80℃甘油管中的出發(fā)菌株銅綠假單胞菌(CCTCCNO:M2016533)以2％的接種量接入LB培養(yǎng)基，在30℃，220rpm，培養(yǎng)12h。以2％的接種量分別取活化好的銅綠假單胞菌轉接到新鮮的LB培養(yǎng)基中，在30℃，220rpm，培養(yǎng)12h后收集發(fā)酵液，8000rpm離心收集發(fā)酵液上清。將發(fā)酵液上清與β-乳球蛋白標準品按1：1混合后，再30℃下反應1h。以β-乳球蛋白標準品為對照，使用CSN1S8酶聯(lián)反應試劑盒，分別檢測樣品的αS1-酪蛋白含量。將將50μl樣品分別加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用，小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。每孔加終止液50μl，終止反應(此時藍色立轉黃色)。以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。表2.銅綠假單胞菌(CCTCCNO:M2016533)發(fā)酵液的β-乳球蛋白去除效率β-乳球蛋白標準品反應液去除效率β-乳球蛋白濃度(ng/mL)4.0323.35716.76％SEQUENCELISTING<110>江南大學<120>一株銅綠假單胞菌及其應用<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1441<212>DNA<213>銅綠假單胞菌<400>1cattgcggcagtctacacatgcaagtcgagcggatgaagggagcttgctcctggattcag60cggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcctggtagtgggggataacgtccggaaa120cgggcgctaataccgcatacgtcctgagggagaaagtgggggatcttcggacctcacgct180atcagatgagcctaggtcggattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacga240tccgtaactggtctgagaggatgatcagtcacactggaactgagacacggtccagactcc300tacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgaaagcctgatccagccatgccg360cgtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcactttaagttgggaggaagggcagtaag420ttaataccttgctgttttgacgttaccaacagaataagcaccggctaacttcgtgccagc480agccgcggtaatacgaagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgcgt540aggtggttcagcaagttggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatccaaaa600ctactgagctagagtacggtagagggtggtggaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgta660gatataggaaggaacaccagtggcgaaggcgaccacctggactgatactgacactgaggt720gcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgt780cgactagccgttgggatccttgagatcttagtggcgcagctaacgcgataagtcgaccgc840ctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcgg900tggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttacctggccttgacatgctga960gaactttccagagatggattggtgccttcgggaactcagacacaggtgctgcatggctgt1020cgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaacccttgtcctt1080agttaccagcacctcgggtgggcactctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaagg1140tggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacggccagggctacacacgtgctacaatgg1200tcggtacaaagggttgccaagccgcgaggtggagctaatcccataaaaccgatcgtagtc1260cggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgtgaatcaga1320atgtcacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgg1380gttgctccagaagtagctagtctaaccgcaagggggacgttaccacggaggttttcattt1440t1441當前第1頁1 2 3