本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，是一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效的研究外源基因在洋蔥內(nèi)表皮的亞細胞定位以及蛋白與蛋白互作的瞬時轉(zhuǎn)化方法。

背景技術(shù)：

目標基因的瞬時表達是分析生物學功能的一個簡單并且有用的的方法(Zhou et al.2009)?；虻乃矔r表達在研究蛋白功能例如蛋白活性分析、亞細胞定位以及蛋白與蛋白互作方面提供了非常有用的信息(Lee et al.2008；Ueki et al.2009；Hollender and Liu 2010)。與操作復(fù)雜、昂貴且費時的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體系相比(Scott et al.1999)，瞬時轉(zhuǎn)化的方法即快捷靈活又不影響染色體的位置并且可以用于高度分化的植物組織(Fischer et al.1999)。瞬時轉(zhuǎn)化已經(jīng)越來越多的被用于作為穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的補充，加速深入研究的進程(Wroblewski et al.2005)。

在研究基因功能上瞬時轉(zhuǎn)化可以作為穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的很好的補充，目前實施瞬時轉(zhuǎn)化主要的植物材料是煙草或者洋蔥。洋蔥作為單子葉植物，對于從單子葉植物中克隆的基因的亞細胞定位可信度可能更高，因此我們選擇洋蔥作為我們瞬時轉(zhuǎn)化體系建立的對象。洋蔥表皮細胞具有容易獲得、單層細胞、透明且無葉綠體干擾等優(yōu)點，是研究生理學活性、蛋白活性、細胞動力學、基因瞬時表達、蛋白亞細胞定位及蛋白與蛋白互作非常理想的實驗材料(Scott et al.1999；Walter et al.2004；Cheng et al.2009；Hollender and Liu 2010；Zhang et al.2011)。

基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法是目前瞬時轉(zhuǎn)化的主要方法?；驑尫ㄊ茌d體的限制較小并且可以用于單子葉植物和雙子葉植物組織，在洋蔥中常規(guī)的轉(zhuǎn)化方法主要是應(yīng)用基因槍法(Christou 1995；Eady et al.1996；Scott et al.1999；Arnim 2007；Cheng et al.2009；Hollender and Liu 2010)。但是，利用基因槍法進行轉(zhuǎn)化有轉(zhuǎn)化效率低、轉(zhuǎn)化過程昂貴并且受儀器設(shè)備及輔助材料的限制。

近年來，也有報道稱用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進行洋蔥瞬時轉(zhuǎn)化(Sun et al.2007；Xu et al.2014)。它的優(yōu)點是只需要常規(guī)的菌株、載體以及培養(yǎng)基不需要昂貴的儀器設(shè)備和金粉等，并且操作簡單，成本低，拷貝數(shù)低。但是目前的轉(zhuǎn)化效率還不是很高，體系的應(yīng)用上還沒有蛋白與蛋白互作方面成功的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明就是針對上述存在的缺陷而提供一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效洋蔥瞬時表達體系建立的方法。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是優(yōu)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥瞬時轉(zhuǎn)化體系，提高轉(zhuǎn)化效率。利用本發(fā)明體系首先可以快速的判斷新構(gòu)建的用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的帶有熒光蛋白標簽的載體是否有活性，避免穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的過程中浪費人力物力；同時還可以進行目標蛋白的亞細胞定位以及蛋白與蛋白的互作等工作，為基因功能的分析提供輔助手段。

本發(fā)明的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效洋蔥瞬時表達體系建立的方法通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：將洋蔥表皮細胞侵染在含有農(nóng)桿菌的侵染培養(yǎng)基中，20～22℃侵染10～20分鐘，光下培養(yǎng)24小時。

所述的侵染培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，通過調(diào)節(jié)葡萄糖和蔗糖的含量，增加了農(nóng)桿菌侵染液的滲透勢；同時添加0.01％的Silwet L-77，增加了農(nóng)桿菌在洋蔥表皮上的富集，提高了轉(zhuǎn)化效率。

所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效洋蔥瞬時表達體系建立的方法，包括以下步驟：

(1)取洋蔥內(nèi)表皮塊；

(2)含有目標基因的農(nóng)桿菌侵染培養(yǎng)基的配置：將活化一次的攜帶雙元載體的農(nóng)桿菌接種到10ml YEB液體培養(yǎng)基中，28℃200rpm搖動培養(yǎng)過夜；將菌液再次轉(zhuǎn)接到新鮮的10ml YEB液體培養(yǎng)基中，28℃200rpm搖動45小時，OD₆₀₀＝0.5～0.8；將菌液4℃低溫4000rpm離心6min后倒掉上清，用侵染培養(yǎng)基將菌體重懸致濃度OD₆₀₀＝0.3，添加Silwet L-77；

(3)洋蔥表皮侵染：在無菌條件下，將洋蔥內(nèi)表皮塊放到含有菌體的添加了Silwet L-77的侵染培養(yǎng)基中，輕輕晃動，侵染10～20min；侵染后將洋蔥表皮靠近葉肉的一側(cè)朝下放到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上；共培養(yǎng)培養(yǎng)皿放到光下20±2℃24個小時。

步驟(1)具體為：將洋蔥鱗莖，去除外層1～2層鱗葉，將洋蔥鱗莖消毒后在超凈工作臺內(nèi)用無菌水將鱗莖洗干凈，縱切開洋蔥鱗莖，取中層靠內(nèi)的較肥厚的鱗葉，在這些鱗葉內(nèi)部用解剖刀輕畫1cm²的十字方塊若干，撕下這些洋蔥內(nèi)表皮塊。

所述洋蔥鱗莖消毒是70～75％(體積濃度)的乙醇消毒。

步驟(2)中所述農(nóng)桿菌菌株為EHA105或GV3101(來自中科院植物所景海春課題組)。攜帶與GUS、GFP或YFP等報告基因融合的外源基因?qū)胙笫[表皮細胞。

步驟(2)中將活化一次的攜帶雙元載體的農(nóng)桿菌接種到10ml YEB液體培養(yǎng)基中，體積比為1:100，YEB液體培養(yǎng)基含有100μg/mL利福平、50μg/ml卡那霉素或者100μg/ml壯觀霉素，100μM乙酰丁香酮；

將菌液再次轉(zhuǎn)接到新鮮的10ml YEB液體培養(yǎng)基中，體積比1:10；YEB液體培養(yǎng)基含有100μM乙酰丁香酮。

步驟(2)中用侵染培養(yǎng)基將菌體重懸致濃度OD₆₀₀＝0.3，所用的侵染培養(yǎng)基為高粱浸染培養(yǎng)基，侵染培養(yǎng)基中添加0.01％的Silwet L-77。

添加了Silwet L-77的高粱侵染培養(yǎng)基每L包括以下成分：MS培養(yǎng)基4.43g，葡萄糖36g，蔗糖68.5g，MES培養(yǎng)基0.5g，Silwet L-770.01％(體積百分比)，乙酰丁香酮100μM，pH 5.8。

步驟(3)中共培養(yǎng)培養(yǎng)基為高粱共培養(yǎng)培養(yǎng)基，每L包括以下成分：MS培養(yǎng)基4.43g，葡萄糖10g，蔗糖20g，MES培養(yǎng)基0.5g，瓊脂8g,乙酰丁香酮100μM，pH 5.8

為了減少農(nóng)桿菌對洋蔥表皮細胞的侵害，使轉(zhuǎn)化效率更加穩(wěn)定，優(yōu)化了步驟(2)中侵染培養(yǎng)基中菌體的濃度，選擇侵染培養(yǎng)基菌體的濃度為OD₆₀₀＝0.3。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點：本發(fā)明的侵染培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，通過調(diào)節(jié)葡萄糖和蔗糖的含量，增加了農(nóng)桿菌侵染液的滲透勢；同時添加0.01％的Silwet L-77，增加了農(nóng)桿菌在洋蔥表皮上的富集，提高了轉(zhuǎn)化效率。

利用本發(fā)明體系首先可以快速的判斷新構(gòu)建的用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的帶有熒光蛋白標簽的載體是否有活性，避免穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的過程中浪費人力物力。

本發(fā)明不依賴于基因槍等昂貴的實驗材料，成本低；轉(zhuǎn)化過程簡單快捷，全程僅需2～3天；不受例如煙草、擬南芥等需要種植后才能轉(zhuǎn)化的植物材料的限制；轉(zhuǎn)化效率高達90％以上；可以進行較為準確的亞細胞定位研究和蛋白與蛋白互作的研究，為基因功能的分析提供輔助手段。

附圖說明

圖1所示為實施例1和實施例2中所用載體構(gòu)架；

圖2所示為實施例3中所用載體構(gòu)架；

圖3所示為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮瞬時轉(zhuǎn)化程序；其中，a：新鮮鱗莖，b：將鱗莖縱切開，c：洋蔥內(nèi)表皮切1cm2小塊，d：在離心管中對洋蔥表皮進行侵染，e：共培養(yǎng)，f：將共培養(yǎng)后洋蔥表皮放在載玻片上準備顯微觀察，標尺＝1cm；

圖4所示為實施例1p3300-GFP綠色熒光的表達；其中，a：p3300-GFP綠色熒光圖，b：明場，c：a與b疊加圖，d：空白對照(未轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細胞)，e：明場，f：d與e疊加圖，標尺＝100微米；

圖5所示為菌液濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響；

圖6所示為CWIN10B-mCherry融合蛋白在洋蔥表皮的亞細胞定位；a：p1300-CWIN10B-mCherry紅色熒光蛋白(質(zhì)壁分離圖)，b：明場，c：a與b疊加圖，d空白對照(未轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細胞)，e明場，f：d與e疊加圖；標尺＝100微米；

圖7所示為利用洋蔥表皮細胞檢測CYCH與CDKD；2的互作；a：pSPYNE-CYCH-YCHA/CDKD；2-YNEE蛋白與蛋白互作黃色熒光，b：明場，c：a與b疊加圖，d：pSPYNE-YCHA/YNEE陰性對照，無互作黃色熒光，e：明場，f：d與e疊加。

具體實施方式：

為了更好地理解本發(fā)明，下面用具體實例來詳細說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但是本發(fā)明并不局限于此。

實例1

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細胞亞細胞定位體系的優(yōu)化

(1)選取生長旺盛，活力強的洋蔥鱗莖，去除最外層1～2層鱗葉(圖3a)，將洋蔥鱗莖在70～75％乙醇中浸泡10分鐘消毒，然后在超凈工作臺內(nèi)用無菌水將鱗莖洗滌3-5次，用無菌解剖刀縱切開洋蔥鱗莖(圖3b)，取中層靠內(nèi)的較肥厚的鱗葉，在這些鱗葉內(nèi)表皮(凹面)用解剖刀輕畫約1cm²的十字方塊若干，撕下這些洋蔥內(nèi)表皮塊(圖3c)；

(2)以GFP為報告基因，優(yōu)化轉(zhuǎn)化體系。將GFP報告基因連入pCAMBIA3300載體中，構(gòu)建表達載體pCAMBIA3300-ubi-gfp雙元表達載體(圖1)。將該載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中，將經(jīng)鑒定為陽性克隆并活化一次的攜帶雙元載體的農(nóng)桿菌接種到10ml YEB液體培養(yǎng)基中(體積比1:100；含有100μg/mL利福平、50μg/ml卡那霉素、100μM乙酰丁香酮)，28℃200rpm搖過夜；將菌液再次轉(zhuǎn)接到新鮮的10ml YEB液體培養(yǎng)基中(體積比1:10；100μM乙酰丁香酮)，28℃200rpm搖4-5小時，OD₆₀₀＝0.5～0.8；將菌液4℃低溫4000rpm離心6min后倒掉上清，用侵染培養(yǎng)基SbIM、AtIM和TnIM(添加或不添加0.01％的Silwet L-77)(浸染培養(yǎng)基請見表1)將菌體重懸致濃度OD₆₀₀＝0.1、0.3和0.5。

(3)洋蔥表皮侵染：在無菌條件下，將5-10塊洋蔥內(nèi)表皮塊放到含有菌體的不同的侵染培養(yǎng)基中(侵染液放在2ml離心管中)(圖3d)，輕輕晃動，侵染10～20min。侵染后將洋蔥表皮靠近葉肉的一側(cè)朝下放到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上(SbCOM)(圖3e)。共培養(yǎng)培養(yǎng)皿放到光下20±2℃24個小時，將洋蔥表皮在無菌水中清洗幾遍，然后放到載玻片上，蓋上蓋玻片(圖3f)，在激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果如圖4所示，洋蔥表皮細胞有明顯的綠色熒光表達(見說明書附圖圖4)。由圖5柱狀圖我們可以看出，當菌液濃度為OD₆₀₀＝0.3時，轉(zhuǎn)化效率高達92％以上，顯著高于OD₆₀₀＝0.1時，與OD₆₀₀＝0.3時差異不顯著(見說明書附圖圖5)。為提高轉(zhuǎn)化效率，本發(fā)明優(yōu)化了步驟(2)中侵染培養(yǎng)基的組成，所述農(nóng)桿菌侵染培養(yǎng)基和共培養(yǎng)培養(yǎng)基見表1；IM侵染培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，通過調(diào)節(jié)葡萄糖和蔗糖的含量，增加了農(nóng)桿菌侵染液的滲透勢；同時添加0.01％的Silwet L-77，增加了農(nóng)桿菌在洋蔥表皮上的富集，提高了轉(zhuǎn)化效率(如表2所示)。

為了減少農(nóng)桿菌對洋蔥表皮細胞的侵害，使轉(zhuǎn)化效率更加穩(wěn)定，優(yōu)化了步驟(2)中侵染培養(yǎng)基中菌體的濃度，選擇侵染培養(yǎng)基菌體的濃度為OD₆₀₀＝0.3。

表1不同侵染培養(yǎng)基及共培養(yǎng)培養(yǎng)基(SbCOM)

注：SbIM(高粱侵染培養(yǎng)基)，SbIM+s(高粱侵染培養(yǎng)基添加了Silwet L-77)，SbCOM(高粱共培養(yǎng)培養(yǎng)基)，TnIM(煙草侵染培養(yǎng)基)，TnIM+s(煙草侵染培養(yǎng)基添加了Silwet L-77)，AtIM(擬南芥侵染培養(yǎng)基)，AtIM+s(擬南芥侵染培養(yǎng)基添加了Silwet L-77)。

表2不同侵染培養(yǎng)基及不同侵染時間對洋蔥轉(zhuǎn)化效率的影響

注：大寫字母A-D表示轉(zhuǎn)化效率在0.01顯著水平上差異極顯著，小寫字母a-e表示轉(zhuǎn)化效率在0.05水平上差異顯著，利用SPSS13統(tǒng)計分析軟件及Duncan方法對不同處理間轉(zhuǎn)化效率進行顯著性差異分析；+s：培養(yǎng)基中添加Silwet L-77。

由表格可知，高粱侵染培養(yǎng)基添加了Silwet L-77的轉(zhuǎn)化效率高達90％,遠高于其他侵染培養(yǎng)基,同時也遠高于高粱侵染培養(yǎng)基未添加Silwet L-77的50～60％的轉(zhuǎn)化效率。

實施例2

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細胞的轉(zhuǎn)化方法應(yīng)用于蛋白亞細胞定位的研究

(1)選取生長旺盛，活力強的洋蔥鱗莖，去除最外層1～2層鱗葉(圖3a)，將洋蔥鱗莖在70～75％乙醇中浸泡10分鐘消毒，然后在超凈工作臺內(nèi)用無菌水將鱗莖洗滌3～5次，用無菌解剖刀縱切開洋蔥鱗莖(圖3b)，取中層靠內(nèi)的較肥厚的鱗葉，在這些鱗葉內(nèi)表皮(凹面)用解剖刀輕畫約1cm²的十字方塊若干，撕下這些洋蔥內(nèi)表皮塊(圖3c)；

(2)以mCherry為報告基因，將CWIN10B連入pCAMBIA1300-mCherry載體中，構(gòu)建表達載體pCAMBIA1300-CWIN10B-mCherry雙元表達載體(圖1)。將該載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101中，將經(jīng)鑒定為陽性克隆并活化一次的攜帶雙元載體的農(nóng)桿菌接種到10ml YEB液體培養(yǎng)基中(體積比1:100；含有100μg/mL利福平、50μg/ml卡那霉素，100μM乙酰丁香酮)，28℃200rpm搖過夜；將菌液再次轉(zhuǎn)接到新鮮的10ml YEB液體培養(yǎng)基中(體積比1:10；100μM乙酰丁香酮)，28℃200rpm搖4～5小時，OD₆₀₀＝0.5～0.8；將菌液4℃低溫4000rpm離心6min后倒掉上清，用侵染培養(yǎng)基SbIM(添加0.01％的Silwet L-77)(表1)將菌體重懸致濃度OD600＝0.3。

(3)洋蔥表皮侵染：在無菌條件下，將5～10塊洋蔥內(nèi)表皮塊放到含有菌體的不同的侵染培養(yǎng)基中(侵染液放在2ml離心管中)(圖3d)，輕輕晃動，侵染10-20min。侵染后將洋蔥表皮靠近葉肉的一側(cè)朝下放到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上(SbCOM)(圖3e)。共培養(yǎng)培養(yǎng)皿放到光下20+2℃24個小時，將洋蔥表皮在無菌水中清洗幾遍，然后放到載玻片上，蓋上蓋玻片(圖3f)，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示CWIN10B蛋白定位在細胞壁上(圖6)。

該實施例說明了此方法可以快速的進行較為準確的基因亞細胞定位研究

實施例3

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細胞的轉(zhuǎn)化方法應(yīng)用于蛋白與蛋白互作的研究

(1)選取生長旺盛，活力強的洋蔥鱗莖，去除最外層1～2層鱗葉(圖3a)，將洋蔥鱗莖在70～75％乙醇中浸泡10分鐘消毒，然后在超凈工作臺內(nèi)用無菌水將鱗莖洗滌3～5次，用無菌解剖刀縱切開洋蔥鱗莖(圖3b)，取中層靠內(nèi)的較肥厚的鱗葉，在這些鱗葉內(nèi)表皮(凹面)用解剖刀輕畫約1cm²的十字方塊若干，撕下這些洋蔥內(nèi)表皮塊(圖3c)；

(2)將CYCH和CDKD；2分別連入pSPYNE-YCHA和pSPYNE-YNEE載體中構(gòu)成pSPYNE-CYCH-YCHA/CDKD；2-YNEE載體，pSPYNE-YCHA和pSPYNE-YNEE空載作為陰性對照(圖2)。將所有載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中，將經(jīng)鑒定為陽性克隆并活化一次的攜帶雙元載體的農(nóng)桿菌接種到10ml YEB液體培養(yǎng)基中(體積比1:100；含有100μg/mL利福平、50μg/ml卡那霉素，100μM乙酰丁香酮)，28℃200rpm搖過夜；將菌液再次轉(zhuǎn)接到新鮮的10ml YEB液體培養(yǎng)基中(體積比1:10；100μM乙酰丁香酮)，28℃200rpm搖4～5小時，OD₆₀₀＝0.5～0.8；將菌液4℃低溫4000rpm離心6min后倒掉上清，用侵染培養(yǎng)基SbIM(添加0.01％的Silwet L-77)(表1)將菌體重懸致濃度OD₆₀₀＝0.3。

(3)洋蔥表皮侵染：在無菌條件下，將5～10塊洋蔥內(nèi)表皮塊放到含有菌體的不同的侵染培養(yǎng)基中(侵染液放在2ml離心管中)(圖3d)，輕輕晃動，侵染10～20min。侵染后將洋蔥表皮靠近葉肉的一側(cè)朝下放到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上(SbCOM)(圖3e)。共培養(yǎng)培養(yǎng)皿放到光下20±2℃24個小時，將洋蔥表皮在無菌水中清洗幾遍，然后放到載玻片上，蓋上蓋玻片(圖3f)，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，結(jié)果表明轉(zhuǎn)了pSPYNE-CYCH-YCHA/CDKD；2-YNEE的洋蔥表皮細胞在細胞核和細胞質(zhì)中出現(xiàn)了強烈的黃色熒光，陰性對照中沒有熒光出現(xiàn)(圖7)。

該實施例證明了本發(fā)明技術(shù)方案可應(yīng)用于較為準確的蛋白與蛋白互作的研究。