技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于竹類植物化學(xué)成分領(lǐng)域，具體涉及一種七彩竹稈中黃酮類化合物的提取分離和組織化學(xué)定位方法。

背景技術(shù)：
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竹類植物有著廣泛的分布，其在化學(xué)成分、營養(yǎng)保健、藥理作用、食品開發(fā)等方面已經(jīng)做了初步的研究，竹類植物具有生態(tài)和經(jīng)濟(jì)的雙重效益的樹種，具有很高的開發(fā)價(jià)值。近年的研究表明，竹類植物中含有大量的類黃酮化合物，也是竹類植物中主要的生理活性成分。黃酮類化合物具有清除自由基、抗炎、預(yù)防心血管疾病、抗衰老和降血脂等生理功能，在保健品、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，對竹類植物資源分布的調(diào)查，竹類植物的繁殖技術(shù)，竹類植物的鑒定和化學(xué)成分均有研究；但仍有較多問題有待解決。如：對竹類植物化學(xué)成分的研究較多，但是對針對黃酮類化合物在竹類植物中的分布與定位的研究十分缺乏；對竹類植物中黃酮類化合物在不同部位成分含量存在差別也缺少較全面的研究；有關(guān)竹類植物中黃酮類化合物的合成規(guī)律和合成部位及生理脅迫對其形成的影響，至今未見有關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于提供涉及一種七彩竹稈中黃酮類化合物的提取分離和組織化學(xué)定位方法?；谝陨犀F(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明對黃酮類化合物的組織化學(xué)定位進(jìn)行更全面的了解竹類植物中類黃酮化合物的合成分布提供了有效方法。首先利用徒手切片技術(shù)對竹類植物的莖中的黃酮類化合物進(jìn)行組織化學(xué)定位。通過該發(fā)明，了解竹類植物莖中類黃酮化合物的分布情況，從而為各類物質(zhì)代謝過程的研究提供基礎(chǔ)。其次從蒲竹子莖中提取化學(xué)成分，利用硅膠柱色譜分離，分離出晶體化合物，再經(jīng)tlc薄層鑒別和光譜解析，得到該植物所含的化合物；并利用高效液相色譜法得到七彩虹竹3個(gè)時(shí)期中化學(xué)成分圖譜，精確確定各個(gè)時(shí)期中黃酮類化合物的含量和種類。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

一種從七彩竹稈中提取分離黃酮類化合物的方法，利用回流提取法從七彩虹竹稈原料中進(jìn)行總成分提取，并利用硅膠柱色譜分離，分離出晶體化合物，再經(jīng)tlc薄層鑒別和光譜解析，得到該植物所含的6種化合物，并進(jìn)一步進(jìn)行含量測定。

如所述的一種從七彩竹稈中提取分離黃酮類化合物的方法，其中所述的總成分提取采用回流提取法，將七彩虹竹稈粉碎，用70％的乙醇在容器中水浴加熱冷卻回流提取3次，每次1-2小時(shí)，重復(fù)3次，過濾，合并濾液，丟棄稈渣；用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器儀65℃左右對初提液進(jìn)行旋蒸，蒸出溶液中的乙醇，得到七彩虹竹稈浸膏。

如所述的一種從七彩竹稈中提取分離黃酮類化合物的方法，其中所述的分離晶體化合物采用石油醚與水提液共同萃取上一步驟回流提取所得浸膏，萃取24小時(shí)后用分液漏斗分離，分別用石油醚萃取4次，下層為水提物，上層為石油醚萃取物，把4次萃取上層混合，然后上層用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸，把石油醚蒸出，得到石油醚浸膏，把剩下的下層水提物和乙酸乙酯共同混合萃取24小時(shí)后用分液漏斗分離，同樣用乙酸乙酯萃取4次，下層為水提物，上層為乙酸乙酯萃取物，把五次萃取上層混合，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸，蒸出乙酸乙酯，得到乙酸乙酯浸膏，再把剩下的水提物用正丁醇萃取，分別用正丁醇萃取4次，把上層正丁醇萃取物混合，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸出正丁醇，得到正丁醇浸膏，最后把水提物層用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸出蒸餾水，得到水層浸膏；乙酸乙酯萃取部分16.0g用200-300目硅膠柱層析色譜法分離，以100∶-1∶1的石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)梯度洗脫甲柱，稱取硅膠，稱10倍于上樣量；洗脫出的干物質(zhì)重量、結(jié)晶情況待合并完成后，觀察并記錄洗脫出的干物質(zhì)重量、結(jié)晶情況；

將甲柱18-37餾分用乙酸乙酯溶解，用100-200目硅膠拌樣，采用200-300目硅膠柱層析裝柱分離，采用10:1石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，得到餾分，通過tlc薄層色譜法鑒定，合并相同餾分，并觀察結(jié)晶情況；

同時(shí)，將甲柱中石油醚：乙酸乙酯＝5:1洗脫部分得到餾分合并，干燥稱重g，用甲醇溶解，用100-200目硅膠拌樣，進(jìn)行200-300目硅膠柱層析分離，采用8:1氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，得到各餾分，觀察結(jié)晶情況。

如所述的一種從七彩竹稈中提取分離黃酮類化合物的方法，其中所述的晶體化合物含量測定采用280nm為檢測波長，流動(dòng)相用乙腈∶水。

如所述的一種從七彩竹稈中提取分離黃酮類化合物的方法，其中用七彩虹竹稈幼嫩未見光部分為原料，以所含化合物牡荊苷和異牡荊苷作為七彩虹竹含量測定的指標(biāo)成分進(jìn)行定量分析。

如所述的一種從七彩竹稈中提取分離黃酮類化合物的方法，其中所述的從七彩竹稈中提取分離到的黃酮類化合物為化合物1木犀草素、化合物2木犀草素-7-o-β-d-葡萄糖苷、化合物3葒草苷、化合物4β-谷甾醇、化合物5牡荊苷、化合物6胡蘿卜苷。

七彩竹中黃酮類化合物的組織化學(xué)定位方法，以七彩虹竹的健康新鮮的竹稈為材料，取新鮮的竹稈，將竹稈上的竹葉去凈，經(jīng)風(fēng)干后，粉碎至20目，避光貯存，運(yùn)用在組織切片的擬檢成分起化學(xué)反應(yīng)，形成有顏色的終末反應(yīng)產(chǎn)物，該產(chǎn)物沉淀在相應(yīng)成分所在的位置上，用以定位七彩竹稈中黃酮類化合物在組織或細(xì)胞內(nèi)的分布含量，測定七彩竹中黃酮類化合物在不同部位成分的含量。

如所述的七彩虹竹中黃酮類化合物的組織化學(xué)定位方法，七彩虹竹中黃酮類化合物組織化學(xué)定位方法采用：

(1)5％naoh溶液染色法：新鮮七彩虹竹稈經(jīng)徒手切片后滴加一滴5％naoh水溶液，蓋上蓋玻片，同時(shí)去掉多余的試液，5min后用在自然光下觀察并照相，黃酮類化合物經(jīng)5％naoh水溶液染色會(huì)產(chǎn)生特征性的顯色反應(yīng)，變色范圍從淡黃色至橙色；

(2)1％醋酸鎂溶液染色法：

新鮮七彩虹竹稈經(jīng)徒手切片后滴加一滴1％醋酸鎂甲醇溶液，蓋上蓋玻片，同時(shí)去掉多余的試液，隨即用熒光顯微鏡的藍(lán)色激發(fā)光450-490nm為激發(fā)光源觀察黃酮類化合物發(fā)出的熒光并照相，黃酮類化合物經(jīng)1％醋酸鎂甲醇溶液染色，發(fā)出綠色熒光；

(3)1％na甲醇溶液染色法：

新鮮七彩虹竹稈經(jīng)徒手切片后滴加一滴含1％nacl的磷酸緩沖液，片刻后滴加na甲醇溶液試劑一滴，蓋上蓋玻片，同時(shí)去掉多余的試液，隨即用熒光顯微鏡的紫外光激發(fā)光330-380nm為激發(fā)光源觀察黃酮類化合物發(fā)出的熒光并照相，在紫外光下，1％na甲醇溶液與黃酮類化合物反應(yīng)呈黃色熒光；

如所述的七彩虹竹中黃酮類化合物的組織化學(xué)定位方法，七彩虹竹中木質(zhì)素的組織化學(xué)定位法采用新鮮七彩虹竹稈經(jīng)徒手切片后用2％的間苯三酚酒精95％溶液浸泡5min，再用6mol·l-1hcl進(jìn)行封片，在自然光下觀察，wiesner反應(yīng)對木質(zhì)素產(chǎn)生顏色反應(yīng)呈現(xiàn)暗紅色。

如所述的七彩虹竹中黃酮類化合物的組織化學(xué)定位方法，其中不同時(shí)期七彩虹竹稈中黃酮類化合物的組織化學(xué)定位采用取當(dāng)年生枝的七彩虹竹稈，根據(jù)七彩虹竹稈的成熟程度和光照對稈的影響分為三個(gè)時(shí)期，時(shí)期ⅰ為未見光的稈，稈均呈淡黃色，時(shí)期ⅱ為見光的幼稈，竹稈整體或者上端出現(xiàn)淡紅色，時(shí)期為ⅲ成熟稈，竹稈出現(xiàn)淡紅色至暗紅色，從表皮層、表皮層內(nèi)方的機(jī)械組織、維管束進(jìn)行觀察，并分析組織化學(xué)定位熒光的變化來確定含量的變化。

本發(fā)明以七彩虹竹的健康新鮮的竹稈為材料，運(yùn)用在組織切片的擬檢成分起化學(xué)反應(yīng)，形成有顏色的終末反應(yīng)產(chǎn)物，該產(chǎn)物沉淀在相應(yīng)成分所在的位置上，用以定位七彩竹稈中黃酮類化合物在組織或細(xì)胞內(nèi)的分布含量，能精確測定七彩竹中黃酮類化合物在不同部位成分的含量，對七彩虹竹植物中黃酮類化合物的合成規(guī)律和合成部位及生理脅迫對其形成的影響具有重要價(jià)值。本發(fā)明對七彩虹竹稈在不同時(shí)期的黃酮類化合物的變化進(jìn)行了確定。根據(jù)七彩虹竹稈的成熟程度和光照對稈的影響可以分為三個(gè)時(shí)期，時(shí)期ⅰ(未見光的稈，稈均呈淡黃色)，ⅱ(見光的幼稈，竹稈整體或者上端出現(xiàn)淡紅色)、ⅲ(成熟稈，竹稈出現(xiàn)淡紅色至暗紅色)。得出時(shí)期ⅰ(未見光的稈，稈均呈淡黃色)的七彩虹竹黃酮類化合物合成量最高，為本發(fā)明方法的優(yōu)化提供依據(jù)和指導(dǎo)。

用黃酮類化合物在七彩竹稈中組織或細(xì)胞內(nèi)的分布含量指導(dǎo)提取方法最佳時(shí)機(jī)：黃酮類化合物經(jīng)1％na甲醇溶液染色法染色后，并用熒光顯微鏡的紫外光激發(fā)光激發(fā)可產(chǎn)生黃色熒光。新鮮的七彩虹竹稈切片經(jīng)1％na甲醇溶液染色法染色后，在熒光顯微鏡的紫外激發(fā)光下觀察發(fā)現(xiàn)在表皮層中和表皮層內(nèi)方的機(jī)械組織之中含有大量的黃色熒光，而維管束周圍呈現(xiàn)的比較強(qiáng)烈的黃色熒光，在基本組織中也出現(xiàn)了黃色熒光。

利用高效液相色譜法對七彩虹竹稈中四種黃酮類化合物不同時(shí)期的含量進(jìn)行測定。結(jié)果表明未見光幼稈中黃酮類含量較高，見光幼稈居中，成熟稈中的黃酮類化合物含量急劇減少，說明在七彩虹竹稈的生長發(fā)育過程中黃酮物質(zhì)含量較高的部位是幼嫩未見光部分。四種標(biāo)準(zhǔn)品的含量測定結(jié)果表明，牡荊苷和異牡荊苷的含量最高，最高能達(dá)到10.2％，用作為七彩虹竹含量測定的指標(biāo)成分進(jìn)行定量分析。

附圖說明：

圖1七彩虹竹樣品，1號(hào)為葒草苷；2號(hào)為牡荊苷；3號(hào)為異牡荊苷；4號(hào)為木犀草素；

圖2混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，1號(hào)為葒草苷；2號(hào)為牡荊苷；3號(hào)為異牡荊苷；4號(hào)為木犀草素；

圖31號(hào)標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖42號(hào)標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖53號(hào)標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖64號(hào)標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖7化合物提取流程圖；

圖8化合物提取流程圖。

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明的實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此來限定本發(fā)明。

實(shí)施例1：

試驗(yàn)材料：

七彩虹竹(indosasahispidamcclure“rainbow”)為禾本科(poaceae)竹亞科(bambusoideae)大節(jié)竹屬(indosasa)植物。稈高2‐3m，直徑1～3cm幼時(shí)表面被有小刺毛，后脫落變?yōu)闊o毛，節(jié)下方有白粉；稈中部每節(jié)多3分枝，枝直立開展，竹稈中下部呈現(xiàn)不同程度的紅色至紫紅色。葉片呈現(xiàn)淡黃條紋，帶狀披針形或披針形，外長9～23cm，寬1.5～4cm，先端長漸尖，基部楔形或?qū)捫ㄐ?，下表面常被有短柔毛，稀可無毛，兩邊緣有小鋸齒，次脈5～6對，小橫脈明顯。分布于滇南邊緣熱帶及南亞熱帶山地。竹稈上呈現(xiàn)不同程度的紅色至紫紅色和葉片呈現(xiàn)淡黃條紋的性狀。

2.黃酮類化合物在七彩虹竹稈中的分布狀況：

實(shí)驗(yàn)材料采集和處理：

組織化學(xué)定位材料：以七彩虹竹的健康新鮮的竹稈為材料。

植物化學(xué)材料：取新鮮的竹稈，先將竹稈上的竹葉去凈，經(jīng)風(fēng)干后，粉碎至20目，避光貯存，備用。

實(shí)驗(yàn)方法：組織化學(xué)定位方法。

實(shí)驗(yàn)原理：運(yùn)用組織化學(xué)定位的基本原理,其原理是在組織切片的擬檢成分起化學(xué)反應(yīng)，形成有顏色的終末反應(yīng)產(chǎn)物，該產(chǎn)物沉淀在相應(yīng)成分所在的位置上，用以研究糖類.脂類.蛋白質(zhì).酶類和核酸等物質(zhì)在組織或細(xì)胞內(nèi)的分布含量。

儀器與試劑：

熒光顯微鏡(尼康e800)，載玻片，蓋玻片，刀片，吸管。

醋酸鎂，甲醇，氫氧化鈉，磷酸二氫鉀，氯化鈉，na(diphenylboricacid2‐aminoethylester二苯基硼酸‐2‐氨基乙酯)，間苯三酚，95％酒精，鹽酸，去離子水。以上藥品均為分析純。

黃酮類化合物組織化學(xué)定位方法：

(1)5％naoh溶液染色法：

新鮮材料經(jīng)徒手切片后滴加一滴5％naoh水溶液(取5gnaoh，加水溶解并定容到100ml)，蓋上蓋玻片，同時(shí)去掉多余的試液，5min后用在自然光下觀察并照相。黃酮類化合物經(jīng)5％naoh水溶液染色會(huì)產(chǎn)生特征性的顯色反應(yīng)，變色范圍從淡黃色至橙色(譚玲玲，2007；陳婧，2012)。

(2)1％醋酸鎂溶液染色法：

新鮮材料經(jīng)徒手切片后滴加一滴1％醋酸鎂甲醇溶液(取醋酸鎂1g，用甲醇溶解并定容到100ml)，蓋上蓋玻片，同時(shí)去掉多余的試液，隨即用熒光顯微鏡的藍(lán)色激發(fā)光(450‐490nm)為激發(fā)光源觀察黃酮類化合物發(fā)出的熒光并照相。黃酮類化合物經(jīng)1％醋酸鎂甲醇溶液染色，發(fā)出綠色熒光(中國科學(xué)院上海藥物研究所植物化學(xué)研究室，1981；譚玲玲，2007)。

(3)1％na甲醇溶液染色法：

新鮮材料經(jīng)徒手切片后滴加一滴含1％nacl的磷酸緩沖液(ph＝6.5，溶液中另含nacl的質(zhì)量濃度為1％)，片刻后滴加na甲醇溶液試劑(稱取na1g，加甲醇溶解并定容到100ml)一滴，蓋上蓋玻片，同時(shí)去掉多余的試液，隨即用熒光顯微鏡的紫外光激發(fā)光(330‐380nm)為激發(fā)光源觀察黃酮類化合物發(fā)出的熒光并照相。在紫外光下，1％na甲醇溶液與黃酮類化合物反應(yīng)呈黃色熒光(peterhutzler，1998；murphya，2000；譚玲玲，2007；李曉丹，2008)。

木質(zhì)素的組織化學(xué)定位法：

新鮮材料經(jīng)徒手切片后用2％的間苯三酚酒精(95％)溶液浸泡5min，再用6mol·l‐1hcl進(jìn)行封片，在自然光下觀察，wiesner反應(yīng)對木質(zhì)素產(chǎn)生顏色反應(yīng)呈現(xiàn)暗紅色(linjx，2002)。

七彩虹竹稈的解剖結(jié)構(gòu)及其維管束的結(jié)構(gòu)：

竹類植物的莖稈自外而內(nèi)由表皮、機(jī)械組織、基本組織、維管束組成。

七彩虹竹稈中黃酮類化合物的組織化學(xué)定位：

黃酮類化合物經(jīng)5％naoh水溶液染色后會(huì)立即產(chǎn)生顯色反應(yīng)，即顯淡黃色至橙色。在新鮮的七彩虹竹稈切片上滴加5％naoh水溶液后，在顯微鏡的自然光下觀察表明，在表皮層、表皮層內(nèi)方的機(jī)械組織和維管束周圍的均有明顯的淡黃色至橙色顯色。黃酮類化合物經(jīng)1％醋酸鎂甲醇溶液染色法染色后，并用熒光顯微鏡的藍(lán)色激發(fā)光激發(fā)可產(chǎn)生綠色熒光。新鮮的七彩虹竹稈切片經(jīng)1％醋酸鎂甲醇溶液染色法染色后，在熒光顯微鏡的藍(lán)色激發(fā)光下觀察發(fā)現(xiàn)在表皮層中和表皮層內(nèi)方的機(jī)械組織之中均分布著大量的綠色熒光，而維管束周圍呈現(xiàn)的比較強(qiáng)烈的綠色熒光，在基本組織中也出現(xiàn)了綠色熒光。黃酮類化合物經(jīng)1％na甲醇溶液染色法染色后，并用熒光顯微鏡的紫外光激發(fā)光激發(fā)可產(chǎn)生黃色熒光。新鮮的七彩虹竹稈切片經(jīng)1％na甲醇溶液染色法染色后，在熒光顯微鏡的紫外激發(fā)光下觀察發(fā)現(xiàn)在表皮層中和表皮層內(nèi)方的機(jī)械組織之中含有大量的黃色熒光，而維管束周圍呈現(xiàn)的比較強(qiáng)烈的黃色熒光，在基本組織中也出現(xiàn)了黃色熒光。

不同時(shí)期七彩虹竹稈中黃酮類化合物的組織化學(xué)定位：

上述已經(jīng)概括了黃酮類化合物的在七彩虹竹稈中的分布位置，但是黃酮類化合物在竹類植物中的分布并非是一成不變的，下面對七彩虹竹稈在不同時(shí)期的黃酮類化合物的變化進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。取當(dāng)年生枝，根據(jù)七彩虹竹稈的成熟程度和光照對稈的影響可以分為三個(gè)時(shí)期，時(shí)期ⅰ(未見光的稈，稈均呈淡黃色)，ⅱ(見光的幼稈，竹稈整體或者上端出現(xiàn)淡紅色)、ⅲ(成熟稈，竹稈出現(xiàn)淡紅色至暗紅色)。主要的探索方向是從已經(jīng)確定的三大方面(表皮層、表皮層內(nèi)方的機(jī)械組織、維管束)進(jìn)行觀察、分析、總結(jié)。

1％醋酸鎂甲醇溶液顯色結(jié)果：

黃酮類化合物經(jīng)1％醋酸鎂甲醇溶液染色法染色后，并用熒光顯微鏡的藍(lán)色激發(fā)光激發(fā)可產(chǎn)生綠色熒光。七彩虹竹新鮮材料稈經(jīng)1％醋酸鎂甲醇溶液染色后，時(shí)期ⅰ染色結(jié)果顯示，表皮層呈現(xiàn)很薄一層綠色熒光，維管束周圍呈現(xiàn)綠色熒光，基本組織中也呈現(xiàn)出了綠色熒光；時(shí)期ⅱ染色結(jié)果顯示，表皮層、表皮層內(nèi)方的機(jī)械組織和維管束周圍呈現(xiàn)綠色熒光，與時(shí)期ⅰ相比較，表皮層和維管束周圍的綠色熒光較為強(qiáng)烈，而基本組織中分布的綠色熒光面積相對減少了；時(shí)期ⅲ染色結(jié)果顯示，表皮層呈現(xiàn)綠色熒光，表皮層內(nèi)方的機(jī)械組織和維管束周圍呈現(xiàn)強(qiáng)烈的綠色熒光，與時(shí)期ⅱ相比，表皮層內(nèi)方的機(jī)械組織的綠色熒光強(qiáng)度增加了，而維管束周圍和基本組織中呈現(xiàn)的綠色熒光變化并不是明顯。

1％na甲醇溶液顯色結(jié)果：

黃酮類化合物經(jīng)1％na甲醇溶液染色法染色后，并用熒光顯微鏡的紫外光激發(fā)光激發(fā)可產(chǎn)生黃色熒光。七彩虹竹新鮮材料稈經(jīng)1％na甲醇溶液染色后，時(shí)期ⅰ染色結(jié)果顯示，表皮層、表皮層內(nèi)方的機(jī)械組織和維管束周圍均呈現(xiàn)黃色熒光，在基本組織中也呈現(xiàn)了黃色熒光；時(shí)期ⅱ染色結(jié)果顯示，表皮層、表皮層內(nèi)方的機(jī)械組織和維管束周圍均呈現(xiàn)黃色熒光，與時(shí)期ⅰ相比較表皮層內(nèi)方的機(jī)械組織和維管束周圍的熒光變的更為強(qiáng)烈，表皮層和基本組織中的黃色熒光并沒有多大變化；時(shí)期ⅲ染色結(jié)果顯示，表皮層、表皮層內(nèi)方的機(jī)械組織和維管束周圍均呈現(xiàn)黃色熒光，與時(shí)期ⅱ相比，表皮層內(nèi)方的機(jī)械組織和維管束周圍的黃色熒光變得更為強(qiáng)烈，而表皮層和基本組織中的黃色熒光并沒有多大變化。

不同時(shí)期七彩虹竹稈中木質(zhì)素的變化：

木質(zhì)素經(jīng)2％的間苯三酚酒精染色，再用6mol·l‐1hcl進(jìn)行封片，在自然光下觀察，木質(zhì)素產(chǎn)生顏色反應(yīng)呈現(xiàn)暗紅色.七彩虹竹新鮮材料稈經(jīng)2％間苯三酚酒精溶液染色后，時(shí)期ⅰ染色結(jié)果顯示，在維管束周圍呈現(xiàn)淡紅色；時(shí)期ⅱ染色結(jié)果顯示，在表皮層內(nèi)方的機(jī)械組織呈現(xiàn)淡紅色，維管束周圍呈現(xiàn)紅色，與時(shí)期ⅰ相比維管束周圍紅色的區(qū)域加大了；時(shí)期ⅲ染色結(jié)果顯示，在表皮層內(nèi)方的機(jī)械組織和維管束周圍均呈現(xiàn)深紅色，與時(shí)期ⅱ相比較，表皮層內(nèi)方的機(jī)械組織與維管束周圍所呈現(xiàn)的紅色均比時(shí)期ⅱ更為強(qiáng)烈，而且表皮層內(nèi)方的機(jī)械組織和維管束周圍的紅色區(qū)域加大了。

2.黃酮類化合物的提取分離：

儀器與試劑：

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(re‐52)(上海亞榮生化儀器廠)、高壓滅菌鍋、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(dh‐9140a型)(上海恒科技有限公司)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(hh‐2)(國華電器有限公司)、冰箱、冷凝管、小安瓶、正相硅膠板、展開槽、結(jié)晶刀、5ml量筒、100ml量筒、1/10000分析天平、1000ml分液漏斗、1000ul移液槍、槍頭、500ml燒杯、250ml錐形瓶、1000ml圓底燒瓶、500ml圓底燒瓶、培養(yǎng)皿、5ml，20ml容量瓶、膠頭滴管、定性濾紙。

三氯甲烷、甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、10％硫酸—乙醇顯色劑、三氯化鋁、三氯化鐵、蒸餾水。

(1)七彩虹竹稈中總成分提取和不同極性成分的分離：

七彩虹竹稈中總成分提取采用回流提取法。將竹稈粉碎樣品稱量得2.15kg，用70％的乙醇在10升容器中水浴加熱冷卻回流提取3次，每次1‐2小時(shí)，重復(fù)3次，過濾，合并濾液為初提液，丟棄稈渣。

用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器儀65℃左右對初提液進(jìn)行旋蒸，蒸出溶液中的乙醇，得到七彩虹竹稈浸膏0.39kg。

用石油醚與水提液共同萃取上述所得浸膏24小時(shí)后，用分液漏斗分離，再分別用石油醚萃取4次，下層為水提物，上層為石油醚萃取物，把4次萃取上層混合，然后上層用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸，把石油醚蒸出，得到石油醚浸膏8g。把剩下的下層水提物和乙酸乙酯共同混合萃取24小時(shí)后用分液漏斗分離，同樣用乙酸乙酯萃取4次，下層為水提物，上層為乙酸乙酯萃取物，把五次萃取上層混合，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸，蒸出乙酸乙酯，得到乙酸乙酯浸膏16g。再把剩下的水提物用正丁醇萃取，分別用正丁醇萃取4次，把上層正丁醇萃取物混合，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸出正丁醇，得到正丁醇浸膏20.4g(圖7)。最后把水提物層用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸出蒸餾水，得到水層浸膏。貼簽，儲(chǔ)存，備用。

(2)乙酸乙酯層浸膏的分離：

乙酸乙酯萃取部分16.0g用硅膠柱層析色譜法分離(200‐300目硅膠)，以石油醚‐乙酸乙酯系統(tǒng)(100∶‐1∶1)梯度洗脫(甲柱)。稱取硅膠，稱10倍于上樣量；準(zhǔn)備上樣16g，稱取硅膠160g。洗脫出的干物質(zhì)重量、結(jié)晶情況：待合并完成后，觀察并記錄洗脫出的干物質(zhì)重量、結(jié)晶情況。

將甲柱18‐37餾分5.2g用乙酸乙酯溶解，用硅膠(100‐200目)5g拌樣，采用硅膠柱層析(200‐300目)50g裝柱分離，采用石油醚‐乙酸乙酯系統(tǒng)(10:1)進(jìn)行梯度洗脫，得到餾分，通過tlc薄層色譜法鑒定，合并相同餾分，并觀察結(jié)晶情況。

甲柱中石油醚：乙酸乙酯＝5:1洗脫部分得到餾分合并，干燥稱重為2.6g，用甲醇溶解，用硅膠(100‐200目)5g拌樣，進(jìn)行硅膠柱(200‐300目)層析分離，采用氯仿‐甲醇系統(tǒng)(8:1)梯度洗脫，得到各餾分，觀察結(jié)晶情況。

七彩虹竹稈在不同生長發(fā)育時(shí)期中黃酮類化合物的含量測定：

儀器與試劑：

超聲波清洗器(西班牙fungilab)；agilent1200高效液相色譜儀(自動(dòng)進(jìn)樣器，二極管陣列檢測器，agilent化學(xué)工作站，色譜柱為eclipsexdb‐c18)；數(shù)顯恒溫水浴鍋hh–2型(國華電器有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱dhg‐9140a型(上海一恒科技有限公司，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；賽特路斯萬分之一電子天平bs210s型；蒸發(fā)皿；三角瓶(50ml)；量筒(50ml)；漏斗；濾紙。

甲醇(分析純)、甲醇(色譜純，美國fisher公司)、乙腈(色譜純，美國fisher公司)超純水(自制)。對照品木犀草素、葒草苷、異牡荊苷、牡荊苷均購于sigma公司。

溶液的制備：

對照品儲(chǔ)備液：分別稱取對照品1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)各10mg，精密稱定，置于同一10ml量瓶中，加甲醇(色譜純)溶解，定容，搖勻，即得。

供試品溶液：取七彩虹竹稈粉碎樣本5g，精密稱定，用70％乙醇30ml回流提取40min，濾液揮干，溶于水中，加10ml甲醇溶解，過濾，即得。

色譜條件：

色譜儀：安捷倫1200系列；色譜柱：eclipsexdb‐c18(4.6*150mm,5μm)；柱溫：25℃；流動(dòng)相：甲醇：水；紫外檢測波長：280nm；進(jìn)樣量：10μl；

樣品測定：準(zhǔn)確吸取制備液樣品10μl，注入高效液相色譜儀進(jìn)行色譜測定。

七彩虹竹稈中黃酮類化合物的提取分離：

利用回流提取法從七彩虹竹稈原料中進(jìn)行總成分提取，并利用硅膠柱色譜分離，分離出晶體化合物，再經(jīng)tlc薄層鑒別和光譜解析，得到該植物所含的6種化合物。

植物的有效成分的提取有溶劑法，水蒸氣蒸餾法和升華法等。溶劑提取法是選擇適當(dāng)?shù)娜軇⒅参镏械幕瘜W(xué)成分從中提取出來，可將固體樣品按極性遞增方式，用不同溶劑，如石油醚提游離甾體，氯仿或乙酸乙酯提生物堿，有機(jī)酸等。得到各個(gè)餾分經(jīng)活性測試確定有效部位后再進(jìn)一步分離。

采用硅膠吸附柱色譜分離時(shí)，吸附劑用量一般為樣品量的30‐60倍，應(yīng)盡可能選用極性小的溶劑裝柱和溶解樣品，以利樣品在吸附柱上形成狹窄的原始譜帶。洗脫用溶劑的極性宜逐步增大，多用混合溶劑，通過調(diào)節(jié)比例以改變極性，達(dá)到梯度洗脫分離物質(zhì)的目的。溶劑系統(tǒng)可通過tlc進(jìn)行篩選，一般tlc展開時(shí)使組分rf值達(dá)到0.2‐0.3的溶劑系統(tǒng)可選用為最佳溶劑系統(tǒng)。

初始洗脫劑的選擇：選擇合適的洗脫劑是分離成敗的關(guān)鍵因素，正確的選擇洗脫劑能大大提高組分分離效果，對正相硅膠板來講，洗脫劑極性越大，其洗脫能力越強(qiáng)，如果選擇大極性的溶劑作為洗脫劑，很可能一下子把所有的組分都沖下來，因此應(yīng)選擇極性較小的溶劑作為洗脫劑，洗脫劑采用石油醚、乙酸乙酯，通過改變各種溶劑的配比來改變其極性，直到摸索到一個(gè)能使組分在正相薄層色譜法(tlc)展開，并且能將各個(gè)主要斑點(diǎn)分開，無重疊現(xiàn)象，有效成分的比移值小于0.2。經(jīng)過多次試驗(yàn)，通過將乙酸乙酯層溶液用薄層分析法分析，用5％硫酸乙醇顯色劑顯色。

七彩虹竹稈在不同生長發(fā)育時(shí)期中黃酮類化合物的含量：

利用高效液相色譜法對七彩虹竹稈中四種黃酮類化合物不同時(shí)期的含量進(jìn)行測定。結(jié)果表明未見光幼稈中黃酮類含量較高，見光幼稈居中，成熟稈中的黃酮類化合物含量急劇減少，說明在七彩虹竹稈的生長發(fā)育過程中黃酮物質(zhì)含量較高的部位是幼嫩未見光部分。四種標(biāo)準(zhǔn)品的含量測定結(jié)果表明，牡荊苷和異牡荊苷的含量最高，最高能達(dá)到10.2％，用作為七彩虹竹含量測定的指標(biāo)成分進(jìn)行定量分析。

波長的選擇：葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷和木犀草素的紫外吸收光譜分別具有多個(gè)吸收峰，在200‐900nm范圍進(jìn)行全波長掃描，選擇波長要既能兼顧所有標(biāo)準(zhǔn)品的檢測敏感度，又能將外源干擾降低到最小限度，因此，選擇了280nm作為檢測波長，并收到較好的實(shí)驗(yàn)效果。

hplc條件的選擇：曾試圖用固定甲醇‐水為流動(dòng)相，但分離效果不佳。采用甲醇‐水梯度洗脫的方法，獲得了較好的分離效果。同時(shí)測定七彩虹竹中的四個(gè)指標(biāo)成分葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷和木犀草素，分離度好，雜質(zhì)峰干擾少，完全出峰時(shí)間在32min內(nèi)。該方法快速、準(zhǔn)確、可靠。

溶液的穩(wěn)定性：詳細(xì)考察了樣品和對照品的穩(wěn)定性，結(jié)果表明：二者在室溫、普通光照的條件下24h穩(wěn)定，不需要特殊保存。

七彩虹竹稈中黃酮類化合物乙酸乙酯層提取分離結(jié)果：

化合物的結(jié)構(gòu)鑒定：

化合物1：

淡黃色針狀結(jié)晶，淡黃色針狀結(jié)晶，在三種展開系統(tǒng)中的rf值為(氯仿：丙酮＝5：1，0.36；氯仿：甲醇＝9：1，0.23；石油醚：乙酸乙酯＝2：1，0.21)，均為單一黃色斑點(diǎn)，推斷為單體化合物，具體結(jié)構(gòu)亦需進(jìn)一步通過光譜解析得到。黃色粉末，鹽酸‐鎂粉反應(yīng)呈陽性，uvλmax253.3、349.2nm，顯示為黃酮類化合物的吸收峰。與木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行tlc對照，在3種不同展開溶劑中rf值和顯色一致，且混合熔點(diǎn)不下降。綜合上述特征，故鑒定該化合物為木犀草素(luteolin)。

化合物2：黃色粉末，鹽酸‐鎂粉反應(yīng)呈陽性，molish反應(yīng)陽性，酸水解后只檢測出葡萄糖。uvλmax253.3、349.2nm，提示該化合物為黃酮苷類化合物，且所連糖為葡萄糖。與木犀草素‐7‐o‐β‐d‐葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行tlc對照，在多種溶劑中rf值和顯色一致，且混合熔點(diǎn)不下降，可確定該化合物為木犀草素‐7‐o‐β‐d‐葡萄糖苷(luteolin‐7‐o‐β‐d‐glucopyranoside)。

化合物3：淡黃色片狀結(jié)晶，鹽酸鎂粉反應(yīng)呈陽性，molish反應(yīng)呈陽性，證明是黃酮類化合物。與葒草苷和異葒草苷標(biāo)準(zhǔn)品對照，采用三種不同展開系統(tǒng)進(jìn)行展開，tlc薄層色譜法鑒別，與葒草苷具有相同rf值，且混合熔點(diǎn)不下降，確定該化合物為葒草苷(orientin)。

化合物4：白色針狀結(jié)晶，mp132～134℃。liebermann‐burchard反應(yīng)陽性。與β‐谷甾醇對照品對照，在三種展開系統(tǒng)中的rf值一致(石油醚：乙酸乙酯＝5：1，環(huán)己烷：丙酮＝6：1，純氯仿)，混熔點(diǎn)不下降。故確定該化合物為β‐谷甾醇(β‐sitosterol)。

化合物5：黃色結(jié)晶，mp260～262℃，三氯化鐵反應(yīng)呈陽性，smith降解反應(yīng)生成葡萄糖，顯示其中含有葡萄糖的黃酮苷類，對對照品牡荊苷共同薄層色譜鑒別，rf值一致，故鑒定該化合物為5,7,4’‐三羥基黃酮‐8‐β‐d‐葡萄糖，即牡荊苷(vitexin)

化合物6：白色粉末，在三種展開系統(tǒng)中的rf值為(氯仿：丙酮＝4：1，0.50；氯仿：甲醇＝9：1，0.19；石油醚：乙酸乙酯＝2：1，0.23)，均為單一斑點(diǎn)，推斷該化合物為單一化合物。與β‐胡蘿卜苷對照，tlc結(jié)果確定該化合物為為胡蘿卜苷(daucosterol)。

七彩虹竹稈在不同生長發(fā)育時(shí)期中黃酮類化合物的含量測定：

色譜條件：

在200～900nm波長范圍內(nèi)選擇不同波長進(jìn)行分析測試，發(fā)現(xiàn)在280nm處最高，因此選擇280nm為最佳檢測波長。流動(dòng)相用乙腈：水，待測物的分離效果最好。柱溫對樣品測定有很大影響，溫度低時(shí)，出峰時(shí)間長，而且峰嚴(yán)重拖尾；溫度太高，則出峰太快，待測峰有部分重疊，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，恒定柱溫為35℃，待測峰的重現(xiàn)性和保留時(shí)間都比較理想。對照品、樣品色譜圖(見圖1和圖2)。

結(jié)果表明，在現(xiàn)行色譜條件下4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品與其他組分得到了很好的分離，4個(gè)指標(biāo)成分色譜峰理論塔板數(shù)均不小于2000，各指標(biāo)成分的色譜峰與其他峰分離度均大于1.5。

線性關(guān)系考察：

分別精密吸取“2.3.3.3”項(xiàng)下制備的對照品儲(chǔ)備液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml，分別置100ml量瓶中，加甲醇定容,搖勻，配制成系列濃度的對照品溶液。按上述色譜條件測定峰面積，以色譜峰面積y為縱坐標(biāo)，樣品濃度x(mg·ml^‐1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(如下表1‐4；圖3，4，5，6)。

表11號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品峰面積與濃度關(guān)系表

表22號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品峰面積與濃度關(guān)系表

表33號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品峰面積與濃度關(guān)系表

表44號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品峰面積與濃度關(guān)系表

經(jīng)線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)品1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)回歸方程為：

y＝29830x+78.3r＝0.9993

y＝120430x+37.1r＝0.9998

y＝152330x‐12.3r＝0.9996

y＝69660x+31r＝0.9998

對照品1號(hào)葒草苷；2號(hào)牡荊苷；3號(hào)異牡荊苷；4號(hào)木犀草素在0.01～0.05mg·ml‐1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：

吸取“2.3.3.3”項(xiàng)下制備的對照品儲(chǔ)備液，重復(fù)進(jìn)樣5次，結(jié)果黃酮標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的rsd(relativestandarddeviation)分別為3.0％，0.8％，2.5％，2.8％。

重復(fù)性試驗(yàn)：

取同一批七彩虹竹樣品溶液5份，分別按樣品含量測定方法操作，測定峰面積，計(jì)算得混合標(biāo)準(zhǔn)品含量的rsd分別為1.5％，1.7％，2.5％，2.3％，1.9％。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：

取七彩虹竹供試品溶液，分別在0，4，8，12，16h，進(jìn)樣測定峰面積，結(jié)果混合標(biāo)準(zhǔn)品含量rsd分別為0.9％，1.2.％，2.2％，1.0％，2.5％，表明供試品溶液在16h內(nèi)基本穩(wěn)定。

回收率試驗(yàn)：

精密稱取已知含量的七彩虹竹樣品9份，每份約1.5g，分別加入對照品溶液，按供試品溶液制備方法操作，并按上述色譜條件測定峰面積，計(jì)算5種成分的回收率，測定結(jié)果，平均加樣回收率均在95％‐105％置性區(qū)間，符合要求。

七彩虹竹稈在不同生長發(fā)育時(shí)期中黃酮類化合物的含量測定：

取不同生長發(fā)育時(shí)期的七彩虹竹樣本，制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液，每次進(jìn)樣10μl，按照色譜條件測定峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果見表5。

表5不同生長發(fā)育時(shí)期七彩虹竹黃酮的含量測定結(jié)果(％，n＝3)

含量測定結(jié)果表明，未見光幼稈黃酮類化合物含量較高，見光幼稈居中，成熟稈的黃酮類化合物含量急劇減少，說明在七彩虹竹稈在生長發(fā)育過程中黃酮類化合物含量較高的部位是幼嫩未見光部分。四種標(biāo)準(zhǔn)品的含量測定結(jié)果表明，牡荊苷和異牡荊苷的含量最高，最高能達(dá)到10.2％，可作為七彩虹竹含量測定的指標(biāo)成分進(jìn)行定量分析。

黃酮類化合物在七彩虹竹稈中的分布狀況：

利用3種黃酮類化合物顯色試劑對七彩虹竹的稈進(jìn)行的組織化學(xué)定位，探求黃酮類化合物的分布狀況，同時(shí)也為七彩虹竹的合理利用提供基礎(chǔ)。顯色結(jié)果為：黃酮類化合物分布于表皮層、表皮層內(nèi)方的機(jī)械組織和維管束周圍；在基本組織中也有零散的分布，在維管束原生韌皮部和原生木質(zhì)部中也有黃酮化類合物分布。前人譚玲玲等人對北柴胡營養(yǎng)器官中主要化學(xué)成分作了組織化學(xué)定位，結(jié)果表明，柴胡的黃酮類化合物在莖中分布在表皮、棱角處的厚角組織、皮層、髓射線和髓鞘細(xì)胞中(譚玲玲，2007)。李曉丹對藥用石韋的黃酮化合物的組織化學(xué)定位，結(jié)果表明藥用石韋的黃酮類化合物基本分布于葉柄的皮層厚壁組織、髓細(xì)胞、維管束鞘及韌皮部；在根狀莖中主要分布在表皮、髓細(xì)胞及韌皮部(李曉丹，2008)。這些前人的研究結(jié)果與本研究的結(jié)果相似，通過該研究能為探索竹類植物中黃酮類化合物的合成分布提供有效的理論基礎(chǔ)。

利用2種黃酮類化合物顯色試劑對七彩虹竹不同生長期稈中黃酮類化合物進(jìn)行染色，以探求黃酮類化合物在不同生長期稈中的分布和含量變化。七彩虹竹稈在不同時(shí)期中黃酮類化合物染色結(jié)果顯示，幼嫩的稈生長變?yōu)槌墒於挼倪^程中，表皮層中的熒光變化并不大，表皮層內(nèi)方的機(jī)械組織和維管束周圍的熒光均呈現(xiàn)一定的增長趨勢。由于竹類植物是木本植物，所以在用組織化學(xué)定位法對稈不同時(shí)期中黃酮類化合物的分布和含量的研究中，需要考慮到木質(zhì)素對其的影響。木質(zhì)素具有自發(fā)熒光特點(diǎn)和熒光染色現(xiàn)象，對黃酮類化合物的組織化學(xué)定位有很大的干擾。因此，也對七彩虹竹不同生長期稈中木質(zhì)素進(jìn)行組織化學(xué)定位，染色結(jié)果顯示：幼嫩的稈生長變?yōu)槌墒於挼倪^程中，表皮層內(nèi)方的機(jī)械組織和維管束周圍的木質(zhì)素均呈現(xiàn)一定的增長趨勢，但是木質(zhì)素組織化學(xué)定位后產(chǎn)生的紅色的增長趨勢比黃酮類化合物組織化學(xué)定位后的產(chǎn)生的熒光是增長趨勢更大。由此可以初步斷定，幼嫩的稈生長變?yōu)槌墒於挼倪^程中，七彩虹竹稈中的黃酮類化合物也在逐漸減少。

由于本實(shí)驗(yàn)之中涉及到熒光顯微鏡觀察技術(shù)，在該實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)了熒光淬滅的現(xiàn)象。熒光淬滅又稱熒光熄滅：是指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象。引起熒光淬滅的原因有很多，主要的有如下幾類：因熒光物質(zhì)的分子和熄滅劑分子碰撞而損失能量；熒光物質(zhì)的分子與熄滅劑分子作用生成了本身不發(fā)光的的配位化合物；溶解氧的存在，使得熒光物質(zhì)氧化，或是由于氧分子的順磁性，促進(jìn)了體系間跨越，使得激發(fā)單重態(tài)的熒光分子轉(zhuǎn)變至三重態(tài)；當(dāng)熒光物質(zhì)濃度過大時(shí),會(huì)產(chǎn)生自淬滅現(xiàn)象。因此，在切片制好后，應(yīng)隨即觀察。