本發(fā)明涉及新型微生態(tài)制劑應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1活菌制劑應(yīng)用于提高油雞生產(chǎn)性能。
背景技術(shù)：
飼用微生態(tài)制劑是采用農(nóng)業(yè)部認(rèn)可的動物腸道有益微生物經(jīng)發(fā)酵、純化、干燥而精制的復(fù)合生物制劑，是一種減少或替代抗生素的綠色生物添加劑。
本發(fā)明涉及的凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)Liu-g1是從傳統(tǒng)干酪中分離純化出來的一株具有產(chǎn)中性蛋白酶的芽孢桿菌。
1989年美國食品與藥物管理局(FDA)和美國飼料控制官員協(xié)會公布了可以直接飼喂且一般認(rèn)為是安全的微生物菌種名單共42種，其中包括凝結(jié)芽孢桿菌。我國農(nóng)業(yè)部《飼料添加劑品種目錄(2013)》發(fā)布的飼料添加劑包括凝結(jié)芽孢桿菌，可飼喂于肉雞、生長育肥豬和水產(chǎn)養(yǎng)殖動物。凝結(jié)芽孢桿菌為兼性厭氧菌，在有氧條件下有利于繁殖菌體，在無氧條件下產(chǎn)生大量乳酸。該菌既具有乳酸菌產(chǎn)乳酸的特性，又具有良好的抗逆性。其芽孢對高溫及低pH環(huán)境具有很強(qiáng)的耐受性，可順利通過胃腸道逆環(huán)境，并發(fā)揮良好的益生效果，因此可用于制備微生態(tài)制劑。
本發(fā)明涉及的產(chǎn)中性蛋白酶凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1用于發(fā)酵生產(chǎn)活菌制劑，可提高北京油雞對飼料的消化吸收，從而提高油雞的生產(chǎn)性能。此外，試驗研究表明，該菌還能分泌α-淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類，在消化道中與動物體內(nèi)的消化酶類共同發(fā)揮作用，從而提高飼料利用率。
目前，國內(nèi)申請凝結(jié)芽孢桿菌飼用專利，其
技術(shù)實現(xiàn)要素：
大多是飼用具有育肥作用的凝結(jié)芽孢桿菌，如發(fā)明專利CN 103255082A公開了“一株用于育肥豬養(yǎng)殖的優(yōu)良凝結(jié)芽孢桿菌及其應(yīng)用”，報道了飼喂凝結(jié)芽孢桿菌可以育肥仔豬；又如發(fā)明專利CN 103243043A公開了“一株用于改善次等豬苗養(yǎng)殖的優(yōu)良凝結(jié)芽孢桿菌及其應(yīng)用”，報道了一株凝結(jié)芽孢桿菌可改善豬苗的健康狀況，提高次等豬苗養(yǎng)殖的生產(chǎn)性能；又如發(fā)明專利CN 103205377A公開了“一株用于肉雞養(yǎng)殖的優(yōu)良凝結(jié)芽孢桿菌及其應(yīng)用”，報道了一株凝結(jié)芽孢桿菌能夠調(diào)節(jié)肉雞免疫能力、降低幼禽死亡率；又如發(fā)明專利CN 104403972A公開了“一株提高白羽肉雞生長性能的凝結(jié)芽孢桿菌”，報道了從健康家禽的消化道內(nèi)分離出的一株凝結(jié)芽孢桿菌能夠提高白羽肉雞生長性能，在白羽肉雞的日糧中添加該凝結(jié)芽孢桿菌可以降低白羽肉雞盲腸內(nèi)的大腸桿菌數(shù)目和氨態(tài)氮濃度，并提高盲腸食糜的微生物多樣性指數(shù)，同時降低了白羽肉雞的死淘率和料肉比，提高了試驗組肉雞的日增重。
目前有關(guān)凝結(jié)芽孢桿菌飼用育肥仔豬與提高白羽肉雞的生長性能的方法已見專利報道。但是，關(guān)于利用產(chǎn)中性蛋白酶的凝結(jié)芽孢桿菌活菌制劑飼喂北京油雞，提高北京油雞生產(chǎn)性能的方法，尚未見國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報道和專利報道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種提高北京油雞生產(chǎn)性能的方法。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
本發(fā)明所涉及的凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)Liu-g1，分離篩選自傳統(tǒng)干酪中，已于2015年5月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為：CGMCC No.10790。在腦心浸液(BHI)培養(yǎng)基上，凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1的菌落大小為2～4mm，灰白色、不透明、表面濕潤、邊緣不整齊，菌落表面初期(45℃，培養(yǎng)6～8h)扁平，后期皺褶凸起；菌體細(xì)胞呈大桿狀，長短不一，中生芽孢，G+好氧嗜熱菌。
為了確定凝結(jié)芽孢桿菌在提高北京油雞生產(chǎn)性能的作用，將該菌制成活菌制劑進(jìn)行動物試驗。
所述方法中，選擇體重相近、健康無病的4周齡的120只北京油雞，隨機(jī)分為4組，每組設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)有北京油雞10只；空白對照組不添加凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1活菌制劑，只飼喂基礎(chǔ)日糧；試驗組在基礎(chǔ)日糧中添加活菌數(shù)為7.4×1010CFU/g以上的凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1活菌制劑，并按低、中、高劑量活菌制劑，每個試驗組添加量分別為1g/kg·d、0.1g/kg·d、0.01g/kg·d。飼喂添加菌劑飼料的時間為每天上午8:00～9:00，提前將120只油雞禁食1h，確保其盡快將含菌飼料攝入，避免菌體在飼料中繁殖，以保證每日菌劑攝入量一致。采用三層階梯式單雞籠養(yǎng)雞舍飼養(yǎng)北京油雞，高床平養(yǎng)，每日光照16h?？販仫L(fēng)機(jī)縱向負(fù)壓通風(fēng)，飲水器為乳頭式，人工喂料，自由采食、自由飲水。正式試驗周期為4～14周齡。每兩周齡稱量油雞體重，并采集雞糞便樣品，測定其蛋白質(zhì)含量，同時測定糞便中雙歧桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的活菌數(shù)量。每兩周齡采集血清樣品，測定其血清蛋白含量。
所述方法中，動物試驗結(jié)果表明，將活菌數(shù)為7.4×1010CFU/g以上產(chǎn)中性蛋白酶的凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1活菌制劑添加到油雞基礎(chǔ)日糧中，添加量為0.1g/kg·d，飼喂含菌劑飼料至12～14周齡，可降低油雞死亡率至3.3％(空白對照組為20％)，顯著提高油雞體重，改善腸道菌群，促進(jìn)油雞腸道中雙歧桿菌有益菌的生長，而抑制沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等有害菌的生長，并利用凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1產(chǎn)中性蛋白酶的特性，達(dá)到顯著提高飼料蛋白利用率及提高油雞生產(chǎn)性能之目的。同時操作簡單，成本低廉，適合規(guī)?；B(yǎng)殖北京油雞。
上述方法，利用高活菌數(shù)產(chǎn)中性蛋白酶的凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1活菌制劑提高北京油雞生產(chǎn)性能的方法與專用生產(chǎn)菌株屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。
具體實施方式
下述實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明而不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為體積分?jǐn)?shù)。
實施例1、產(chǎn)中性蛋白酶的凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1活菌制劑的制備
1、菌種活化
將凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1斜面或平板培養(yǎng)物接種于裝有滅菌的5mL BHI培養(yǎng)基試管中，于45℃轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床培養(yǎng)12h活化培養(yǎng)一代。而后以2％的接種量移種于裝有滅菌的5mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基試管中，于37℃轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床培養(yǎng)48h活化培養(yǎng)二代，得到活化菌種。
凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方為(質(zhì)量體積比濃度，W/V)：1％葡萄糖，1％蛋白胨，0.2％NaCl，蒸餾水1000mL，pH 7.0。
2、高密度發(fā)酵
將1L發(fā)酵培養(yǎng)基裝入5L自動發(fā)酵罐中，活化好的Liu-g1菌種以2％的接種量移入發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度分批發(fā)酵，控制發(fā)酵溫度45℃，發(fā)酵液初始pH7.5，攪拌轉(zhuǎn)速180～220r/min，發(fā)酵時間48h，得到活菌數(shù)為(9.5～9.8)×109CFU/mL凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1發(fā)酵液。
凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(質(zhì)量體積比濃度，W/V)：1％玉米淀粉，1％大豆粕，0.2％碳酸鈣，蒸餾水1000mL，pH7.5。
3、活菌制劑的制備
取1L凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1發(fā)酵液于4℃、5000r/min離心15～20min，棄上清液，收集菌泥；將凍干保護(hù)劑分裝于600mL的凍干瓶中，每個凍干瓶裝量為100mL；每瓶加入1L發(fā)酵液離心所得的菌泥(即凍干保護(hù)劑∶離心前發(fā)酵液＝1∶10體積)，混合均勻后，得到濃縮活菌制劑；將濃縮活菌制劑于-36℃低溫冰箱中預(yù)凍12h至完全凍結(jié)狀態(tài)，得到預(yù)凍活菌制劑。利用6L LABCONCO真空冷凍干燥機(jī)(美國)將預(yù)凍活菌制劑于-55℃、真空度0.18mBar的條件下，凍干48h至完全干燥狀態(tài)，得到凍干活菌制劑，于-35℃低溫保藏待用。
以PCA瓊脂培養(yǎng)基傾注平板培養(yǎng)法測定凍干菌粉的活菌數(shù)量，取10-8、10-9、10-10三個稀釋度設(shè)3次重復(fù)，45℃恒溫箱培養(yǎng)12～16hh，計數(shù)活菌制劑中Liu-g1菌株的活菌數(shù)為7.4×1010CFU/g。
3、動物試驗
選擇體重相近、健康無病的4周齡的120只北京油雞，隨機(jī)分為4組，每組設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)有北京油雞10只；空白對照組不添加凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1活菌制劑，只飼喂基礎(chǔ)日糧；試驗組在基礎(chǔ)日糧中添加活菌數(shù)為7.4×1010CFU/g以上的凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1活菌制劑，并按低、中、高劑量活菌制劑，每個試驗組添加量分別為1g/kg·d、0.1g/kg·d、0.01g/kg·d。飼喂添加菌劑飼料的時間為每天上午8:00～9:00，提前將120只油雞禁食1h，確保其盡快將含菌飼料攝入，避免菌體在飼料中繁殖，以保證每日菌劑攝入量一致。
試驗采用三層階梯式單雞籠養(yǎng)雞舍飼養(yǎng)北京油雞，高床平養(yǎng)，每日光照16h。控溫風(fēng)機(jī)縱向負(fù)壓通風(fēng)，飲水器為乳頭式，人工喂料，自由采食、自由飲水。正式試驗周期為4～14周齡。每兩周齡稱量油雞體重，并采集雞糞便樣品，凱氏定氮法測定其蛋白質(zhì)含量，同時測定糞便中雙歧桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的活菌數(shù)量。每兩周齡采集血清樣品，測定其血清蛋白含量。試驗結(jié)果如下：
(1)油雞死亡率
表1凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1對油雞死亡率的影響
觀察死亡油雞生病期間排白色黏稠或淡黃、淡綠色稀便，萎靡不振，食量減少，最終死亡。試驗期間各劑量組油雞死亡率見表1。其中，中劑量組油雞死亡率最低，僅為3.3％，而空白對照組死亡率高達(dá)20.0％，遠(yuǎn)高于試驗組，說明基礎(chǔ)飼料中添加中劑量的凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1活菌制劑，可以抑制腸道致病菌的生長，而促進(jìn)腸道有益菌的生長。
(2)油雞體重
表2凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1對油雞體重的影響(n＝30)(g)
注：*代表與空白對照組比較P＜0.05，差異顯著。
體重是衡量機(jī)體對飼料利用的最直接指標(biāo)之一。由表2可見，基礎(chǔ)日糧中添加凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1活菌制劑試驗組與空白對照組油雞體重隨著飼喂周期的延長，逐漸顯示它們之間的差距。至12～14周齡，高、中劑量組的油雞體重顯著高于空白對照組(P＜0.05)，說明基礎(chǔ)日糧中添加高、中劑量的凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1活菌制劑，可以顯著提高油雞體重。
(3)油雞糞便蛋白質(zhì)含量
表3凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1對油雞糞便粗蛋白含量的影響(n＝15)(％)
注：*代表與空白對照組比較P＜0.05，差異顯著.
糞便中粗蛋白的含量越低說明油雞對飼料中蛋白質(zhì)的利用率越高。由表3可知，隨著飼喂凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1活菌制劑的周期時間延長，各試驗組油雞糞便中粗蛋白含量呈下降趨勢。至12～14周齡，高、中、低劑量組油雞的糞便粗蛋白含量顯著低于空白對照組(P＜0.05)，說明基礎(chǔ)日糧中添加高、中、低劑量的凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1活菌制劑，可以顯著提高油雞飼料的蛋白利用率。
(4)油雞糞便中雙歧桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的活菌數(shù)量
表4凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1對油雞腸道雙歧桿菌數(shù)量的影響(n＝15)(lg CFU/g)
由表4可知，隨著飼喂凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1活菌制劑的周期時間延長，各試驗組油雞糞便中雙歧桿菌的活菌數(shù)量呈上升趨勢。試驗組油雞糞便中雙歧桿菌的活菌數(shù)量均高于空白對照組。至8～14周齡，中劑量組雙歧桿菌的活菌數(shù)量達(dá)到106CFU/g以上，說明基礎(chǔ)日糧中添加中劑量的凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1活菌制劑，可以促進(jìn)油雞腸道中雙歧桿菌有益菌的生長，從而有利于改善腸道健康。
表5凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1對油雞腸道大腸桿菌數(shù)量的影響(n＝15)(lg CFU/g)
多數(shù)不致病的大腸桿菌是動物腸道中的正常棲居菌，其代謝活動能抑制腸道內(nèi)分解蛋白質(zhì)的微生物生長，減少蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物對機(jī)體的危害，還能合成維生素B和K，以及有殺菌作用的大腸桿菌素。由表5可知，隨著飼喂凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1活菌制劑的周期時間延長，各試驗組油雞糞便中大腸桿菌的活菌數(shù)量與空白對照組相比幾乎無差異，說明基礎(chǔ)日糧中添加高、中、低劑量的凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1活菌制劑，對油雞腸道中大腸桿菌幾乎沒有影響。
表6凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1對油雞腸道沙門氏菌數(shù)量的影響(n＝15)(lg CFU/g)
由表6可知，隨著飼喂凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1活菌制劑的周期時間延長，各試驗組油雞糞便中沙門氏菌活菌數(shù)量均低于空白對照組。其中，高、中劑量組油雞糞便中沙門氏菌的活菌數(shù)量低于空白對照組1～2個數(shù)量級，說明基礎(chǔ)日糧中添加高、中劑量的凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1活菌制劑，可以抑制腸道中沙門氏菌有害菌的生長，因而有利于改善腸道健康。
表7凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1對油雞腸道金黃色葡萄球菌數(shù)量的影響(n＝15)
(lg CFU/g)
由表7可知，隨著飼喂凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1活菌制劑的周期時間延長，各試驗組油雞糞便中金黃色葡萄球菌的活菌數(shù)量均低于空白對照組。至12～14周齡，高、中、低劑量組油雞糞便中金黃色葡萄球菌的活菌數(shù)量低于空白對照組1～2個數(shù)量級，說明基礎(chǔ)日糧中添加高、中、低劑量的凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1活菌制劑，可以抑制腸道金黃色葡萄球菌有害菌的生長，從而有利于改善腸道健康。
(5)油雞血清尿素氮含量
表8凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1對油雞血清尿素氮含量的影響(n＝10)(mmol/L)
注：*代表與空白對照組比較P＜0.05，差異顯著。
尿素氮是體內(nèi)蛋白質(zhì)分解代謝的主要產(chǎn)物之一，直接反映蛋白質(zhì)代謝水平和營養(yǎng)情況，其含量越低表明氮的利用率越高，即蛋白質(zhì)合成代謝加強(qiáng)，分解代謝降低。由表8可見，隨著飼喂凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1活菌制劑的周期時間延長，各試驗組油雞血清中尿素氮含量呈下降趨勢，至12～14周齡，中劑量組油雞血清中尿素氮含量顯著低于空白對照組(P＜0.05)，說明基礎(chǔ)日糧中添加中劑量的凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1活菌制劑，可以顯著降低油雞血清中尿素氮含量，可以促進(jìn)油雞對飼料中氮的利用率，加強(qiáng)機(jī)體蛋白質(zhì)合成，提高油雞的體重，故而提高油雞的生產(chǎn)性能。
綜上所述，動物試驗結(jié)果表明，本發(fā)明將活菌數(shù)為7.4×1010CFU/g以上產(chǎn)中性蛋白酶的凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1活菌制劑添加于北京油雞基礎(chǔ)日糧中，添加量為0.1g/kg·d，飼喂含菌劑飼料至12～14周齡，能夠降低油雞死亡率至3.3％(空白對照組為20％)，顯著提高油雞體重，改善腸道健康，促進(jìn)油雞腸道中雙歧桿菌有益菌的生長，而抑制沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等有害菌的生長，并利用凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1產(chǎn)中性蛋白酶的特性，顯著提高飼料蛋白利用率，加強(qiáng)機(jī)體蛋白質(zhì)合成，故而提高油雞的生產(chǎn)性能。顯示本發(fā)明所述凝結(jié)芽孢桿菌Liu-g1活菌制劑具有良好提高油雞生產(chǎn)性能的作用，對規(guī)?；曫B(yǎng)北京油雞具有較大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。
本專利所屬項目1：轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項“抗病轉(zhuǎn)基因羊新品種培育”
項目編號：2014ZX08008-005
項目起止時間：2014.01-2015.12
項目負(fù)責(zé)人：劉慧