本發(fā)明涉及分子育種技術領域，具體為一種亞麻高纖維素含量分子標記制備及應用。

背景技術：

分子育種是將分子生物學技術應用于育種中，在分子水平上進行育種，通常包括：分子標記輔助育種和遺傳修飾育種，分子標記輔助育種是利用分子標記與決定目標性狀基因緊密連鎖的特點，通過檢測分子標記，即可檢測到目的基因的存在，達到選擇目標性狀的目的，具有快速、準確、不受環(huán)境條件干擾的優(yōu)點，轉基因育種就是將基因工程應用于育種工作中，通過基因?qū)?，從而培育出一定要求新品種的育種方法，傳統(tǒng)的對于高纖維素含量亞麻幼苗的選育，培育時間較長，選育的品種質(zhì)量不高，同時選育的成本較高，為此，我們提出一種亞麻高纖維素含量分子標記制備及應用。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種亞麻高纖維素含量分子標記制備及應用，以解決上述背景技術中提出傳統(tǒng)的對于高纖維素含量亞麻幼苗的選育，培育時間較長，選育的品種質(zhì)量不高，同時選育的成本較高的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：一種亞麻高纖維素含量分子標記制備，該亞麻高纖維素含量分子標記制備的方法步驟如下：

S1：DNA提?。喝喡橛啄鄹蓛羧~片0.2-0.6g，置于離心管中-70℃保存，將葉片從離心管中取出放入研缽中加入0.5-1ml抽提緩沖液，并用玻璃棒研碎成勻漿，移入離心管中，60℃水浴65-75min，水浴的同時定期輕輕的搖動，取出離心管冷卻至室溫，加入等體積苯酚：氯仿：異戊醇＝(25:24:1)充分混勻時間為15-20min，12000r/min離心15min，小心轉移上清液到另一離心管中，再加入60-75ul的緩沖液和2倍體積無水乙醇，輕輕上下顛倒5-8次至白色沉淀物出現(xiàn)，-20℃放置60min，用槍頭輕輕挑起沉淀DNA，再加入(1-2ml)75％乙醇浸泡清洗沉淀的DNA，輕輕上下顛倒多次后靜置10-15min，倒掉乙醇把含有DNA沉淀的離心管倒置在常溫中晾干，再加入100ul的TE溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

S2：SSR標記的PCR擴增：將提取的DNA測定濃度后稀釋至50ng/ul，作為模板進行PCR擴增，SSR擴增體系為：94℃擴增4min；94℃變性1min，60℃退火30s，72℃延伸45s，10個循環(huán)，每個循環(huán)退火降0.5℃；然后94℃變性1min，55℃退火30s，72℃延伸45s，30個循環(huán)；72℃延伸至10min，最后25℃保存10min；

S3：AFLP標記的PCR擴增：包括總DNA的酶切，接頭制備，連接，預擴增和選擇性擴增；

總DNA的酶切：取總DNA 250ng，5U EcoR I和5U Mse I限制性內(nèi)切酶，最終體積為25ul，先在37℃水浴3h后，轉入65℃水浴1h，最后的酶切產(chǎn)物在-20℃的環(huán)境下保持備用；

接頭制備：EcoR I接頭序列：

左接頭(EF)：5’-CTCGTAGACTGCTACC-3’

右接頭(ER)：3’-CTGACGCATGGTTAA-5’

Mse I接頭序列：

左接頭(MF)：5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’

右接頭(MR)：3’-TACTCAGGACTCAT-5’

先將EcoR I、Mse I的左右接頭稀釋為100umol/L，然后等體積的左右引物混合同一滅菌的離心管中進行復性，復性的PCR程序為：94℃變性1min，70℃退火10min，37℃延伸10min，25℃保存10min，一個循環(huán)，反應后放置在冰上10min，最后在-20℃的環(huán)境下保存?zhèn)溆茫?/p>

連接：將雙切酶產(chǎn)物加入連接混合液中，總體積為50ul,混勻后4℃過夜，連接完畢后用ddH₂O稀釋5倍作為預擴增的模板；

預擴增：在25μl PCR反應體系有，含有50ng EA引物，50ng MC引物，5μl酶切連接產(chǎn)物，0.2mmol/L dNTPs,1U Taq酶，1×PCR緩沖液，20個PCR反應循環(huán)參數(shù)為：94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，反應完成后，取5μl PCR產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠檢測，分子量應在250～750bp之間，呈現(xiàn)彌散狀，剩余產(chǎn)物稀釋30倍，作為下一步PCR擴增的模板，在-20℃環(huán)境下保存?zhèn)溆茫?/p>

預擴增對應的引物序列為：

EA：5’-GACTGCGTACCAATTCA-3’

MC：5’-GATGAGTCCTGAGTAAC-3’

選擇性擴增：在15μl PCR反應體系中2ul預擴增產(chǎn)物，50ng EA引物，50ng MC引物，0.2mmol/L dNTPs,1U Taq酶，1×PCR緩沖液，2mmol/L MgCl₂，PCR第一個循環(huán)參數(shù)為：94℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，共12個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度降0.7℃；然后94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，24個循環(huán)，最后72℃擴增5min，25℃持續(xù)10min；

S4：擴增產(chǎn)物的電泳檢測：包括PAGE膠的制備，電泳分離和銀染顯影；

PAGE膠的制備：用洗滌劑將背板和面板徹底洗凈，先用去離子水淋洗，再用無水乙醇淋洗并晾干，背板上用光滑的濾紙均勻涂抹無水乙醇擦洗2-3次，晾干后再用1ml硅化液均勻涂抹背板晾曬備用，面板的清潔方式與背板的清潔方式相同，將墊片用水沖洗干凈，用吸水紙擦干，放在面板的兩側，將背板道口在面板上，下端對其，兩端放置均勻，夾上夾子，用制膠梳試兩板之間空隙的松緊，調(diào)整夾子的位置從而調(diào)節(jié)松緊，然后用水平儀將套好的板調(diào)至水平，用水把燒杯沖洗干凈，加入約(45-50ml)16％的PAGE膠和40ul TEMED，玻璃棒攪拌均勻，將倒膠口一端調(diào)高，順著膠口均勻的倒入凝膠，在凝膠接近末端時將玻璃板調(diào)平，然后水平插入制膠梳，插入深度約5mm左右，夾上夾子放置40min備用；

電泳分離：將制好的凝膠上的夾子取下，用水將玻璃板沖洗干凈，取下膠口上的膠條，用水將膠口沖洗干凈，將擴增產(chǎn)物放置在膠板的垂直槽上，夾緊夾子，加入1×TBE的緩沖液，上端要淹沒電極，電泳的參數(shù)設置為：U：2000V、I：100mA、P：80W，預電泳30min后，停掉電源，用注射器將點樣槽里的氣泡和雜質(zhì)清除，插入點樣梳，點完樣后按預電泳參數(shù)繼續(xù)電泳，SSR標記待第一條指示劑泳道出膠后即可終止電泳，AFLP標記待第二條指示劑泳道離板底約4cm左右即可終止電泳；

銀染顯影：電泳完畢后，剝離下膠板，將其浸入(1L)10％冰乙酸中，輕輕搖動置指示劑消失為止，然后用去離子水漂洗膠板2-3次，然后放入1L染色液中進行染色，輕微晃動的時間為30-40min，取出膠板，用蒸餾水中迅速漂洗，立即轉入1L預冷的顯影液，輕輕搖動至出現(xiàn)清晰可見的條帶停止顯影，最后用自來水漂洗5min，室溫晾干，拍照保存。

優(yōu)選的，一種亞麻高纖維素含量分子標記應用的方法步驟如下：

S1：田間材料的前景選擇：用基因池篩選得到前景標記對回交組合后代進行前景選擇，分離單株中在前景標記點選擇表現(xiàn)為雜合即表示攜帶了目的性狀的區(qū)段，確定為目的單株；

S2：田間雜交：首先用供體親本和輪回親本進行雜交，在后代個體中選擇具有目的性狀的單株繼續(xù)與輪回親本進行雜交，每次回交都對分離單株進行前景和背景選擇，選擇后挑選目的單株繼續(xù)后續(xù)的回交；

S3：對雜交后的單株進行標記驗證與選取：選取雜交單株后代20-30粒飽滿種子磨碎后倒入試管中，在試管中加入2ml乙醚：石油醚＝(1:1)的混合溶液，然后加入等體積的甲醇進行酯化反應，靜置1小時使其充分反應，最后加入蒸餾水定容至10ml萃取，取上層溶液進行電泳檢測，通過與擴增產(chǎn)物的電泳檢測獲取的影像對比，篩選出含有被標記的亞麻高纖維素含量的親本。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明通過對高亞麻纖維素的DNA進行SSR標記和AFLP標記，有利于選育出具有高纖維素含量的幼苗，通過選育出的幼苗得到高纖維素的種子，方便對幼苗的培育和篩選，加速育苗的培育，縮短育種年限，減少選育成本。

附圖說明

圖1為本發(fā)明制備方法步驟圖；

圖2為本發(fā)明應用方法步驟圖。

具體實施方式

下面將結合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例一

一種亞麻高纖維素含量分子標記制備，該亞麻高纖維素含量分子標記制備的方法步驟如下：

S1：DNA提取：取亞麻幼嫩干凈葉片0.2g，置于離心管中-70℃保存，將葉片從離心管中取出放入研缽中加入0.5ml抽提緩沖液，并用玻璃棒研碎成勻漿，移入離心管中，60℃水浴65min，水浴的同時定期輕輕的搖動，取出離心管冷卻至室溫，加入等體積苯酚：氯仿：異戊醇＝(25:24:1)充分混勻時間為15min，12000r/min離心15min，小心轉移上清液到另一離心管中，再加入60ul的緩沖液和2倍體積無水乙醇，輕輕上下顛倒5-8次至白色沉淀物出現(xiàn)，-20℃放置60min，用槍頭輕輕挑起沉淀DNA，再加入(1ml)75％乙醇浸泡清洗沉淀的DNA，輕輕上下顛倒多次后靜置10min，倒掉乙醇把含有DNA沉淀的離心管倒置在常溫中晾干，再加入100ul的TE溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

S2：SSR標記的PCR擴增：將提取的DNA測定濃度后稀釋至50ng/ul，作為模板進行PCR擴增，SSR擴增體系為：94℃擴增4min；94℃變性1min，60℃退火30s，72℃延伸45s，10個循環(huán)，每個循環(huán)退火降0.5℃；然后94℃變性1min，55℃退火30s，72℃延伸45s，30個循環(huán)；72℃延伸至10min，最后25℃保存10min；

S3：AFLP標記的PCR擴增：包括總DNA的酶切，接頭制備，連接，預擴增和選擇性擴增；

總DNA的酶切：取總DNA 250ng，5U EcoR I和5U Mse I限制性內(nèi)切酶，最終體積為25ul，先在37℃水浴3h后，轉入65℃水浴1h，最后的酶切產(chǎn)物在-20℃的環(huán)境下保持備用；

接頭制備：EcoR I接頭序列：

左接頭(EF)：5’-CTCGTAGACTGCTACC-3’

右接頭(ER)：3’-CTGACGCATGGTTAA-5’

Mse I接頭序列：

左接頭(MF)：5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’

右接頭(MR)：3’-TACTCAGGACTCAT-5’

先將EcoR I、Mse I的左右接頭稀釋為100umol/L，然后等體積的左右引物混合同一滅菌的離心管中進行復性，復性的PCR程序為：94℃變性1min，70℃退火10min，37℃延伸10min，25℃保存10min，一個循環(huán)，反應后放置在冰上10min，最后在-20℃的環(huán)境下保存?zhèn)溆茫?/p>

連接：將雙切酶產(chǎn)物加入連接混合液中，總體積為50ul,混勻后4℃過夜，連接完畢后用ddH₂O稀釋5倍作為預擴增的模板；

預擴增：在25μl PCR反應體系有，含有50ng EA引物，50ng MC引物，5μl酶切連接產(chǎn)物，0.2mmol/L dNTPs,1U Taq酶，1×PCR緩沖液，20個PCR反應循環(huán)參數(shù)為：94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，反應完成后，取5μl PCR產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠檢測，分子量應在250～750bp之間，呈現(xiàn)彌散狀，剩余產(chǎn)物稀釋30倍，作為下一步PCR擴增的模板，在-20℃環(huán)境下保存?zhèn)溆茫?/p>

預擴增對應的引物序列為：

EA：5’-GACTGCGTACCAATTCA-3’

MC：5’-GATGAGTCCTGAGTAAC-3’

選擇性擴增：在15μl PCR反應體系中2ul預擴增產(chǎn)物，50ng EA引物，50ng MC引物，0.2mmol/L dNTPs,1U Taq酶，1×PCR緩沖液，2mmol/L MgCl₂，PCR第一個循環(huán)參數(shù)為：94℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，共12個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度降0.7℃；然后94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，24個循環(huán)，最后72℃擴增5min，25℃持續(xù)10min；

S4：擴增產(chǎn)物的電泳檢測：包括PAGE膠的制備，電泳分離和銀染顯影；

PAGE膠的制備：用洗滌劑將背板和面板徹底洗凈，先用去離子水淋洗，再用無水乙醇淋洗并晾干，背板上用光滑的濾紙均勻涂抹無水乙醇擦洗2-3次，晾干后再用1ml硅化液均勻涂抹背板晾曬備用，面板的清潔方式與背板的清潔方式相同，將墊片用水沖洗干凈，用吸水紙擦干，放在面板的兩側，將背板道口在面板上，下端對其，兩端放置均勻，夾上夾子，用制膠梳試兩板之間空隙的松緊，調(diào)整夾子的位置從而調(diào)節(jié)松緊，然后用水平儀將套好的板調(diào)至水平，用水把燒杯沖洗干凈，加入約(45ml)16％的PAGE膠和40ul TEMED，玻璃棒攪拌均勻，將倒膠口一端調(diào)高，順著膠口均勻的倒入凝膠，在凝膠接近末端時將玻璃板調(diào)平，然后水平插入制膠梳，插入深度約5mm左右，夾上夾子放置40min備用；

電泳分離：將制好的凝膠上的夾子取下，用水將玻璃板沖洗干凈，取下膠口上的膠條，用水將膠口沖洗干凈，將擴增產(chǎn)物放置在膠板的垂直槽上，夾緊夾子，加入1×TBE的緩沖液，上端要淹沒電極，電泳的參數(shù)設置為：U：2000V、I：100mA、P：80W，預電泳30min后，停掉電源，用注射器將點樣槽里的氣泡和雜質(zhì)清除，插入點樣梳，點完樣后按預電泳參數(shù)繼續(xù)電泳，SSR標記待第一條指示劑泳道出膠后即可終止電泳，AFLP標記待第二條指示劑泳道離板底約4cm左右即可終止電泳；

銀染顯影：電泳完畢后，剝離下膠板，將其浸入(1L)10％冰乙酸中，輕輕搖動置指示劑消失為止，然后用去離子水漂洗膠板2次，然后放入1L染色液中進行染色，輕微晃動的時間為30min，取出膠板，用蒸餾水中迅速漂洗，立即轉入1L預冷的顯影液，輕輕搖動至出現(xiàn)清晰可見的條帶停止顯影，最后用自來水漂洗5min，室溫晾干，拍照保存。

本發(fā)明還提供了一種亞麻高纖維素含量分子標記應用的方法步驟如下：

S1：田間材料的前景選擇：用基因池篩選得到前景標記對回交組合后代進行前景選擇，分離單株中在前景標記點選擇表現(xiàn)為雜合即表示攜帶了目的性狀的區(qū)段，確定為目的單株；

S2：田間雜交：首先用供體親本和輪回親本進行雜交，在后代個體中選擇具有目的性狀的單株繼續(xù)與輪回親本進行雜交，每次回交都對分離單株進行前景和背景選擇，選擇后挑選目的單株繼續(xù)后續(xù)的回交；

S3：對雜交后的單株進行標記驗證與選?。哼x取雜交單株后代20粒飽滿種子磨碎后倒入試管中，在試管中加入2ml乙醚：石油醚＝(1:1)的混合溶液，然后加入等體積的甲醇進行酯化反應，靜置1小時使其充分反應，最后加入蒸餾水定容至10ml萃取，取上層溶液進行電泳檢測，通過與擴增產(chǎn)物的電泳檢測獲取的影像對比，篩選出含有被標記的亞麻高纖維素含量的親本。

實施例二

一種亞麻高纖維素含量分子標記制備，該亞麻高纖維素含量分子標記制備的方法步驟如下：

S1：DNA提取：取亞麻幼嫩干凈葉片0.4g，置于離心管中-70℃保存，將葉片從離心管中取出放入研缽中加入0.75ml抽提緩沖液，并用玻璃棒研碎成勻漿，移入離心管中，60℃水浴70min，水浴的同時定期輕輕的搖動，取出離心管冷卻至室溫，加入等體積苯酚：氯仿：異戊醇＝(25:24:1)充分混勻時間為18min，12000r/min離心15min，小心轉移上清液到另一離心管中，再加入70ul的緩沖液和2倍體積無水乙醇，輕輕上下顛倒5-8次至白色沉淀物出現(xiàn)，-20℃放置60min，用槍頭輕輕挑起沉淀DNA，再加入(1.5ml)75％乙醇浸泡清洗沉淀的DNA，輕輕上下顛倒多次后靜置13min，倒掉乙醇把含有DNA沉淀的離心管倒置在常溫中晾干，再加入100ul的TE溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

S2：SSR標記的PCR擴增：將提取的DNA測定濃度后稀釋至50ng/ul，作為模板進行PCR擴增，SSR擴增體系為：94℃擴增4min；94℃變性1min，60℃退火30s，72℃延伸45s，10個循環(huán)，每個循環(huán)退火降0.5℃；然后94℃變性1min，55℃退火30s，72℃延伸45s，30個循環(huán)；72℃延伸至10min，最后25℃保存10min；

S3：AFLP標記的PCR擴增：包括總DNA的酶切，接頭制備，連接，預擴增和選擇性擴增；

總DNA的酶切：取總DNA 250ng，5U EcoR I和5U Mse I限制性內(nèi)切酶，最終體積為25ul，先在37℃水浴3h后，轉入65℃水浴1h，最后的酶切產(chǎn)物在-20℃的環(huán)境下保持備用；

接頭制備：EcoR I接頭序列：

左接頭(EF)：5’-CTCGTAGACTGCTACC-3’

右接頭(ER)：3’-CTGACGCATGGTTAA-5’

Mse I接頭序列：

左接頭(MF)：5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’

右接頭(MR)：3’-TACTCAGGACTCAT-5’

先將EcoR I、Mse I的左右接頭稀釋為100umol/L，然后等體積的左右引物混合同一滅菌的離心管中進行復性，復性的PCR程序為：94℃變性1min，70℃退火10min，37℃延伸10min，25℃保存10min，一個循環(huán)，反應后放置在冰上10min，最后在-20℃的環(huán)境下保存?zhèn)溆茫?/p>

連接：將雙切酶產(chǎn)物加入連接混合液中，總體積為50ul,混勻后4℃過夜，連接完畢后用ddH₂O稀釋5倍作為預擴增的模板；

預擴增：在25μl PCR反應體系有，含有50ng EA引物，50ng MC引物，5μl酶切連接產(chǎn)物，0.2mmol/L dNTPs,1U Taq酶，1×PCR緩沖液，20個PCR反應循環(huán)參數(shù)為：94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，反應完成后，取5μl PCR產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠檢測，分子量應在250～750bp之間，呈現(xiàn)彌散狀，剩余產(chǎn)物稀釋30倍，作為下一步PCR擴增的模板，在-20℃環(huán)境下保存?zhèn)溆茫?/p>

預擴增對應的引物序列為：

EA：5’-GACTGCGTACCAATTCA-3’

MC：5’-GATGAGTCCTGAGTAAC-3’

選擇性擴增：在15μl PCR反應體系中2ul預擴增產(chǎn)物，50ng EA引物，50ng MC引物，0.2mmol/L dNTPs,1U Taq酶，1×PCR緩沖液，2mmol/L MgCl₂，PCR第一個循環(huán)參數(shù)為：94℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，共12個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度降0.7℃；然后94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，24個循環(huán)，最后72℃擴增5min，25℃持續(xù)10min；

S4：擴增產(chǎn)物的電泳檢測：包括PAGE膠的制備，電泳分離和銀染顯影；

PAGE膠的制備：用洗滌劑將背板和面板徹底洗凈，先用去離子水淋洗，再用無水乙醇淋洗并晾干，背板上用光滑的濾紙均勻涂抹無水乙醇擦洗2-3次，晾干后再用1ml硅化液均勻涂抹背板晾曬備用，面板的清潔方式與背板的清潔方式相同，將墊片用水沖洗干凈，用吸水紙擦干，放在面板的兩側，將背板道口在面板上，下端對其，兩端放置均勻，夾上夾子，用制膠梳試兩板之間空隙的松緊，調(diào)整夾子的位置從而調(diào)節(jié)松緊，然后用水平儀將套好的板調(diào)至水平，用水把燒杯沖洗干凈，加入約(48ml)16％的PAGE膠和40ul TEMED，玻璃棒攪拌均勻，將倒膠口一端調(diào)高，順著膠口均勻的倒入凝膠，在凝膠接近末端時將玻璃板調(diào)平，然后水平插入制膠梳，插入深度約5mm左右，夾上夾子放置40min備用；

電泳分離：將制好的凝膠上的夾子取下，用水將玻璃板沖洗干凈，取下膠口上的膠條，用水將膠口沖洗干凈，將擴增產(chǎn)物放置在膠板的垂直槽上，夾緊夾子，加入1×TBE的緩沖液，上端要淹沒電極，電泳的參數(shù)設置為：U：2000V、I：100mA、P：80W，預電泳30min后，停掉電源，用注射器將點樣槽里的氣泡和雜質(zhì)清除，插入點樣梳，點完樣后按預電泳參數(shù)繼續(xù)電泳，SSR標記待第一條指示劑泳道出膠后即可終止電泳，AFLP標記待第二條指示劑泳道離板底約4cm左右即可終止電泳；

銀染顯影：電泳完畢后，剝離下膠板，將其浸入(1L)10％冰乙酸中，輕輕搖動置指示劑消失為止，然后用去離子水漂洗膠板3次，然后放入1L染色液中進行染色，輕微晃動的時間為35min，取出膠板，用蒸餾水中迅速漂洗，立即轉入1L預冷的顯影液，輕輕搖動至出現(xiàn)清晰可見的條帶停止顯影，最后用自來水漂洗5min，室溫晾干，拍照保存。

本發(fā)明還提供了一種亞麻高纖維素含量分子標記應用的方法步驟如下：

S1：田間材料的前景選擇：用基因池篩選得到前景標記對回交組合后代進行前景選擇，分離單株中在前景標記點選擇表現(xiàn)為雜合即表示攜帶了目的性狀的區(qū)段，確定為目的單株；

S2：田間雜交：首先用供體親本和輪回親本進行雜交，在后代個體中選擇具有目的性狀的單株繼續(xù)與輪回親本進行雜交，每次回交都對分離單株進行前景和背景選擇，選擇后挑選目的單株繼續(xù)后續(xù)的回交；

S3：對雜交后的單株進行標記驗證與選取：選取雜交單株后代25粒飽滿種子磨碎后倒入試管中，在試管中加入2ml乙醚：石油醚＝(1:1)的混合溶液，然后加入等體積的甲醇進行酯化反應，靜置1小時使其充分反應，最后加入蒸餾水定容至10ml萃取，取上層溶液進行電泳檢測，通過與擴增產(chǎn)物的電泳檢測獲取的影像對比，篩選出含有被標記的亞麻高纖維素含量的親本。

實施例三

一種亞麻高纖維素含量分子標記制備，該亞麻高纖維素含量分子標記制備的方法步驟如下：

S1：DNA提?。喝喡橛啄鄹蓛羧~片0.6g，置于離心管中-70℃保存，將葉片從離心管中取出放入研缽中加入1ml抽提緩沖液，并用玻璃棒研碎成勻漿，移入離心管中，60℃水浴75min，水浴的同時定期輕輕的搖動，取出離心管冷卻至室溫，加入等體積苯酚：氯仿：異戊醇＝(25:24:1)充分混勻時間為15-20min，12000r/min離心15min，小心轉移上清液到另一離心管中，再加入75ul的緩沖液和2倍體積無水乙醇，輕輕上下顛倒5-8次至白色沉淀物出現(xiàn)，-20℃放置60min，用槍頭輕輕挑起沉淀DNA，再加入(2ml)75％乙醇浸泡清洗沉淀的DNA，輕輕上下顛倒多次后靜置15min，倒掉乙醇把含有DNA沉淀的離心管倒置在常溫中晾干，再加入100ul的TE溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

S2：SSR標記的PCR擴增：將提取的DNA測定濃度后稀釋至50ng/ul，作為模板進行PCR擴增，SSR擴增體系為：94℃擴增4min；94℃變性1min，60℃退火30s，72℃延伸45s，10個循環(huán)，每個循環(huán)退火降0.5℃；然后94℃變性1min，55℃退火30s，72℃延伸45s，30個循環(huán)；72℃延伸至10min，最后25℃保存10min；

S3：AFLP標記的PCR擴增：包括總DNA的酶切，接頭制備，連接，預擴增和選擇性擴增；

總DNA的酶切：取總DNA 250ng，5U EcoR I和5U Mse I限制性內(nèi)切酶，最終體積為25ul，先在37℃水浴3h后，轉入65℃水浴1h，最后的酶切產(chǎn)物在-20℃的環(huán)境下保持備用；

接頭制備：EcoR I接頭序列：

左接頭(EF)：5’-CTCGTAGACTGCTACC-3’

右接頭(ER)：3’-CTGACGCATGGTTAA-5’

Mse I接頭序列：

左接頭(MF)：5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’

右接頭(MR)：3’-TACTCAGGACTCAT-5’

先將EcoR I、Mse I的左右接頭稀釋為100umol/L，然后等體積的左右引物混合同一滅菌的離心管中進行復性，復性的PCR程序為：94℃變性1min，70℃退火10min，37℃延伸10min，25℃保存10min，一個循環(huán)，反應后放置在冰上10min，最后在-20℃的環(huán)境下保存?zhèn)溆茫?/p>

連接：將雙切酶產(chǎn)物加入連接混合液中，總體積為50ul,混勻后4℃過夜，連接完畢后用ddH₂O稀釋5倍作為預擴增的模板；

預擴增：在25μl PCR反應體系有，含有50ng EA引物，50ng MC引物，5μl酶切連接產(chǎn)物，0.2mmol/L dNTPs,1U Taq酶，1×PCR緩沖液，20個PCR反應循環(huán)參數(shù)為：94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，反應完成后，取5μl PCR產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠檢測，分子量應在250～750bp之間，呈現(xiàn)彌散狀，剩余產(chǎn)物稀釋30倍，作為下一步PCR擴增的模板，在-20℃環(huán)境下保存?zhèn)溆茫?/p>

預擴增對應的引物序列為：

EA：5’-GACTGCGTACCAATTCA-3’

MC：5’-GATGAGTCCTGAGTAAC-3’

選擇性擴增：在15μl PCR反應體系中2ul預擴增產(chǎn)物，50ng EA引物，50ng MC引物，0.2mmol/L dNTPs,1U Taq酶，1×PCR緩沖液，2mmol/L MgCl₂，PCR第一個循環(huán)參數(shù)為：94℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，共12個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度降0.7℃；然后94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，24個循環(huán)，最后72℃擴增5min，25℃持續(xù)10min；

S4：擴增產(chǎn)物的電泳檢測：包括PAGE膠的制備，電泳分離和銀染顯影；

PAGE膠的制備：用洗滌劑將背板和面板徹底洗凈，先用去離子水淋洗，再用無水乙醇淋洗并晾干，背板上用光滑的濾紙均勻涂抹無水乙醇擦洗2-3次，晾干后再用1ml硅化液均勻涂抹背板晾曬備用，面板的清潔方式與背板的清潔方式相同，將墊片用水沖洗干凈，用吸水紙擦干，放在面板的兩側，將背板道口在面板上，下端對其，兩端放置均勻，夾上夾子，用制膠梳試兩板之間空隙的松緊，調(diào)整夾子的位置從而調(diào)節(jié)松緊，然后用水平儀將套好的板調(diào)至水平，用水把燒杯沖洗干凈，加入約(50ml)16％的PAGE膠和40ul TEMED，玻璃棒攪拌均勻，將倒膠口一端調(diào)高，順著膠口均勻的倒入凝膠，在凝膠接近末端時將玻璃板調(diào)平，然后水平插入制膠梳，插入深度約5mm左右，夾上夾子放置40min備用；

電泳分離：將制好的凝膠上的夾子取下，用水將玻璃板沖洗干凈，取下膠口上的膠條，用水將膠口沖洗干凈，將擴增產(chǎn)物放置在膠板的垂直槽上，夾緊夾子，加入1×TBE的緩沖液，上端要淹沒電極，電泳的參數(shù)設置為：U：2000V、I：100mA、P：80W，預電泳30min后，停掉電源，用注射器將點樣槽里的氣泡和雜質(zhì)清除，插入點樣梳，點完樣后按預電泳參數(shù)繼續(xù)電泳，SSR標記待第一條指示劑泳道出膠后即可終止電泳，AFLP標記待第二條指示劑泳道離板底約4cm左右即可終止電泳；

銀染顯影：電泳完畢后，剝離下膠板，將其浸入(1L)10％冰乙酸中，輕輕搖動置指示劑消失為止，然后用去離子水漂洗膠板3次，然后放入1L染色液中進行染色，輕微晃動的時間為40min，取出膠板，用蒸餾水中迅速漂洗，立即轉入1L預冷的顯影液，輕輕搖動至出現(xiàn)清晰可見的條帶停止顯影，最后用自來水漂洗5min，室溫晾干，拍照保存。

本發(fā)明還提供了一種亞麻高纖維素含量分子標記應用的方法步驟如下：

S1：田間材料的前景選擇：用基因池篩選得到前景標記對回交組合后代進行前景選擇，分離單株中在前景標記點選擇表現(xiàn)為雜合即表示攜帶了目的性狀的區(qū)段，確定為目的單株；

S2：田間雜交：首先用供體親本和輪回親本進行雜交，在后代個體中選擇具有目的性狀的單株繼續(xù)與輪回親本進行雜交，每次回交都對分離單株進行前景和背景選擇，選擇后挑選目的單株繼續(xù)后續(xù)的回交；

S3：對雜交后的單株進行標記驗證與選取：選取雜交單株后代30粒飽滿種子磨碎后倒入試管中，在試管中加入2ml乙醚：石油醚＝(1:1)的混合溶液，然后加入等體積的甲醇進行酯化反應，靜置1小時使其充分反應，最后加入蒸餾水定容至10ml萃取，取上層溶液進行電泳檢測，通過與擴增產(chǎn)物的電泳檢測獲取的影像對比，篩選出含有被標記的亞麻高纖維素含量的親本。

根據(jù)實施例一、二、三的實驗結果總結得出：最佳實施方案為實施例二。盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，對于本領域的普通技術人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權利要求及其等同物限定。