本發(fā)明屬于化學(xué)分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種長(zhǎng)波長(zhǎng)trun-on型檢測(cè)肼的熒光探針及其合方法和在檢測(cè)肼方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肼(N₂H₄)是一種具有強(qiáng)還原性與雙功能基團(tuán)的高活性小分子化合物。作為化學(xué)燃料，反應(yīng)起始物在航天與燃料電池及抗氧化劑、高分子化合物、殺蟲(chóng)劑的合成等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。但是肼也具有高毒性及至畸變與致癌性，能通過(guò)呼吸系統(tǒng)及皮膚被人體攝入，產(chǎn)生頭痛、惡心等癥狀，以及導(dǎo)致肝腎等器官的損傷。美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)局規(guī)定了肼的安全限量值為10 ppb (0.3μmol·L^-1)。由于肼的大量工業(yè)使用排放及毒害作用，因此，開(kāi)發(fā)高靈敏、高選擇檢測(cè)肼的方法對(duì)環(huán)境檢測(cè)與保護(hù)是非常必要的。

目前檢測(cè)肼的方法主要采用滴定測(cè)量、衍生化色譜法(Vessman J. J. Chromatogr. A 1990, 511, 303; Anal. 2009, 49, 529.; Oh J-A. Chromatogr. A 2015, 1395, 73.)及基于修飾電極的電化學(xué)方法(Joseph M.B. Anal. Chem. 2015, 87, 10064.; Casella I. G. Electroanalysis 2012, 24, 752; Wang J. Sens. Actuators, B 2017, 239, 898.)等。但這些方法一般都耗時(shí)較長(zhǎng)、涉及復(fù)雜繁瑣的樣品處理過(guò)程或需要昂貴的精密儀器等。而利用分子探針熒光法檢測(cè)肼具有樣品處理簡(jiǎn)潔、成本低廉及操作簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)得到了發(fā)展與利用。但目前開(kāi)發(fā)的用于檢測(cè)肼的熒光探針?lè)肿悠浼ぐl(fā)及發(fā)射波長(zhǎng)大都在中短波段區(qū)域，這樣不利于復(fù)雜樣品背景干擾的消除，由于波段的光生物穿透能力弱且存在生物損傷性，因此，不利于生物樣品的檢測(cè)。而長(zhǎng)波長(zhǎng)的熒光探針，特別是激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)均在長(zhǎng)波長(zhǎng)處的熒光探針能很好的克服上述問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

對(duì)于上述情況，本發(fā)明目的是提供一種新的易于制備、性能穩(wěn)定的長(zhǎng)波長(zhǎng)熒光分子探針，并提供該探針的合成方法，還在此基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)出對(duì)肼進(jìn)行高選擇性和高靈敏度的檢測(cè)方法。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明利用肼具有較強(qiáng)的親電性，能對(duì)缺電子分子或基團(tuán)進(jìn)行親電反應(yīng)，而脂肪酸在一定的溶液環(huán)境中羰基能選擇性的與肼發(fā)生親電加成與脫出反應(yīng)，設(shè)計(jì)酯鍵為響應(yīng)基團(tuán)。另一方面，基于三氰呋喃為吸電子基團(tuán)，酚羥基為給電子基團(tuán)的大π共軛推拉體系，具有很好的長(zhǎng)波長(zhǎng)熒光發(fā)射性能，且通過(guò)在酚羥基位引入不同的吸電子基團(tuán)能改變?cè)瓱晒夥肿拥耐评娮芋w系的特性從而改變其熒光性質(zhì)，設(shè)計(jì)大π共軛推拉體系骨架作為發(fā)光團(tuán)，合成用于檢測(cè)肼的熒光分子探針。

所述檢測(cè)肼的熒光分子探針，結(jié)構(gòu)通式如下：

其中R₁、R₂選自具有1至18個(gè)碳原子的烷基鏈中的任一種；n₁為1、2或3；n₂取自0–17的任一整數(shù)。優(yōu)選：R₁、R₂選自具有1至6個(gè)碳原子的烷基鏈中的任一種；n₁為1、2；n₂取自0–8的任一整數(shù)。優(yōu)選：R₁、R₂選自具有1至4個(gè)碳原子的直鏈烷基鏈中的任一種；n₁為1；n₂取自0–4的任一整數(shù)。

R₁、R₂可以相同或不同。

進(jìn)一步優(yōu)選為：

其反應(yīng)流程如下：

其合成方法具體如下：

合成分兩步：

第一步：有機(jī)溶劑中，將三氰呋喃化合物3與末端對(duì)羥基苯基取代的共軛醛加熱回流，縮合反應(yīng)得到探針?lè)肿拥那绑w化合物2；

第二步：有機(jī)溶劑中，加入催化劑，將得到的化合物2與脂肪酸衍生物在室溫下進(jìn)行縮合反應(yīng)，分離純化后得到最終目標(biāo)產(chǎn)物探針?lè)肿?。

三氰呋喃化合物3中R₁、R₂選自具有1至18個(gè)碳原子的烷基鏈中的任一種，優(yōu)選為1-6個(gè)碳原子中的任一種。更優(yōu)選1至4個(gè)碳原子的直鏈烷基鏈中的任一種。

對(duì)羥基苯基取代的共軛醛為：

其中：n₃為具為0、1或2；n₃優(yōu)選為0或1。

脂肪酸衍生物為：

其中X為OH、Cl或Br；優(yōu)選X為Cl或Br。n₂取自0–17的任一整數(shù)，優(yōu)選n₂取自0–8的任一整數(shù)，更優(yōu)選n₂取自0–4的任一整數(shù)。

第一步反應(yīng)有機(jī)溶劑選自乙醇、甲苯。

第二步反應(yīng)有機(jī)溶劑選自二氯甲烷、氯仿、四氫呋喃、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮。

所述催化劑選自三乙胺、4-二甲氨基吡啶、二環(huán)己基碳二亞胺、N,N-二異丙基碳二亞胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺其中之一。

上述方法中第一步反應(yīng)時(shí)間為4-12 h。

上述方法中第二步反應(yīng)時(shí)間為12-24 h。

更進(jìn)一步優(yōu)選如下：

將化合物3(R₁、R₂均為一個(gè)碳原子數(shù)的烷基)與對(duì)羥基苯甲醛在乙醇溶液中回流，得到化合物2(R₁、R₂均為一個(gè)碳原子數(shù)的烷基，n₁為1)；將化合物2與乙酰氯加入含有三乙胺的無(wú)水二氯甲烷中，室溫下反應(yīng)過(guò)夜，減壓蒸餾除去溶劑后分離純化得到探針?lè)肿踊衔铩?/p>

反應(yīng)流程如下：

利用該分子探針對(duì)肼進(jìn)行定性和定量測(cè)定，用于水體、土壤或生物體系中肼的檢測(cè)。

采用比色法或熒光法檢測(cè)時(shí)，分子探針溶解于水與二甲基亞砜的混合緩沖溶液中，對(duì)肼進(jìn)行測(cè)試。當(dāng)加入肼后，肼能親核加成羰基，并進(jìn)一步通過(guò)脫除反應(yīng)，使熒光團(tuán)的的酚羥基游離出來(lái)形成氧負(fù)離子的結(jié)構(gòu)，與探針?lè)肿拥拇螃泄曹椢娮踊鶊F(tuán)三氰呋喃反應(yīng)，從而產(chǎn)生強(qiáng)烈的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT) 效應(yīng)，使探針溶液的吸收光譜發(fā)生紅移，并伴隨產(chǎn)生強(qiáng)的熒光發(fā)射特性。

采用熒光法檢測(cè)時(shí)，所述熒光分子探針對(duì)肼的檢測(cè)濃度為1 – 50 μmol·L^-1，檢測(cè)限為0.13 μmol·L^-1。

本發(fā)明熒光探針?lè)肿泳哂腥缦绿攸c(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)：

該熒光探針?lè)肿泳哂辛己玫姆€(wěn)定性和光學(xué)性質(zhì)，反應(yīng)前最大吸收波長(zhǎng)為~410nm，單獨(dú)溶液呈黃色，在紅光波段無(wú)發(fā)射；隨著肼的加入，探針?lè)肿釉谧贤馕辗寮t移至~580 nm，溶液呈紫色，在~620nm處有強(qiáng)的熒光發(fā)射性質(zhì)。

本發(fā)明所述的探針?lè)肿釉弦椎茫铣僧a(chǎn)率較高，達(dá)85%以上，光學(xué)性能穩(wěn)定（探針母液能在室內(nèi)穩(wěn)定存放三個(gè)月以上，其光譜性質(zhì)保持不變），高選擇性，對(duì)Al³⁺、 Ca²⁺、 Cd²⁺、Fe²⁺、 Fe³⁺、 K⁺、Mg²⁺、 Mn²⁺、 Pb²⁺、Zn²⁺、 AcO^-、 Br^-、CO₃^2-、 Cl^-、 HPO₄^2-、 I^-、N₃^-、 NO₂^-、NO₃^-、 SO₄^2-有很好的抗干擾沒(méi)能力，對(duì)肼識(shí)別能力強(qiáng)，且響應(yīng)速度較快，響應(yīng)范圍為1.0 – 50 μmol·L^-1。高靈敏度，檢測(cè)限低（0.13 μM），因此，該類型探針可用于水體、土壤以及生物體系中肼的檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明合成的分子探針的核磁共振氫譜；

圖2 為本發(fā)明分子探針與肼反應(yīng)前后的紫外譜圖A與熒光光譜圖B，其中，A圖中，1-反應(yīng)前，2-反應(yīng)后；B圖中，1-反應(yīng)前，2-反應(yīng)后；

圖3為本發(fā)明5 μmol·L^-1分子探針加入不同濃度肼后熒光發(fā)射光譜圖，從a至n，肼濃度分別為0、1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μmol·L^-1，溶液體系為水與二甲基亞砜的混合緩沖溶液（H₂O/DMSO=9/1, v/v, 10 mM HEPES, pH 7.4），橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。

圖4為肼的濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，即5 μmol·L^-1本發(fā)明分子探針，反應(yīng)前后在620nm處熒光發(fā)射強(qiáng)度的和肼濃度的線性關(guān)系；橫坐標(biāo)為肼的濃度，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。

圖5為本發(fā)明分子探針對(duì)肼選擇性；即5 μM本發(fā)明分子探針，加入100 μmol·L^-1不同離子(Al³⁺、 Ca²⁺、 Cd²⁺、Fe²⁺、 Fe³⁺、 K⁺、Mg²⁺、 Mn²⁺、 Pb²⁺、Zn²⁺、 AcO^-、 Br^-、CO₃^2-、 Cl^-、 HPO₄^2-、 I^-、N₃^-、 NO₂^-、NO₃^-、 SO₄^2-)后，在620 nm處熒光發(fā)射強(qiáng)度的變化；橫坐標(biāo)為測(cè)試的干擾離子，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。

圖6為本發(fā)明分子探針檢測(cè)Hela細(xì)胞內(nèi)肼的成像圖片。(A,B)分別是本發(fā)明分子熒光探針(20 μmol·L^-1)培養(yǎng)的HeLa的明場(chǎng)圖片和熒光圖片；(C,D)分別是本發(fā)明分子熒光探針(20 μmol·L^-1)和N₂H₄(100 μmol·L^-1)培養(yǎng)的Hela細(xì)胞的明場(chǎng)圖片和熒光圖片。標(biāo)尺：50 μm。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例 1：熒光分子探針的合成

將化合物3(R₁、R₂均為一個(gè)碳原子數(shù)的烷基)(398 mg, 2.0 mmol)與對(duì)羥基苯甲醛(268 mg, (2.2 mmol)加入到乙醇(50 mL)中加熱回流反應(yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸餾除去溶劑，柱層析住分離得到棕紅色固體(化合物2)。

將化合物2(303 mg,1 mmol)，乙酰氯(157 mg, 2.0 mmol, 142 mL)加入三乙胺 (304 mg, 2.2 mmol, 416 mL)，溶劑二氯甲烷(20 mL)中室溫反應(yīng)8h。待反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸餾除去溶劑，柱層析柱分離（洗脫劑為二氯甲烷/甲醇=10/1的混合溶液）得到產(chǎn)物黃色固體293mg (收率：85%)。產(chǎn)物結(jié)構(gòu)式如下:

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.61 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.55 (s, 1H), 7.18 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.92 (d, J = 16.4 Hz, 1H), 2.27 (s, 3H), 1.66 (d, J = 58.5 Hz, 6H). MS [ESI]: m/z, calcd for [M+H]⁺ 346.1192; found 346.1184.。

實(shí)施例 2：探針對(duì)肼的熒光檢測(cè)

將上述制得分子探針溶解于水與二甲基亞砜的混合緩沖溶液（H₂O/DMSO=9/1, v/v, 10 mM HEPES, pH 7.4)）中，配制成5 μmol·L^-1的探針溶液。在3 mL的比色皿中加入2mL配制的5 μmol·L^-1 的本發(fā)明探針溶液，然后分別加入不同濃度的肼均勻混合，測(cè)試其熒光光譜，結(jié)果如圖3所示。以溶液在620nm處熒光發(fā)射強(qiáng)度對(duì)肼的濃度作圖，肼濃度在1.0 – 50 μmol·L^-1范圍內(nèi)時(shí)，兩者之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(圖4)，能實(shí)現(xiàn)該濃度范圍內(nèi)肼的定量檢測(cè)，而且溶液從黃色變?yōu)樽仙?，也適用于裸眼檢測(cè)。并且此探針不受其它一些常見(jiàn)離子的影響，如：Al³⁺、 Ca²⁺、 Cd²⁺、Fe²⁺、 Fe³⁺、 K⁺、Mg²⁺、 Mn²⁺、 Pb²⁺、Zn²⁺、 AcO^-、 Br^-、CO₃^2-、 Cl^-、 HPO₄^2-、 I^-、N₃^-、 NO₂^-、NO₃^-、 SO₄^2-。在上述干擾離子存在的條件下，探針對(duì)肼仍具有良好的選擇性和靈敏度(圖5)。

將細(xì)胞與含本發(fā)明探針培養(yǎng)液培養(yǎng)后，再加入肼，于含肼的溶液中培養(yǎng)。細(xì)胞熒光成像可觀測(cè)到紅色熒光(圖6)。

可以看出，本發(fā)明能實(shí)現(xiàn)對(duì)肼的定性、定量檢測(cè)，靈敏度高，檢測(cè)限達(dá)0.13 μmol·L^-1，且抗干擾強(qiáng)，并能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的肼的檢測(cè)。