本發(fā)明屬于利用分子生物學(xué)方法鑒別毛酸漿Physalis pubescens L.的技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鑒別毛酸漿的特異性標(biāo)記引物，以及一種利用該特異性引物對毛酸漿進(jìn)行快速鑒別的方法。

背景技術(shù)：

毛酸漿(Physalis pubescens L.)，別名黃菇蔦、洋菇娘，是茄科(Solanaceae)酸漿屬(Physalis)一年生草本植物。其原產(chǎn)美洲，在我國吉林、黑龍江、遼寧及內(nèi)蒙東部東南邊緣區(qū)域有栽培或逸為野生，多生于草地或田邊路旁。毛酸漿是一種非常重要的藥用食用兼?zhèn)渲参?。作為一味民間傳統(tǒng)中藥，毛酸漿在《神農(nóng)本草經(jīng)》中最早收錄，并列為中品，其帶萼果實或全草稱為燈籠草，性味酸平，入肺經(jīng)，具有清熱解毒、利尿止血的功效，可治愈腮腺炎、咽喉腫痛、小便不利及肺熱咳嗽，等。除了藥用功效外，毛酸漿還被用作高檔的新型營養(yǎng)保健“本草水果”，其果實清香可口，味道甜美，果實內(nèi)含有豐富的維生素C、胡蘿卜素、鈣、鐵等20多種礦物質(zhì)和18種人體所需要的氨基酸，營養(yǎng)豐富，深受人們喜愛。此外，毛酸漿果實還可加工制成果汁、果脯蜜餞、罐頭等，風(fēng)味獨特，成人兒童喜食，老幼咸宜。酸漿屬植物(毛酸漿Physalis pubescens、小酸漿P.minima、苦蘵P.angulata及酸漿Physalis alkekengi var.franchetii)的形態(tài)學(xué)特征極其相似，利用傳統(tǒng)分類方法很難將毛酸漿與其他酸漿屬相似植物區(qū)分開。因此，將其他酸漿屬植物誤認(rèn)為毛酸漿進(jìn)行使用的情況時有發(fā)生，這為毛酸漿資源的安全使用和保護(hù)帶來了很大困難。

DNA分子標(biāo)記尤其是特異性分子標(biāo)記技術(shù)彌補和克服了傳統(tǒng)分類方法的一些缺陷和難題，可以通過基因序列差異比較分析為植物鑒別、系統(tǒng)分類提供直接的證據(jù)。本專利首先運用SCoT分子標(biāo)記技術(shù)，采用PCR技術(shù)獲得酸漿屬植物SCoT指紋圖譜。經(jīng)過大量篩選試驗，獲得毛酸漿特異性條帶，通過切膠回收、TA克隆、測序等方法，開發(fā)設(shè)計了用于毛酸漿快速鑒別的特異性標(biāo)記引物，為毛酸漿種質(zhì)資源的準(zhǔn)確鑒別及保護(hù)提供有效的分子技術(shù)依據(jù)。迄今為止，尚未有分子特異性標(biāo)記應(yīng)用于毛酸漿鑒別的研究報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明第一個目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供毛酸漿的分子特異性標(biāo)記引物(ST3MSJF/ST3MSJR)，該特異性標(biāo)記引物序列如下：

上游引物ST3MSJF：5’-ATTGATAGGGTAAACCATG-3’，如SEQ ID NO.1所示；

下游引物ST3MSJR：5’-CTGTAATAAAACAAAAGCG-3’，如SEQ ID NO.2所示。

該引物組合是采用常規(guī)PCR技術(shù)，經(jīng)過大量篩選實驗，采用SCoT標(biāo)記獲得毛酸漿特異性DNA片段，通過切膠回收、TA克隆、測序，獲得該DNA序列，在此基礎(chǔ)上設(shè)計毛酸漿特異性標(biāo)記引物，以該引物對酸漿屬植物進(jìn)行PCR擴增，只與毛酸漿樣本DNA發(fā)生反應(yīng)，獲得1479bp大小的特異性片段，而不與其他酸漿屬植物樣品反應(yīng)。運用該特異性引物，通過常規(guī)PCR反應(yīng)即可以快速鑒別出毛酸漿樣品。

本發(fā)明的第二個目的是提供上述分子特異性標(biāo)記引物鑒別毛酸漿的方法。該方法為：采用上述引物組合(ST3MSJF/ST3MSJR)作為特異性擴增引物，以待測酸漿屬植物基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，若電泳結(jié)果出現(xiàn)分子量為1479bp大小的特異性片段，則待測酸漿屬植物樣品為毛酸漿，反之則不是。

具體的本發(fā)明所述方法如下：

(1)基因組DNA的提?。杭羧〈郎y酸漿屬植物樣品新鮮葉片100mg放入研缽，立即加入液氮研磨至粉末，然后使用UNIQ-10柱式植物基因組DNA抽提試劑盒(購于上海生工生物工程有限公司)提取基因組DNA，所得DNA用0.8％瓊脂糖膠進(jìn)行電泳檢測，并用紫外分光光度計檢測濃度，稀釋至50ng/μl。

(2)以步驟(1)提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標(biāo)記引物(ST3MSJF/ST3MSJR)作為擴增引物，進(jìn)行PCR擴增。

PCR擴增體系(總體積20μl)：2μl 10×Buffer，2μl MgCl₂(25mM)，0.8μl dNTPs(10mM)，1μl引物ST3MSJF(10μM)，1μl引物ST3MSJR(10μM)，1μl模板DNA(50ng/μl)，0.5μl Taq酶(2U/μl)，11.7μl ddH₂O。

PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；35個循環(huán)(94℃變性50s，56℃退火50s，72℃延伸1.5min)；72℃延伸10min。

(3)利用1.5﹪瓊脂糖凝膠對步驟(2)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測，若電泳結(jié)果出現(xiàn)分子量為1479bp大小的DNA條帶，則待測樣品為毛酸漿，反之則不是。

本發(fā)明實驗樣品用量少；結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高，ST3MSJF/ST3MSJR為毛酸漿專一性擴增引物，若為其他酸漿屬植物樣品，為陰性反應(yīng)；方法簡便，采用常規(guī)PCR技術(shù)進(jìn)行檢測，耗時短，半日即可完成。

附圖說明

圖1是利用本發(fā)明設(shè)計的特異性標(biāo)記引物ST3MSJF/ST3MSJR對酸漿屬植物樣品進(jìn)行PCR擴增后的電泳圖，其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)marker DL2000；通道1～4：小酸漿P.minima；5～13：苦蘵P.angulata；14～17：酸漿P.alkekengi var.franchetii；18～20：毛酸漿P.pubescens。電泳圖顯示只有毛酸漿樣品擴增出分子量為1479bp大小的特異性DNA條帶。

具體實施方式

本發(fā)明可以從分子水平上較為快速準(zhǔn)確的鑒別毛酸漿樣品，通過以下實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實施例1：毛酸漿分子特異性標(biāo)記引物開發(fā)設(shè)計

1.基因組DNA的提取

剪取酸漿屬植物樣品新鮮葉片100mg放入研缽，其中樣品包括小酸漿(采自1：河北唐山、2：山東菏澤、3：安徽六安、4：浙江麗水)、苦蘵(5-6：浙江杭州、7：湖北黃岡、8：云南紅河、9：江蘇南京、10：浙江臺州、11：浙江溫州、12：浙江金華、13：山東德州)、酸漿(14：遼寧沈陽、15-16：遼寧丹東、17：山東濟(jì)南)及毛酸漿(18：遼寧沈陽、19：黑龍江肇東、20：吉林長春)。立即加入液氮研磨至粉末，然后使用UNIQ-10柱式植物基因組DNA抽提試劑盒(購于上海生工生物工程有限公司)提取基因組DNA，所得DNA用0.8％瓊脂糖膠進(jìn)行電泳檢測，并用紫外分光光度計檢測濃度，稀釋至50ng/μl。用于后續(xù)PCR擴增。

2.設(shè)計分子特異性標(biāo)記引物

經(jīng)過大量SCoT-PCR擴增篩選實驗，通過切膠回收、TA克隆、以及測序獲得毛酸漿特異性核苷酸序列，在此基礎(chǔ)上設(shè)計獲得ST3MSJF/ST3MSJR引物序列(ST3MSJF：5’-ATTGATAGGGTAAACCATG-3’；ST3MSJR：5’-CTGTAATAAAACAAAAGCG-3’)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

實施例2：分子特異性標(biāo)記引物PCR擴增及電泳檢測

用設(shè)計合成的引物ST3MSJF/ST3MSJR對不同酸漿屬植物樣品(具體見附圖說明)進(jìn)行PCR檢測。

PCR反應(yīng)體系(總體積20μl)：2μl 10×Buffer，2μl MgCl₂(25mM)，0.8μl dNTPs(10mM)，1μl引物ST3MSJF(10μM)，1μl引物ST3MSJR(10μM)，1μl模板DNA(50ng/μl)，0.5μl Taq酶(2U/μl)，11.7μl ddH₂O。

PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；35個循環(huán)(94℃變性50s，56℃退火50s，72℃延伸1.5min)；72℃延伸10min。

利用1.5﹪瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，電泳圖如圖1所示，從圖1(圖中，通道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)marker DL2000；通道1～4：小酸漿P.minima；5～13：苦蘵P.angulata；14～17：酸漿P.alkekengi var.franchetii；18～20：毛酸漿P.pubescens)可以看出，只有毛酸漿(通道18～20)能擴增出特異性片段，將毛酸漿的特異性片段送去測序，其序列長度為1479bp。而其他酸漿屬植物樣品沒有擴增出任何條帶，這表明本發(fā)明的特異性引物具有極高的專一性，因此可以用于毛酸漿樣品的快速鑒別。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州師范大學(xué)

<120> 毛酸漿的分子特異性標(biāo)記引物及鑒別方法

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

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attgataggg taaaccatg 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ctgtaataaa acaaaagcg 19