本發(fā)明屬于分子生物技術領域，涉及一種斷奶仔豬抗應激生理反應能力的標記引物和方法。

背景技術：

仔豬早期斷奶導致早期斷奶綜合癥，采食量下降，體重減輕甚至停滯不長，免疫力下降，腸道結構和功能遭到破壞，容易發(fā)生腹瀉和水腫，重度的會致死。早期斷奶綜合征導致的仔豬生長受阻，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經濟損失。仔豬斷奶相關研究一直是熱點，Dunsford等(1989)研究發(fā)現，21日齡斷奶仔豬在斷奶后第3天腸絨毛高度顯著下降，這種顯著變化持續(xù)到斷奶后第12天。顧憲紅等(2001)研究結果表明斷奶導致仔豬腸絨毛高度縮短，隱窩加深。斷奶導致的仔豬腸道結構這種變化，造成腸道消化吸收面積減小，導致消化能力下降、養(yǎng)分吸收減少。因此，在斷奶后具有更高的腸道發(fā)育狀況的斷奶仔豬生長狀況會更加優(yōu)良，也就是說具有更強的抗應激生理反應能力。通過在斷奶仔豬日糧中添加仔豬所需的營養(yǎng)物質從而減輕斷奶應激的相關研究已有很多。李垚等(2005)的研究表明，在21日齡斷奶仔豬日糧中添加表皮生長因子可以提高促腎上腺皮質激素、皮質醇、胰島素水平，促進肌肉蛋白質的合成與周轉，增加蛋白質、脂肪、糖原的合成，刺激細胞的增殖與分化，有效地緩解斷奶應激。楊彩梅等(2005)的研究表明，日糧中添加谷氨酰胺能促進斷奶初期仔豬的采食和生長，能提高斷奶仔豬小腸食糜中脂肪酶、淀粉酶和糜蛋白酶的活力。從現有研究中可以了解到，當斷奶仔豬豬血清谷氨酰胺酶GA、皮質醇Cor含量越高、小腸絨毛高度約高對營養(yǎng)物質的吸收利用能力就越強，斷奶仔豬的抗應激生理反應能力也就越強。GA是谷氨酰胺分解的關鍵酶和限速酶，仔豬斷奶后，母源谷氨酰胺消失，小腸營養(yǎng)物質缺乏，體內谷氨酰胺水解代謝加強以緩斷奶應激。仔豬斷奶后血清Cor濃度會升高，促進仔豬體內合成代謝，使仔豬抗應激能力加強。Cor是介導動物體內應激反過程的一種重要中間介質，血清Cor濃度的高低能靈敏地反映機體遭受創(chuàng)傷程的強弱，因此可以把GA、Cor看作是判定動物遭受應激程度的一個敏感而有效指標。尋找到高血清GA、Cor含量和小腸絨毛高度的斷奶仔豬，對提高斷奶仔豬抗應激生理反應能力，減少斷奶仔豬因斷奶而引起的生長狀況下降，提高效益減少養(yǎng)殖成本具有重要的意義。

已有研究表明不同豬種抗應激能力存在一定差異，且中國地方豬種抗應激能力普遍較外來豬種強。現有的研究表明，血清生化指標、腸黏膜形態(tài)是研究斷奶仔豬斷奶應激的重要指標，而現有的研究對地方豬種和外來豬種斷奶應激差異性的報道較少。尤其是奶應激期，中外豬種仔豬的抗應激能力及其遺傳機理相關研究目前未見報道。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的在于以安徽地方優(yōu)良品種安慶六白豬和國外引進品種長白豬為研究對象，研究兩個豬種在斷奶應激期血清生化指標變化、腸黏膜形態(tài)變化。探討品種間斷奶應激期仔豬血清指標的差異、腸道結構發(fā)育和功能的差異、相關候選基因表達的差異以及基因表達與各抗應激生化指標的相關性，旨在找出安徽地方優(yōu)良品種安慶六白豬候選基因與腸道發(fā)育的內在聯(lián)系，篩選影響仔豬抗斷奶應激能力及腸道發(fā)育的相關候選基因，為今后品種選育和新品系的建立提供參考。

1.本發(fā)明提供一種比較斷奶仔豬血清GA、Cor含量以及小腸絨毛高度差異的標記引物，該引物對包括GLS、EGFR、IGF-1、IGF-1R；其中，

引物對GLS，正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；

引物對EGFR，正向引物序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物序列如SEQ ID NO.4所示；

引物對IGF-1，正向引物序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物序列如SEQ ID NO.6所示；

引物對IGF-1R，正向引物序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物序列如SEQ ID NO.8所示；

2.本發(fā)明還提供一種比較斷奶仔豬血清GA、Cor含量以及小腸絨毛高度差異的方法，該方法分別以與血清GA、Cor含量呈正相關的候選基因GLS和EGFR的表達水平比較不同斷奶仔豬個體血清GA、Cor含量差異，與小腸絨毛高度呈正相關的候選基因IGF-1、IGF-R的表達水平比較不同斷奶仔豬個體腸絨毛高度差異。

3.本發(fā)明還提供一種比較斷奶仔豬腸道發(fā)育狀況的方法，該方法以與斷奶仔豬腸道生長發(fā)育相關聯(lián)的血清GA、Cor含量、仔豬小腸絨毛高度為對象，通過分析與血清GA、Cor含量呈正相關的候選基因GLS和EGFR的表達水平，與小腸絨毛高度呈正相關的候選基因IGF-1、IGF-R的表達水平，判定斷奶仔豬腸道發(fā)育狀況，標記基因表達水平高的斷奶仔豬比標記基因表達水平低的斷奶仔豬腸道發(fā)育更良好。

4.上述3提供的比較斷奶仔豬腸道發(fā)育狀況的方法，具體包括如下步驟：(1)斷奶仔豬小腸總RNA提?。?2)引物設計：分別設計候選基因GLS的反轉錄引物對GLS、候選基因EGFR的反轉錄引物對EGFR、候選基因IGF-1的反轉錄引物對IGF-1、候選基因IGF-1R的反轉錄引物對IGF-1R；(3)反轉錄合成cDNA：使用反轉錄試劑盒以步驟(1)得到的總RNA進行反轉錄合成cDNA；(4)采用步驟(2)通過q-RT-PCR方法測定候選基因GLS、EGFR、IGF-1、IGF-1R在斷奶仔豬個體小腸中的表達量；(5)根據各候選基因在不同斷奶仔豬個體的表達量的差異確定不同斷奶仔豬腸道發(fā)育狀況；

其中，引物對GLS，正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；

引物對EGFR，正向引物序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物序列如SEQ ID NO.4所示；

引物對IGF-1，正向引物序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物序列如SEQ ID NO.6所示；

引物對IGF-1R，正向引物序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物序列如SEQ ID NO.8所示。

5.上述4提供的比較斷奶仔豬腸道發(fā)育狀況的方法，其中，步驟(4)所述q-RT-PCR方法具體包括如下步驟：

(1)標準品制備及條件優(yōu)化：每個待測RNA的反轉錄產物取等量混合，將cDNA混合樣按梯度稀釋，用RT-PCR的反應體系，對每個目的基因作標準曲線來優(yōu)化整個反應條件；

(2)q-RT-PCR標準曲線的建立和擴增曲線：采用RT-PCR方法作目的基因GLS、EGFR、IGF-1、IGF-1R的標準曲線，得到各個目的基因及內參β-Actin基因的標準曲線，對結果相關數據進行分析，當標準曲線的相關系數及擴增效率均等于或接近于1.000時，表明實驗數據誤差較小，可信度較高，實驗所得的Ct值可準確地測定起始cDNA的拷貝數；目的基因和看家基因標準曲線的斜率小于0.1，表明兩個基因的標準曲線的斜率基本一致，在后續(xù)實驗中可以使用分析Comparative Delta-delta Ct法進行相對定量分析；

(3)相關候選基因的q-RT-PCR反應：采用RT-PCR法檢測豬GLS、EGFR、IGF-1、IGF-1R、FUT1、LYZ、TAP1、SLA-DQB、TLR4基因及內參基因β-Actin在斷奶仔豬小腸各段的表達量；

(4)數據分析：目的基因mRNA表達豐度采用2^-ΔΔCT法對有效數據進行統(tǒng)計分析，計算出每個樣本目的基因的相對表達水平，通過內參基因β-Actin校正；

其中，內參基因β-Actin的擴增引物對β-antin上游序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物序列如SEQ ID NO.10所示。

6.上述5提供的比較斷奶仔豬腸道發(fā)育狀況的方法，其中，步驟(4)q-RT-PCR反應體系為20μL，包括：SYBR綠色熒光染料10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，cDNA1μL，超純水7μL；反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性10s，退火溫度下退火30s，40個循環(huán)，于65℃5s至95℃5s時搜集熒光值；其中，引物對GLS的退火溫度為58.8℃；引物對EGFR的退火溫度為60℃；引物對IGF-1和IGF-1R的退火溫度為61℃。

7.上述4提供的比較斷奶仔豬腸道發(fā)育狀況的方法，其中，步驟(3)反轉錄合成cDNA具體包括如下步驟：(1)基因組DNA除去反應：體系包括：5×gDNA Eraser緩沖液2μL，gDNA Eraser1μL，總RNA1μg，加超純水至10μL；反應條件為：42℃反應2min，4℃保存，得反應液I；(2)反轉錄反應：體系包括：反應液I 10μL，5×PrimeBuffer2 4.0μL，PrimeRT酶混合液I 1.0μL，RT Primer Mix 1.0μL，加超純水至20μL；反應條件為：使用普通PCR儀設置程序37℃反應15min，85℃反應5s，4℃保存，得反轉錄樣品cDNA，檢測后置于-20℃條件下備用。

8.上述3-7任一項提供的比較斷奶仔豬腸道發(fā)育狀況的方法，其中，所述斷奶仔豬品種為安徽地方品種安慶六白豬。

9.上述3-7任一項提供的方法在斷奶仔豬抗應激生理反應能力比較中的應用，其中，該方法比較GLS、EGFR和IGF-1、IGF-R的表達水平，基因表達水平越高，說明與基因表達正相關的GA、Cor和仔豬小腸絨毛高度水平越高，仔豬斷奶抗應激能力越強。

10.上述9提供的方法在斷奶仔豬抗應激生理反應能力比較中的應用，其中，所述斷奶仔豬品種為安徽地方品種安慶六白豬

本申請?zhí)峁┑摹氨容^”概念是斷奶仔豬個體間的比較，“高低”、“強弱”均是指個體間的比較，根據GLS、EGFR和IGF-1、IGF-R的表達水平，確定不同個體間生化指標血清GA、Cor含量的高低以及小腸絨毛高度的大小，從而比較斷奶仔豬不同個體間腸道發(fā)育以及抗應激生理反應能力大小。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

1.本申請獲得了斷奶仔豬尤其是安徽地方品種安慶六白豬斷奶仔豬腸道發(fā)育與候選基因表達差異之間的關系，填補了現有技術的空白，由此得出斷奶仔豬抗應激生理反應能力與候選基因表達差異之間的關系，為今后品種選育和新品系的建立提供參考。

2.本發(fā)明以仔豬抗應激生化指標血清GA、Cor含量以及小腸絨毛高度為參照，在大量基因中尋找到與血清GA、Cor含量以及小腸絨毛高度成正相關的候選基因，從而根據候選基因表達情況可以快速獲得斷奶仔豬尤其是安徽地方品種安慶六白豬斷奶仔豬的腸道發(fā)育以及對斷奶抗應激能力的高低，減少選育過程中的復雜性，避免斷奶仔豬因為受到刺激等因素導致生化指標急劇變化而與實際不符，保證了結果的準確性。

附圖說明

圖1部分RNA電泳圖

圖2部分cDNA電泳圖；其中，β-Actin條帶114bp

圖3 GLS基因RT-PCR曲線；其中，A圖為標準曲線；B圖為擴增曲線；C圖為溶解曲線

圖4 IGF-1基因RT-PCR曲線；其中，A圖為標準曲線；B圖為擴增曲線；C圖為溶解曲線

圖5 IGF-1R基因RT-PCR曲線；其中，A圖為標準曲線；B圖為擴增曲線；C圖為溶解曲線

圖6 EGFR基因RT-PCR曲線；其中，A圖為標準曲線；B圖為擴增曲線；C圖為溶解曲線

圖7 33日齡和39日齡安慶六白豬和長白豬各腸段黏膜GLS基因表達情況

圖8 33日齡和39日齡安慶六白豬和長白豬各腸段黏膜IGF-1基因表達情況

圖9 33日齡和39日齡安慶六白豬和長白豬各腸段黏膜IGF-1R基因表達情況

圖10 33日齡和39日齡安慶六白豬和長白豬各腸段黏膜EGFR基因表達情況

其中，圖7-10中Δ表示不同品種同一日齡仔豬同一腸段差異顯著(P＜0.05)，ΔΔ表示不同品種同一日齡仔豬同一腸段差異極顯著(P＜0.01)；*表示同一品種不同日齡仔豬同一腸段差異顯著(P＜0.05)，**表示同一品種不同日齡仔豬同一腸段差異極顯著(P＜0.01)；不同小寫字母表示單一品種單一日齡仔豬各腸段間差異顯著(P＜0.05)，不同大寫字母表示單一

品種單一日齡仔豬各腸段間差異極顯著(P＜0.01)。A：安慶六白豬，L：長白豬。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明進行具體闡述。

實施例1：

一、試驗方法

1.1試驗動物及樣品采集

從安徽農業(yè)大學試驗基地選擇健康狀態(tài)良好的長白豬和安慶六白豬28日齡斷奶仔豬各20頭，分別于33日齡、39日齡各取10頭屠宰。前腔靜脈采血，制備血清，置-20℃冰箱保存，用于血清生化指標檢測。取小腸十二指腸、空腸、回腸各腸段8cm，迅速放入備有4％多聚甲醛的固定液中，待做組織切片；另從小腸各段截取8cm，用1％PBS溶液將腸段徹底沖洗干凈，刮取腸黏膜無菌的凍存管中，并迅速放入液氮中保存，樣品放入-80℃條件下保存至使用；另從小腸各段截取8cm，用1％PBS溶液將腸段徹底沖洗干凈，并迅速放入液氮中保存，樣品放入-80℃條件下保存至使用，待做熒光定量檢測。

試驗所需儀器和試劑如果沒有特別說明，均屬于本領域普通技術人員通過市場可以購買獲得的。

1.2血清指標測定

從仔豬前腔靜脈采血，4度冰箱靜置一夜后，3000r/min離心15min分離制備血清。采用武漢新啟迪公司的相應ELISA試劑盒，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法測定血清GH、GA、Cor、CD3、CD4、T4、T3。

1.3腸黏膜二糖酶、ATP酶活性含量測定

取0.2g各腸段黏膜放于1mL 1％的PBS緩沖液中研磨，制備勻漿液。采用南京建成公司的相應試劑盒測定乳糖酶、麥芽糖酶、蔗糖酶、ATP酶活性，方法和操作按說明書進行，檢測每毫克蛋白質中的二糖酶及ATP酶活力。

1.4切片制作及觀察

1.4.1切片制作

小腸各段固定16小時到24小時后，取出組織，經水洗、透明、浸蠟、包埋等處理后，制備連續(xù)橫斷切片，厚度為5μm，每隔10張切片取1張切片。

1.4.2HE染色

取5張切片，切片脫蠟、蘇木精-伊紅、分色、脫水、透明、封片。每張切片觀察5個典型視野，用目鏡測量測微尺測量5根最長的絨毛長度(以腸腺絨毛連接處到絨毛頂端為準，最深的隱窩深度(以腸腺絨毛連接處到腸腺基部為準)。每項指標均測定25組數據。

1.5實時熒光定量RT-PCR測定各個基因的表達水平

1.5.1十二指腸、空腸、回腸中總RNA提取

按Total RNA Kit II(50)(Omega)說明書提取總RNA，步驟如下：

(1)1.5mL無RNA酶離心管中加入1mL RNA-SOW Reagent裂解液，取約100mg的十二指腸組織(-80℃冰箱保存)于研缽中，邊加液氮邊研磨至粉末狀，迅速轉入含裂解液的1.5mL無RNA酶離心管中，充分震蕩搖勻于室溫下靜置2～3min。

(2)靜置后向里加入0.2mL氯仿，搖勻，劇烈振蕩15-20s，隨后放在冰上孵化10min。

(3)4℃，12000rmp離心15min后，混合物分離成3層，中間層和上層為水相RNA保存在上層水相中，下層為苯酚-氯仿相。

(4)將80％的水相轉入新的EP管中，并向里加入三分之一體積的無水乙醇，最大速度漩渦震蕩15s，接下來的步驟的離心操作均在室溫條件下進行。

(5)將離心柱置于2mL收集管中，將步驟5中的液體轉入離心柱中，10000rmp離心30～60s，棄流出液。

(6)將離心柱放入新的2mL收集管中，并加入300μl RNA Wash Buffer I，10000rmp離心30～60s，棄流出液。

(7)向離心柱中加入400μL RNA Wash Buffer II，10000rmp離心30～60s，棄流出液。

(8)將離心柱放入新的2mL收集管中，向里加入500μLRNA Wash Buffer II，10000rmp離心30～60s，棄流出液。

(9)重復步驟8，13000rmp離心2min，丟掉流出液，超凈臺內干燥離心柱5min。

(10)洗脫RNA，將離心柱轉入1.5mL無RNA酶離心管中，向離心柱中加入300μLDEPC水，室溫孵化2min，13000rmp離心1min，棄離心柱，保留流出液，即RNA，置于-80℃冰箱中保存?？漳c、回腸中的總RNA提取同上述方法。

1.5.2RNA提取質量的檢測

(1)使用紫外分光光度計測定RNA的OD260值、OD280值及濃度。OD260/OD280值在1.8-2.0之間的RNA為合格品。

(2)甲醛變性膠檢測RNA質量。取RNA樣5μL與1μL的5×Loading buffer混勻，置于70℃水浴鍋內加熱10min，后置于冰上驟冷以消除RNA的二級結構。用1.2％甲醛變性凝膠電泳檢測RNA質量，電壓為100v。凝膠成像系統(tǒng)下觀察條帶，通?？梢钥吹?條帶，一般為28s、18s、5s，其中28s、18s較亮，5s較暗，且28s的亮度是18s的兩倍的RNA質量比較好(見圖1)，留下符合要求的RNA樣。

(3)選擇符合上述兩個條件的RNA樣稀釋至1μg/μL分裝于無RNA酶離心管內，于-80℃條件下保存以供反轉錄。

1.5.3組織提取的總RNA質量檢測結果

提取安慶六白豬和長白豬十二指腸、空腸及回腸中的RNA并用甲醛變性膠進行電泳檢測，電泳圖中的18S、5S及28S三條條帶清晰可見。因此，總RNA的質量符合實驗要求，可進行反轉錄合成cDNA(圖1)。

1.5.4引物設計與合成

根據GenBank中豬GLS、EGFR、IGF-1、IGF-1R的序列，設計引物序列，引物由上海生工生物公司合成。引物序列和PCR參數如表1所示。

表1.用于Real-time quantitative PCR的引物序列及PCR參數

1.5.5反轉錄合成cDNA

使用反轉錄試劑盒PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TAKARA)，反應體系及反應條件如下，見表2、3。

表2.反轉錄第一步基因組DNA除去反應

反應條件：使用普通PCR儀設置程序42℃反應2min，4℃保存，得反應液I。

表3.反轉錄反應

反應條件：使用普通PCR儀設置程序37℃反應15min，85℃反應5s，4℃保存。得反轉錄樣品cDNA，檢測后置于-20℃條件下備用。

1.5.6cDNA純度檢測

反應體系及反應條件如下，反應完成后取6μL PCR產物在1％瓊脂糖凝膠上以120V電壓電泳15min，凝膠成像系統(tǒng)下觀察條帶以鑒定cDNA純度(β-Actin為例)。

表4.常規(guī)PCR反應

1.5.7cDNA純度鑒定結果

將提取的總RNA按照相關反轉錄試劑盒說明合成cDNA。按照常規(guī)PCR反應體系添加反應物，引物為β-Actin基因，質粒為cDNA。采用瓊脂糖凝膠電泳實驗檢測擴增的產物，在電泳圖上可看到樣品得到很好的β-Actin電泳條帶。從電泳圖片結果看，PCR擴增的產物條帶清晰，且無雜帶，說明該引物可特異性地擴增出目的產物。

1.5.8q-RT-PCR

(1)標準品制備及條件優(yōu)化

每個待測RNA的反轉錄產物取等量混合，將cDNA混合樣按梯度稀釋，用RT-PCR的反應體系，對每個目的基因作標準曲線來優(yōu)化整個反應條件。用標準曲線驗證目的基因和內參基因的引物有效性、最佳退火溫度、使用濃度及RT-PCR反應中的試劑，以評估每個目的基因和內參基因RT-PCR反應的最佳條件。RT-PCR反應體系及條件如下(表5)，每個樣品重復3次，并設陰性對照。

(2)q-RT-PCR標準曲線的建立和擴增曲線

采用q-RT-PCR方法作目的基因GLS、EGFR、IGF-1、IGF-1R的標準曲線，得到各個目的基因及β-Actin基因的標準曲線，對結果相關數據進行分析，當標準曲線的相關系數及擴增效率均等于或接近于1.000時，表明實驗數據誤差較小，可信度較高，實驗所得的Ct值可準確地測定起始cDNA的拷貝數。目的基因和看家基因標準曲線的斜率小于0.1，表明兩個基因的標準曲線的斜率基本一致，在后續(xù)實驗中可以使用分析Comparative Delta-delta Ct法進行相對定量分析。根據熔解曲線確認擴增產物的特異性需要，當熔解曲線的特異性擴增產物只有一個峰值，且無非特異性峰存在，說明引物的特異性良好，可以在后續(xù)實驗中使用。根據上述要求進行試驗，從而得到所有樣品擴增曲線，見圖3-6。

(3)相關候選基因的q-RT-PCR反應

采用RT-PCR法檢測豬GLS、EGFR、IGF-1、IGF-1R基因及內參基因β-Actin在斷奶仔豬小腸各段的表達量。反應體系及反應條件如下(表5)，反應體系為20μL?；虮磉_量分析：目的基因mRNA表達豐度采用2^-ΔΔCT法對有效數據進行統(tǒng)計分析，計算出每個樣本目的基因的相對表達水平，通過內參基因β-Actin校正。

表5.q-RT-PCR反應體系及反應條件

1.6數據分析

試驗數據用平均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS20.0軟件對結果中的數據進行分析，品種間同一日齡的均值差異、品種內不同日齡的均值差異、品種內種不同日齡同一腸段的均值差異均采用獨立樣本T檢驗統(tǒng)計分析，單一品種單一日齡小腸各段的均值差異采用One-Way ANOVA統(tǒng)計分析，顯著性差異水平為P＜0.05，極顯著性差異水平為P＜0.01。采用SPSS20.0軟件Bivariate correlation程序進行數據相關性分析。

(二)數據分析

2.1小腸黏膜GLS、IGF-1、IGF-1R、EGFRmRNA的相對表達水平

2.1.1GLS mRNA的相對表達水平

33日齡時，安慶六白豬空腸GLS mRNA表達水平顯著高于長白豬(P＜0.05)，十二指腸和回腸GLS mRNA表達水平與長白豬差異不顯著。39日齡時，安慶六白豬小腸各段GLS mRNA表達水平與長白豬差異不顯著。同一豬種39日齡小腸各段GLS mRNA表達水平與33日齡比較發(fā)現，安慶六白豬十二指腸和回腸GLS mRNA表達水平均顯著提高了(P＜0.05)；長白豬十二指腸和回腸GLS mRNA表達水平均極顯著提高了(P＜0.01)，空腸GLS mRNA表達水平顯著提高(P＜0.05)。

33日齡和39日齡時，長白豬和安慶六白豬小腸各段GLS mRNA的表達水平依次均是空腸最高，十二指腸次之，回腸最低。33日齡時，安慶六白豬空腸GLS mRNA的表達水平極顯著高于十二指腸和回腸(P＜0.01)，而十二指腸和回腸之間無顯著差異；長白豬空腸GLS mRNA的表達水平顯著高于回腸(P＜0.05)，空腸及回腸與十二指腸無顯著差異。39日齡時，安慶六白豬空腸GLS mRNA的表達水平極顯著高于十二指腸(P＜0.01)，顯著高于回腸(P＜0.05)，而十二指腸和回腸之間無顯著差異；長白豬小腸各段GLS mRNA的表達水平無顯著差異(見圖4)。

2.1.2IGF-1mRNA的相對表達水平

33日齡時，長白豬十二指腸、空腸IGF-1mRNA表達水平極顯著、顯著高于安慶六白豬(P＜0.01，P＜0.05)，回腸IGF-1mRNA表達水平與安慶六白豬差異不顯著。39日齡時，安慶六白豬小腸各段IGF-1mRNA表達水平與長白豬差異不顯著。同一豬種39日齡小腸各段IGF-1mRNA表達水平與33日齡比較發(fā)現，安慶六白豬十二指腸IGF-1mRNA表達水平極顯著提高了(P＜0.05)，空腸與回腸IGF-1mRNA表達水平趨勢是升高了；長白豬小腸各段IGF-1mRNA表達水平變化不顯著。

33日齡和39日齡時，兩豬種小腸各段IGF-1 mRNA的表達水平依次均是空腸最高，十二指腸次之，回腸最低。33日齡時，安慶六白豬空腸IGF-1 mRNA的表達水平極顯著高于十二指腸和回腸(P＜0.01)，十二指腸IGF-1 mRNA的表達水平顯著高于回腸(P＜0.05)；長白豬十二指腸及空腸IGF-1mRNA的表達水平均極顯著高于(P＜0.01)，空腸與十二指腸無顯著差異。39日齡時，安慶六白豬和長白豬小腸各段IGF-1 mRNA的表達水平均無顯著差異(見圖5)。

2.1.3IGF-1R mRNA的相對表達水平

33日齡和39日齡時，長白豬小腸各段IGF-1R mRNA表達水平均表現出高于安慶六白豬的趨勢，品種之間無顯著差異。同一豬種39日齡斷奶仔豬小腸各段IGF-1R mRNA表達水平與33日齡斷奶仔豬比較發(fā)現，兩豬種小腸各段IGF-1R mRNA表達水平均有所提高，變化不明顯。

33日齡和39日齡時，兩豬種小腸各段IGF-1R mRNA的表達水平依次均是空腸最高，十二指腸次之，回腸最低。33日齡時，安慶六白豬空腸IGF-1R mRNA的表達水平極顯著高于回腸(P＜0.01)，十二指腸與空腸及回腸無顯著差異；39日齡時，安慶六白豬小腸各段IGF-1R mRNA的表達水平差異不顯著。33日齡和39日齡時，長白豬空腸IGF-1R mRNA的表達水平顯著高于回腸(P＜0.05)，十二指腸與空腸及回腸無顯著差異(見圖6)。

2.1.4EGFR mRNA的相對表達水平

33日齡時，安慶六白豬十二指腸和空腸EGFR mRNA表達水平均顯著高于長白豬(P＜0.05)，回腸EGFR mRNA表達水平與長白豬差異不顯著。39日齡時，安慶六白豬小腸各段EGFR mRNA表達水平與長白豬差異不顯著。同一豬種39日齡小腸各段EGFR mRNA表達水平與33日比較發(fā)現，安慶六白豬小腸各段EGFR mRNA表達水平變化不顯著；長白豬十二指腸和空腸EGFR mRNA表達水平有所提高，回腸EGFR mRNA表達水平有所下降，變化均不顯著。

33日齡和39日齡時，長白豬和安慶六白豬小腸各段EGFR mRNA的表達水平依次均是空腸最高，十二指腸次之，回腸最低。33日齡時，安慶六白豬回腸EGFR mRNA的表達水平極顯著低于空腸(P＜0.01)，顯著低于于十二指腸(P＜0.05)，十二指腸與空腸差異不顯著，39日齡時，安慶六白豬十二指腸及空腸EGFR mRNA的表達水平顯著高于回腸(P＜0.05)，而十二指腸和空腸之間無顯著差異；33日齡和39日齡時，長白豬空腸EGFR mRNA的表達水平顯著高于回腸(P＜0.05)，空腸及十二指腸與回腸無顯著差異(見圖7)。

2.2相關性分析結果

2.2.1小腸GLS及EGFR基因表達量與血清GA及Cor含量的相關性分析

GLS基因在33日齡和39日齡安慶六白豬空腸段表達量與血清GA含量顯著正相關(P＜0.05)，在39日齡長白豬十二指腸段表達量與血清GA含量顯著正相關(P＜0.05)。EGFR基因在33日齡安慶六白豬十二指腸段表達量與血清GA含量顯著正相關(P＜0.05)(見表6)。

表6.GLS和EGFR mRNA表達量與血清GA含量的相關性

注：**表示極顯著相關，*表示顯著相關(表12、13、17、18同)

GLS基因在33日齡安慶六白豬十二指腸段及長白豬空腸段表達量與血清Cor含量均顯著正相關(P＜0.05)。EGFR基因在33日齡兩豬種空腸段及39日齡安慶六白豬十二指段表達量與血清Cor含量均顯著正相關(P＜0.05)(見表7)。

表7.GLS和EGFR mRNA表達量與血清Cor含量的相關性

2.2.2小腸IGF-1及IGF-1R基因表達量與小腸絨毛高度的相關性分析

33日齡安慶六白豬空腸段和長白豬十二指腸段IGF-1基因表達量與腸絨毛高度顯著正相關(P＜0.05)，39日齡安慶六白豬十二指腸IGF-1、IGF-1R基因表達量與腸絨毛高度顯著正相關(P＜0.05)。

表8.IGF-1和IGF-1R基因表達量與小腸絨毛高度的相關性

2.3結論

小腸生長發(fā)育相關基因GLS及EGFR基因在小腸各段的表達與仔豬抗應激生化指標GA、Cor達高度正相關；IGF-1及IGF-1R基因在小腸各段的表達與小腸絨毛高度顯著正相關。在不同斷奶仔豬個體間，GLS及EGFR基因表達水平高低可以用來比較血清GA、Cor含量的多少，IGF-1及IGF-1R基因表達水平可以用來比較小腸絨毛高度差異，從而推測出斷奶仔豬小腸生長發(fā)育以及抗斷奶應激生理反應的能力。

可以知道，上述實施例僅為了說明發(fā)明原理而采用的示例性實施方式，然而本發(fā)明不僅限于此，本領域技術人員在不脫離本發(fā)明實質情況下，可以做出各種改進和變更，這些改進和變更也屬于本發(fā)明的保護范圍。

<110>安徽農業(yè)大學

<120>一種比較斷奶仔豬抗應激生理反應能力的標記引物和方法

<160>10

<210>1

<211>19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>上游引物序列GLS -F

<400>1

AGGGCAGTTT GCTTTCCAT 19

<210>2

<211>20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>下游引物序列GLS-R

<400>2

CTTGTCCAGA GGAGGAGACC 20

<210>3

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>上游引物序列EGFR -F

<400>3

GGCCTCCATG CTTTTGAGAA 20

<210>4

<211>19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>下游引物序列EGFR -R

<400>4

GACGCTATGT CCAGGCCAA 19

<210>5

<211>19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>上游引物序列IGF-1 -F

<400>5

CCTCAAGCCT GCCAAGTCG 19

<210>6

<211>19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>下游引物序列IGF-1 -R

<400>6

GGTAACTCGT GCAGAGCAAA GG 22

<210>7

<211>22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>上游引物序列IGF-1R -F

<400>7

CCACCCAACA CCTACCGCTT CG 22

<210>8

<211>22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>下游引物序列IGF-1R -R

<400>8

GCACTCGCCA TCATGGATCA CA 22

<210>9

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>下游引物序列β-antin -F

<400>9

CTCGATCATG AAGTGCGACG 20

<210>10

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>下游引物序列β-antin -R

<400>10

GTGATCTCCT TCTGCATCCT GTC 23