本申請是申請?zhí)枮?01280021463.5、申請日為2012年3月1日、發(fā)明名稱為“具有功能失調(diào)的t3ss蛋白的抗菌性轉(zhuǎn)基因植物”的中國發(fā)明專利申請的分案申請，原申請為國際申請?zhí)枮閜ct/il2012/050069的國家階段申請，該國際申請要求申請日為2011年3月2日，申請?zhí)枮?1/448,223的美國申請的優(yōu)先權。

本發(fā)明，在其些實施方式中，涉及抗菌性植物及制備所述植物的方法。

發(fā)明背景

青枯雷爾氏菌(rs)，是一種分布廣泛的革蘭氏陰性的土壤傳播性病原體，它屬于β-亞門的蛋白菌，能導致超過200種植物的致死性萎蔫疾病，這些植物包括重要的經(jīng)濟作物，例如番茄，馬鈴薯和香蕉。細菌通過傷口進入植物根部，侵入木質(zhì)部并通過脈管系統(tǒng)迅速蔓延至植物的氣生部位。莖上很快可以發(fā)現(xiàn)超過10¹⁰每厘米的細胞群。rs的主要毒力因子是表多糖(eps)，一種長的(超過106da)糖聚合物。表多糖能堵塞木質(zhì)部并導致萎蔫癥狀，并最終導致植物死亡。

rs具有突出的蛋白分泌能力，其能分泌超過100種蛋白質(zhì)。例如，ii型分泌系統(tǒng)(t2ss)分泌因子，包括植物細胞壁降解果膠酶，內(nèi)切葡聚糖酶，以及最近發(fā)現(xiàn)的，毒力eps(圖1a-c)。iii型分泌系統(tǒng)(t3ss)分泌促感染效應蛋白(t3e)進入宿主細胞，以優(yōu)化宿主環(huán)境，并抑制入侵后的植物防御反應(圖1a-c)。

iii型分泌系統(tǒng)(t3ss)是革蘭氏陰性菌的一個復雜的分子機器，其能將細菌蛋白(效應器)“注入”(轉(zhuǎn)移入)真核細胞。為此，t3ss必須組裝成一個多蛋白復合物，它由不同的部分組成：跨越兩個細菌細胞膜與細胞質(zhì)莖相連接的基體；連接在基體上的類似于分子注射器(注射體(injectisome)/菌毛)的針狀結(jié)構；和能夠重組成易位子的遠端針尖結(jié)構。易位子是一種蛋白質(zhì)復合物結(jié)構，其能插入宿主細胞的膜。菌毛僅由一種蛋白亞基組成。多個亞基寡聚成菌毛結(jié)構。所述針狀結(jié)構，使細菌蛋白能通過所述針的內(nèi)部通道(導管)被輸送至宿主細胞(圖1a-c)。

因此，t3ss的主要胞外成分是從所述裝置的外膜部分延伸的針，并且通過該針形成的通道以形成分泌導管(所述針的螺旋參數(shù)為每轉(zhuǎn)5.5亞基；每亞基軸向上升)。所述針是由單種小蛋白(9kda)的多個副本(大約100-150)的螺旋組件形成。雖然大多數(shù)革蘭氏陰性菌的菌毛結(jié)構單元的一級序列之間幾乎沒有同源性，但據(jù)信它們大多數(shù)具有某些結(jié)構同源性。在植物病原細菌中，t3ss由hrp(過敏性反應和致病性)基因編碼，這樣命名是因為它們都是細菌在易感植物中引起疾病，并在抗性植物中誘導過敏性反應所必須的。幾乎在所有主要的革蘭氏陰性細菌植物病原體中(如丁香假單胞菌，黃單胞菌，青枯雷爾氏菌，和歐文氏菌)已發(fā)現(xiàn)hrp基因，這也說明t3ss在調(diào)節(jié)不同的植物與細菌間相互作用中的核心作用。因此，通常情況下，t3ss外菌毛的組裝是通過主要組分(例如青枯雷爾氏菌的hrpy，丁香假單胞菌和解淀粉歐文氏菌的hrpa，野油菜黃單胞菌的hrpe，志賀氏菌的mxih，沙門氏菌的prgi和耶爾森氏菌的yscf)的逐步聚合而成。

如前所述，雖然iii型效應器的主要功能是促進植物的易感性，一些效應器被能觸發(fā)防御反應的植物抗性蛋白所識別，防御反應包括過敏性反應。所提供的一種克服革蘭氏陰性菌所導致的植物致死性感染的方法，包括增強植物對此類病原體的免疫力。

美國專利申請?zhí)?0090258825(he等)公開了用于增強植物抵御病原體(如細菌病原體)的組合物和方法。根據(jù)其教導，通過增加atmin相關的植物保護蛋白，如atmin7的活性，可有效增強植物針對丁香假單胞菌毒力蛋白hopm1的免疫力。

美國專利申請?zhí)?0090044296(beer等)公開了增加植物生長或賦予植物抗病性的方法，所述方法通過使用適于增加或減少核酸分子表達的核酸分子，所述核酸分子編碼hrpn相互作用蛋白(例如hipm)。其中所公開的缺失分析顯示了解淀粉歐文氏菌hrpn(harpin)的198個氨基酸的n-末端區(qū)為與hipm相互作用所必需。這一hrpn的n-末端區(qū)為首次發(fā)現(xiàn)的無細胞過敏性反應激發(fā)劑，其在所述病原體的毒性中起著關鍵作用。

此外，由于其病原體所具有土壤傳播的性質(zhì)，細菌性萎蔫病較難控制。在rs感染的植物中，疾病的發(fā)展取決于ii型和iii型蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)的作用，并且這些系統(tǒng)中的一個突變將產(chǎn)生非致病性細菌[poueymiro等，curr.opin.microbiol.(2009)12:44-52]。

roine等[roine等，febsletters(1997)417(2):168-172]表明，一旦純化，hrpa，即丁香假單胞菌蕃茄致病變種(pseudomonassyringaepv.tomota)dc3000菌毛的結(jié)構蛋白，其本身就足以通過自組裝形成絲結(jié)構。

taira等[taira等，molmicrobiol.(1999)34(4):737-44]在hrpa基因處產(chǎn)生插入突變(例如，插入五肽)，并產(chǎn)生相應表達的突變細菌。根據(jù)其教導，hrpa的羧基末端區(qū)對于菌毛組裝以及細菌與受影響的植物間相互作用是至關重要的。此外，wei等[wei等，pnas(2000)97(5):2247-2252]鑒定了在hrpa羧基端影響hrpa蛋白分泌或調(diào)節(jié)功能的三個單氨基酸突變。這些結(jié)果證明了hrp菌毛結(jié)構基因在蛋白分泌和丁香假單胞菌的iii型分泌系統(tǒng)的協(xié)同調(diào)節(jié)中的關鍵作用。此外，lee等[lee等,j.bio.chem.(2005):21409-17]公開了一些五肽誘導的非功能hrpa蛋白，當其在細菌中表達時，對野生型hrpa蛋白的功能產(chǎn)生強大的顯性負性作用，從而阻斷丁香假單胞菌誘導宿主反應并導致體內(nèi)疾病的能力。顯性負性hrpa突變體也能干擾野生型hrpa在體外自組裝成菌毛。

weber等[weber和koebnik,j.bacteriology(2005)187(17):6175-6186]描述了若干hrp菌毛蛋白的疏水性繪圖分析，所述hrp菌毛蛋白例如野油菜黃單胞菌瘡痂病菌的hrpe和hrpa，以及青枯雷爾氏菌的hrpy，并發(fā)現(xiàn)了一個共同的結(jié)構域組織。這些結(jié)果表明，植物致病細菌，為了克服植物細胞壁的障礙，獨立地進化出結(jié)構上類似的蛋白。weber等進一步公開了hrpec-端區(qū)域的五肽插入突變體能抑制hrp菌毛在野油菜黃單胞菌瘡痂病菌中的組裝。形態(tài)學研究揭示了這些插入突變體具有縮短的hrp菌毛。此顯性負性作用表明，該突變體可能干擾了hrp菌毛的組裝。美國專利申請?zhí)?0100249234(yang等)公開了降低細菌毒力的方法，如hrpx/hrpy型系統(tǒng)或t3ss型系統(tǒng)。該方法包括將細菌與有效量的苯丙烷型抑制化合物相接觸。

美國專利申請?zhí)?0100099674(elofsson等)公開了在植物中降低細菌毒力的方法，其通過n-取代的7-喹啉基甲基胺抑制iii型分泌系統(tǒng)，特別地，其中一個是喹啉環(huán)上5-和8-位進一步被取代。

其它

背景技術：
包括美國專利申請?zhí)?0050076406。

發(fā)明概述

本發(fā)明實施方式的一方面，提供了一種核酸表達載體，所述核酸表達載體包含核酸序列和順式作用調(diào)控元件，所述核酸序列編碼顯性負性t3ss蛋白，所述順式作用調(diào)控元件能夠驅(qū)動所述核酸序列在植物細胞中轉(zhuǎn)錄，所述顯性負性t3ss蛋白介導功能失調(diào)的針狀復合物的組裝。

本發(fā)明實施方式的一方面，提供了包含核酸序列的分離的多核苷酸，所述核酸序列編碼如seqidno：2，4，6，8，10或12所示的序列。

本發(fā)明實施方式的一方面，提供了包含分離的多核苷酸的核酸表達載體，所述多核苷酸包含核酸序列，所述核酸序列編碼如seqidno：2，4，6，8，10或12所示的序列。

本發(fā)明實施方式的一方面，提供了包含所述核酸表達載體的宿主細胞。

本發(fā)明實施方式的一方面，提供了包含所述核酸表達載體的基因修飾植物。

本發(fā)明實施方式的一方面，提供了表達外源多核苷酸的基因修飾植物，所述外源多核苷酸編碼如seqidno：2，4，6，8，10或12所示的顯性負性t3ss蛋白。

本發(fā)明實施方式的一方面，提供了生成植物的方法，所述植物與未修飾的植物相比，包含針對細菌病原體的增強的抗性，所述方法包括將所述核酸表達載體引入植物或植物細胞，由此生成的植物與未修飾的植物相比，包含針對細菌病原體的增強的抗性。

評價植物針對細菌病原體的抗性的方法，所述方法包括：(a)在植物中表達外源核酸序列和順式作用調(diào)控元件，所述外源核酸序列編碼顯性負性t3ss蛋白，所述順式作用調(diào)控元件能夠驅(qū)動所述核酸序列在植物細胞中轉(zhuǎn)錄；(b)使細菌病原體作用于所述植物；和(c)比較所述植物和野生型植物的疾病，所述野生型植物被培養(yǎng)于相同條件下并被所述細菌病原體感染，由此評價所述植物針對所述細菌病原體的抗性。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述核酸序列包含seqidno:1，3，5，7，9或11。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述核酸序列包含seqidno:20-65。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述核酸序列編碼如seqidno：2，4，6，8，10或12所示的多肽。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述核酸表達載體還包含附加核酸序列，所述附加核酸序列編碼位于所述核酸序列上游的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號肽。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述順式作用調(diào)控元件包含啟動子序列。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述啟動子序列是組成型啟動子。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述組成型啟動子是camv35s啟動子。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述顯性負性t3ss蛋白通過引入突變而產(chǎn)生，所述突變選自插入突變、缺失突變和取代突變。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述插入突變包含嵌入閉鎖元件。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述t3ss蛋白是t3ss結(jié)構蛋白。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述t3ss結(jié)構蛋白是hrp蛋白。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述t3ss蛋白選自青枯雷爾氏菌hrpy蛋白，丁香假單胞菌hrpa蛋白，解淀粉歐文氏菌hrpa蛋白，野油菜黃單胞菌hrpe蛋白，亞洲梨火歐文氏菌hrpa蛋白和白葉枯黃單胞菌hrpe蛋白。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述t3ss蛋白是青枯雷爾氏菌易位子蛋白。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述青枯雷爾氏菌易位子蛋白選自popf1和popf2。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述宿主細胞是植物細胞。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述植物與未修飾的植物相比，包含針對細菌病原體的增強的抗性。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述細菌病原體是革蘭氏陰性菌。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述革蘭氏陰性菌選自青枯雷爾氏菌，丁香假單胞菌，解淀粉歐文氏菌，野油菜黃單胞菌和白葉枯黃單胞菌。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述革蘭氏陰性菌是變形菌種。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述變形菌是青枯雷爾氏菌。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述植物選自作物植物，裝飾植物和樹。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述植物選自番茄植物，馬鈴薯植物，茄植物，香蕉植物，甜椒植物，橄欖植物，蘋果植物，梨植物，火棘植物，海棠植物，山楂植物，栒子植物，榲桲植物，花楸植物，擬南芥植物，天竺葵，姜植物，煙草植物及桉樹植物。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述植物是番茄植物。

除非特別定義，本文所使用的所有技術和/或科學術語的含義與本發(fā)明所屬領域內(nèi)普通技術人員通常理解的含義相同。下文描述了實施本發(fā)明的示例性的方法和/或材料，但是在實施或測試本發(fā)明的實施方式時，可以使用與本文所述相似或等同的方法和材料。萬一有沖突時，以本發(fā)明的說明書，包括定義，為準。此外，所述材料、方法和實施例僅用于舉例說明，并不一定為了限制。

附圖簡述

僅通過舉例，并且參考所附附圖，本文描述了本發(fā)明的一些實施方式。在具體參考附圖時，需要特別注意的是，通過例子顯示的細節(jié)僅僅是為了舉例討論本發(fā)明的實施方式。在這方面，說明書和附圖一起向本領域技術人員清楚地展示了可以怎樣實施本發(fā)明的實施方式。

附圖中：

圖1a說明了革蘭氏陰性菌的ii型分泌系統(tǒng)(t2ss)、iii型分泌系統(tǒng)(t3ss)和iv型菌毛。該圖摘自donnenbergm.s.,nature(2000)406:768-774。

圖1b-c摘自buttner和he,plantphysiology(2009)150:1656-64，說明了植物病原菌(圖1b)和動物病原菌(圖1c)的t3ss復合物。分泌裝置跨越細菌細胞膜并與細胞質(zhì)atp酶相聯(lián)。植物病原菌具有理論上能跨越植物細胞壁的菌毛。動物病原菌具有短的針狀結(jié)構，其通過所謂尖端復合物(在植物病原體中則缺失)與易位子相連接。易位子在宿主質(zhì)膜中形成通道，并允許效應器蛋白轉(zhuǎn)運進所述宿主細胞的胞液中。

圖2a-f的圖顯示了青枯雷爾氏菌(rs)hrpy蛋白(seqidno：14)與志賀氏菌t3ss針狀單體mxih(seqidno：15，圖2a)，志賀氏菌mxih的結(jié)構模型(圖2b-e)和整體針狀結(jié)構(圖2f)的比對。mxih和針狀結(jié)構的圖摘自deane等，pnas2006103：12529-33。

圖3a-e的圖片顯示了顯性負性蛋白t3ss嵌入閉鎖元件1(t3ssibe1)(圖3a，seqidno：2)和2(t3ssibe2)(圖3c，seqidno：4)，t3ssibe1和2的結(jié)構的預測模型(分別為圖3b和3d)，針和針狀導管相互作用的模型(圖3e)和來自sp|q56yt0|lac3_at漆酶或tr|q6tds6|q6tds6_gosar分泌漆酶棉屬arboreum的植物分泌信號(分別為seqidno：16和17)。圖3b，3d和3e摘自deane等，pnas2006103：12529-33。

圖4a-c的圖片顯示了顯性負性蛋白t3ss嵌入閉鎖元件3(圖4a，seqidno：6)，t3ssibe3結(jié)構的預測模型(圖4b)和與針的相互作用模型(圖4c)。圖4b和4c摘自deane等，pnas2006103：12529-33。

圖5a-c的圖片顯示了顯性負性蛋白t3ss嵌入閉鎖元件4(圖5a，seqidno：8)，閉鎖元件的預測模型(圖5c)，和針(圖5b)。圖5b和5c摘自deane等，pnas2006103：12529-33。值得注意的是，重復的尾部可能會與不同單體相互作用，干擾和阻斷所述針通道。

圖6a-d的圖片顯示了顯性負性蛋白t3ss嵌入閉鎖元件5(圖6a，seqidno：10)和6(圖6c，seqidno：12)和t3ss嵌入閉鎖元件5和6的結(jié)構的預測模型(圖6b和6d)。值得注意的是，hrpy的頭部和尾部α-螺旋被脯氨酸破壞，這樣的形變可能會阻斷針的通道并干擾針的功能。圖6b和6d摘自deane等，pnas2006103：12529-33。

圖7a-c的圖片顯示了不同的青枯雷爾氏菌(rs)hrpy顯性負性蛋白。圖7a顯示了t-dna克隆圖。通過xbai和saci位點，每個嵌入閉鎖元件(ibe)被克隆至camv35s啟動子的下游和nos終止子的上游。圖7b顯示了與針狀結(jié)構相互作用的模型，圖7c顯示了不同的hrpy突變(seqidno:2，4，6，8，10和12)。圖7b摘自deane等，pnas2006103：12529-33。

圖8的圖片摘自taira等，molmicrobiol.(1999)34(4):737-44，其顯示了插入突變以及它們在hrpa基因(seqidno：18)中的位置。簡單的說，496bpbamhi±ecori片段編碼hrpa菌毛，片段中的突變插入位點用棒糖形標記表示，標記上的數(shù)字表示突變號。每個插入包括10個來自轉(zhuǎn)座子的堿基對，在其上游的5個堿基對在所述10個堿基對的下游向遠端重復。氨基酸序列(seqidno：19)寫在核苷酸序列下面。啟動子中的hrp盒用方框表示；假設的核糖體結(jié)合位點以下劃線表示。氨基末端蛋白的加工位點用氨基酸序列下方的箭頭標記。帶箭頭的方框突變號表示四個缺失突變的起始和終點。

圖9是青枯雷爾氏菌hrpy多肽變體(即菌株間微小的序列變化，seqidno:14和70-86)的比對。

10a-c的圖片顯示了番茄植物的pcr和sqrt-pcr分析，所述番茄植物表達萎蔫抗性(wiltr)hrpy突變6。用構建體轉(zhuǎn)化番茄植物，所述構建體攜帶hrpy突變6，并且用基因組pcr和半定量rt-pcr對植物進行進一步分析。檢測到這些hrpy突變的表達。

圖11a-c的圖片顯示了表達萎蔫抗性(wiltr)hrpy突變1的番茄植物的pcr和sqrt-pcr分析。用攜帶hrpy突變1的構建體轉(zhuǎn)化番茄植物，并用基因組pcr和半定量rt-pcr對植物進行進一步分析。檢測到這些hrpy突變的表達。

圖12a-c的圖片顯示了番茄植物的pcr和sqrt-pcr分析，番茄植物表達萎蔫抗性(wiltr)hrpy突變2。用攜帶hrpy突變2的構建體轉(zhuǎn)化番茄植物，并且用基因組pcr和半定量rt-pcr對植物進行進一步分析。檢測到這些hrpy突變的表達。

本發(fā)明具體實施方式的說明

本發(fā)明，在一些實施方式中，涉及抗菌性植物及制備所述植物的方法。

通過參考附圖和所附描述可以更好的理解本發(fā)明的原理和操作。

在對本發(fā)明的至少一個實施方式進行詳細說明前，應當理解，本發(fā)明的應用并不一定限于如下文描述或由實施例所舉例說明的細節(jié)。本發(fā)明可以有其它實施方式或以各種方式來實施或執(zhí)行。同樣地，也應理解，本文所用的措辭和術語是用于描述的目的，不應該被理解為用于限制。

在完成本發(fā)明的一些實施方式時，本發(fā)明的發(fā)明人制備了顯性負性細菌iii型蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)(t3ss)蛋白，它在植物細胞中表達并從中分泌。本發(fā)明的所述新型顯性負性t3ss蛋白在其組裝過程中嵌入t3ss針狀結(jié)構中，并阻斷細菌針狀結(jié)構通道，從而保護植物不受細菌感染。

本發(fā)明的顯性負性t3ss蛋白的設計是基于保留并利用了天然t3ss蛋白(例如hrpy)亞單位-亞單位間的相互作用位點，并整合了通過蛋白翻譯形成的融合的通道阻斷肽或t3ss蛋白的變形結(jié)構(例如hrpyα-螺旋)，從而阻止細菌效應器從細菌分泌到植物細胞中。加入其中的植物分泌信號允許植物細胞中表達顯性負性蛋白并從植物細胞中分泌出來。當細菌菌毛在靠近植物細胞壁處組裝時，分泌的顯性負性t3ss蛋白能接近正在組裝的菌毛。因此，如下文實施例部分中所示，本發(fā)明的發(fā)明人制備了革蘭氏陰性菌t3ss針通道(t3ss-ibe)的嵌入閉鎖元件。通過hrpy蛋白(seqidno：14)的結(jié)構修飾，產(chǎn)生青枯雷爾氏菌的t3ss-ibe(seqidno：2，4，6，8，10和12)，所述hrpy蛋白為rs針狀結(jié)構的結(jié)構單元。本發(fā)明進一步產(chǎn)生了表達載體，所述表達載體包含這些用于轉(zhuǎn)化植物細胞的t3ss-ibe。此外，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)示出用青枯雷爾氏菌hrpy突變體1，2或6轉(zhuǎn)化番茄植物，及其表達(分別參見圖11a-c，圖12a-c和圖10a-c)。此外，本發(fā)明構思轉(zhuǎn)基因植物中修飾的rs易位子蛋白(popf1)的過表達。這些蛋白的過表達能阻斷t3ss的組裝，這是由于這些蛋白能與不成熟的針狀結(jié)構相互作用，并因此導致其失活。因此，修飾的popf1蛋白被整合入易位子門并將其阻斷?？偠灾景l(fā)明的教導可以在用于產(chǎn)生抗菌性植物的農(nóng)業(yè)領域中作為有力工具。

因此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種制備植物的方法，所述植物與未修飾的植物相比，包含針對細菌病原體的增強的抗性，該方法包括將所述核酸表達載體引入植物或植物細胞，由此制備的植物，與未修飾的植物相比，包含針對細菌病原體的增強的抗性。

本文所用的術語“植物”包括整個植物，所述植物的先代和后代和植物部分，包括種子，芽，莖，根(包括塊莖)，植物細胞，組織和器官。植物可以是任何形式的，包括懸浮培養(yǎng)物，胚胎，分生組織區(qū)，愈傷組織，葉，配子體，孢子體，花粉和小孢子。在本發(fā)明所述方法中特別有用的植物包括所有屬于超家族植物界的植物，特別是單子葉和雙子葉植物，包括草料或飼料豆科，觀賞植物，糧食作物，樹，或灌木植物，其選自相思樹屬，宏基屬，獼猴桃屬，七葉樹屬，貝殼杉蘆葦，合歡阿馬拉，桫三色，須芒草屬，花生屬，檳榔，阿斯特瑞雅(astelia)桂花，黃芪鷹嘴豆，多小葉紅蘇木，樺屬，蕓苔屬，艷紫鉚木欖，伯克蘇森，灰樹花，傘形科植物(cadabafarinose)，朱櫻花屬，茶樹，美人蕉，辣椒屬，槐屬，距瓣豆屬毛竹,木瓜屬，肉桂，小果咖啡，可樂豆木，繡球小冠花，栒子黑櫻桃，山楂屬，黃瓜屬，柏木屬，桫欏荊，榅桲，柳杉，香茅屬，銀白樹蕨(cyntheadealbata)，榅槨，黃檀屬(dalbergiamonetaria)，骨碎補屬，螞蝗屬，粗糙蚌殼蕨,攏雙黃茅(dibeteropogonamplectens),鐮扁豆屬，扁豆屬，dorycniumrectum，金字塔稗,ehraffia屬，穇，麩屬，刺桐屬，桉樹屬，施氏假烏木屬，金茅紅丁香屬,蕎麥屬，費約果屬，草莓屬，千斤拔屬，河岸藤露兜樹(freycinetiabanksli)，天竺葵,銀杏屬，羅德毛豆屬，南洋櫻屬，陸地棉，銀樺屬，鞘籽古夷蘇木屬，巖黃芪屬，hemaffhiaaltissima，黃茅屬，大麥，紅苞茅屬，連翹，hypeffheliadissolute,靚藍水俁，鳶尾屬，虎耳草,胡枝子屬，萵苣屬，銀合歡屬,loudetiasimplex，lotonusbainesli，蓮花屬，阿切爾扁豆，平邑屬，木薯，苜蓿，水杉，大蕉，煙草屬，紅豆屬，鳥足豆屬，水稻屬，巴西盾，非洲狼尾草屬，酪梨，矮牽牛屬，菜豆，加拿利海棗，紅葉石楠屬，新西蘭劍麻,云杉青岡，松屬，豌豆屬，羅漢松托塔拉，pogonarthriafleckii,pogonaffhriasquarrosa，楊屬，牧豆瓜葉菊，花旗松，老虎刺屬，西洋梨，櫟屬，厚葉石斑木，尼卡香棕，火炬納塔爾，醋栗屬,香茶屬，刺槐，薔薇屬，懸鉤子屬，柳屬，紅裂稃草(schyzachyriumsanguineum)，sciadopitysvefficillata，紅杉，巨杉，高粱，菠菜屬，鼠尾粟，stiburusalopecuroides，矮柱花草(stylosanthoshumilis)，葫蘆茶屬，落羽杉，菅草，紅三葉屬，小麥屬，鐵杉屬太子參，越桔屬，蠶豆屬，葡萄，錐穗沃森花(watsoniapyramidata)，馬蹄蓮，玉米，莧菜，朝鮮薊，蘆筍，花椰菜，抱子甘藍，白菜，油菜，胡蘿卜，菜花，芹菜，亞麻，羽衣甘藍(flax)，羽衣甘藍(kale)，扁豆，油菜，秋葵，洋蔥，馬鈴薯，水稻，大豆，秸稈，甜菜，甘蔗，向日葵，番茄，南瓜茶，樹木?；蛘?，藻類和其他非植物界可用于本發(fā)明的方法。

根據(jù)具體的實施方式，所述植物是茄科植物。

根據(jù)具體的實施方式，所述植物是茄屬植物。

根據(jù)另一具體的實施方式，所述茄屬植物是番茄(番茄(lycopersicumesculentum))。

根據(jù)另一具體的實施方式，所述植物包括：馬鈴薯(馬鈴薯(solanumtuberosum))；番茄(蕃茄(lycopersicumesculentum))；茄子(茄植物)(茄子(solanummelongena))；香蕉(芭蕉科屬)；天竺葵(通用名)(天竺葵(pelargonium))；姜(姜(zingiberofficinale))；煙草(煙草(nicotianatabacum))；甜椒(辣椒屬)；橄欖(oleaeuropea)擬南芥植物，桉樹，蘋果，海棠，梨，火棘，山楂，栒子，榅桲或花揪植物。

如本文所用的術語“細菌病原體”是指任何類型的毒力細菌菌種或菌株，其能感染植物，包括，但不限于，假單胞菌屬，歐文氏菌相關的菌株，青枯雷爾氏菌和野油菜黃單胞菌。所述細菌可以是假單胞菌屬，包括金色假單胞菌，綠針假單胞菌，熒光假單胞菌，邊緣假單胞菌，丁香假單胞菌，托拉氏假單胞菌，蘑菇假單胞菌和綠黃假單胞菌。所述細菌可能是歐文氏菌相關的菌株，包括達旦迪基氏菌(菊歐文氏菌)，軟腐歐文氏菌，黑腐歐文氏菌和解淀粉歐文氏菌。這種細菌可能是野油菜黃單胞菌相關的菌株，包括十字花科黑腐病菌(xcc)和白葉枯黃單胞菌。

根據(jù)本發(fā)明的實施方式，所述細菌是革蘭氏陰性菌。

根據(jù)具體的實施方式，所述革蘭氏陰性菌是變形菌種。

根據(jù)另一個具體的實施方式，所述變形菌是青枯雷爾氏菌。

根據(jù)另一個具體的實施方式，所述革蘭氏陰性菌選自青枯雷爾氏菌，丁香假單胞菌，解淀粉歐文氏菌，歐文氏psidii，亞洲梨火歐文氏菌，野油菜黃單胞菌和白葉枯黃單胞菌。

如本文使用的短語“增強的抗性”是指，減少細菌的毒力，從而與非修飾植物相比，降低宿主植物的易感性，所述未修飾植物被相同的細菌病原體感染。根據(jù)本發(fā)明的教導，降低細菌的毒力是通過表達與細菌毒力相關的顯性負性蛋白(例如針狀復合物，如下文進一步詳細描述)來起作用，并可影響與宿主相關的細菌的生命周期中的任何一步，包括但不限于，粘附，侵入，復制，逃避宿主防御及傳送到新宿主。

針對細菌病原體的抗性增強可表現(xiàn)為宿主中的癥狀減少，因此，可以通過監(jiān)測宿主中與細菌相關的反應的減少來檢測。增強的抗性可以表現(xiàn)為，相對于適當?shù)膶φ?例如在相同條件下的非修飾的植物)，至少減少了約1％，至少減少了約5％，至少減少了約10％，至少減少了約20％，至少減少了約30％，至少減少了約40％，至少減少了約50％，至少減少了約60％，至少減少了約70％，至少減少了約80％，至少減少了約90％，或至少減少了約100％的與細菌病原體相關的癥狀，這可以通過本領域技術人員公知的任何測定法測量。

本發(fā)明的方法可以通過將核酸表達載體引入植物起作用，所述核酸表達載體包含核酸序列和順式作用調(diào)控元件，所述核酸序列編碼顯性負性t3ss蛋白，所述順式作用調(diào)控元件能夠驅(qū)動所述核酸序列在植物細胞中轉(zhuǎn)錄，所述顯性負性t3ss蛋白介導功能失調(diào)的針狀復合物的組裝。

本文使用的術語“t3ss”是指細菌(例如革蘭陰性菌)的iii型分泌系統(tǒng)(也稱為ttss)，其通常以針狀結(jié)構起作用，可直接從細菌細胞分泌蛋白質(zhì)。t3ss針狀復合物通常始于該細菌的細胞質(zhì)中，穿過兩層膜并伸出細胞(參見，例如圖1a)。固定在膜上的部分是t3ss的底座(或基體)。胞外部分是針(也命名為菌毛)。作為通向宿主細胞細胞質(zhì)的門的最后一個結(jié)構是易位子。(參見圖1b-c)。所謂的內(nèi)桿將針與底座連接。

如本文使用的術語“t3ss蛋白”指的是一種蛋白質(zhì)，其構成t3ss分泌系統(tǒng)復合物。這包括結(jié)構蛋白，即構建底座的蛋白，內(nèi)桿，針，尖端或易位子。針本身通常由單一t3ss蛋白的許多單位構成。因此，t3ss蛋白的差異大多數(shù)是那些構建底座以及那些被分泌進宿主的蛋白。

根據(jù)本發(fā)明的實施方式，t3ss蛋白是一種蛋白質(zhì)，如hrp(過敏性反應和致病性的)蛋白，其組成t3ss針狀結(jié)構。示例性的hrp蛋白包括，但不限于，青枯雷爾氏菌hrpy蛋白，丁香假單胞菌hrpa蛋白，解淀粉歐文氏菌hrpa蛋白，亞洲梨火歐文氏菌hrpa蛋白和野油菜黃單胞菌hrpe蛋白(示例性的蛋白質(zhì)，參見下表1，其引自buttner和he,plantphysiology(2009)150:1656-1664并且并入本文]。

表1：示例性的t3ss蛋白

注：xcv-野油菜黃單胞菌辣椒斑點病致.病變種，xoo-水稻黃單胞菌水稻致病變種根據(jù)一具體的實施方式，野生型青枯雷爾氏菌hrpy多肽如seqidno：14所示。根據(jù)另一實施方式，青枯雷爾氏菌hrpy多肽包含如seqidno：70-86所示的變體。根據(jù)一具體的實施方式，野生型丁香假單胞菌hrpa多肽如seqidno：19所示。根據(jù)一具體的實施方式，野生型解淀粉歐文氏菌hrpa多肽如seqidno：88所示。根據(jù)一具體的實施方式，野生型野油菜黃單胞菌hrpe多肽如seqidno：90所示。根據(jù)一具體的實施方式，野生型白葉枯黃單孢菌hrpe多肽如seqidno：92所示。

根據(jù)另一實施方式，t3ss蛋白是易位子蛋白，如青枯雷爾氏菌易位子蛋白popf1或popf2(分別為seqidno：67和69)。

根據(jù)一具體的實施方式，野生型亞洲梨火歐文氏菌hrpa多肽如seqidno：100所示。

本文使用的短語“顯性負性t3ss蛋白”是指具有結(jié)構改變的基因產(chǎn)物的t3ss蛋白，所述基因產(chǎn)物能與細菌分泌的野生型t3ss蛋白相互作用，但介導功能失調(diào)的針狀復合物的形成(例如，不能穿透宿主細胞，無法轉(zhuǎn)運效應器蛋白進入宿主細胞，或與野生型蛋白相比，能力下降)。細菌功能失調(diào)的針狀復合物可以是結(jié)構變形(例如，部分或完全被阻斷或變形，從而使得它不能轉(zhuǎn)運效應蛋白至宿主細胞)，或可部分組裝或根本沒組裝。通常情況下，本發(fā)明的顯性負性t3ss蛋白能降低細胞的感染性和致病性。測定感染性的方法為本領域所熟知。

因此，顯性負性t3ss蛋白降低了針狀復合形物組裝和/或功能，因此，與具有由野生型t3ss蛋白組成的針狀結(jié)構的細菌相比，致病性細菌的感染性降低約5％，約10％，約20％，約30％，約40％，約50％，約60％，約70％，約80％，約90％或約100％。

值得注意的是，根據(jù)一個具體的實施方式，顯性負性蛋白由植物細胞外源地表達至細菌。

通常情況下，顯性負性t3ss蛋白由基因編碼，所述基因在野生型蛋白編碼序列中包含一個或多個突變，如插入突變，缺失突變或取代突變。這些突變可包含野生型t3ss蛋白的單個核酸的改變(例如，包括β阻斷氨基酸，如脯氨酸或其合成類似物)，或者可以包含2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25或更多的核酸改變。另外，突變可以包括在t3ss蛋白中，單一肽的插入(3，4，5，10個氨基酸長)，或若干肽的插入(例如，五肽插入)。

可實施于本發(fā)明肽的示例性單氨基酸突變，包括在hrpa基因23位的甘氨酸被丙氨酸取代，hrpa基因54位的丙氨酸被谷氨酸取代，hrpa基因93位的賴氨酸被異亮氨酸取代，hrpa基因95位的門冬氨酸被絲氨酸取代，hrpa基因101位的異亮氨酸被蘇氨酸取代，hrpa基因111位的異亮氨酸被脯氨酸取代。

可插入本發(fā)明所述肽的示例性的五肽插入如seqidno:20-65所示(參見下表2)。

可以理解的是，t3ss基因中任何位點的突變都可能生成顯性負性蛋白。對于hrpa基因，描述了核酸插入和缺失的示例性位點，參見下文的圖8和表2[來自taira等，molmicrobiol.(1999)34(4):737-44，并且并入本文]。

如前所述，根據(jù)具體的實施方式，本發(fā)明的顯性負性t3ss蛋白保留了蛋白-蛋白相互作用位點，這使得它能夠以高親和力與同源的野生型細菌蛋白結(jié)合并形成針狀結(jié)構，但是，由于顯性負性蛋白中的突變，所得到的針狀結(jié)構功能失調(diào)。

因此，本發(fā)明考慮了能使針狀復合物功能失調(diào)的t3ss基因中或?qū)3ss基因的任何突變。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，插入突變包括嵌入閉鎖元件(ibe)。包含ibe的顯性負性t3ss蛋白通常與同源蛋白形成亞基-亞基相互作用，同時整合入翻譯水平上融合的通道-閉鎖元件(例如，肽)或使t3ss蛋白結(jié)構變形(例如hrpyα-螺旋)，從而阻止細菌效應器從細菌分泌至植物細胞中(參見，下文實施例部分的實施例1)。

根據(jù)本發(fā)明這方面的一個實施方式，所述核酸序列編碼如seqidno：2，4，6，8，10或12所示的肽。

根據(jù)另一實施方式，通過與不成熟的針相互作用，顯性負性t3ss蛋白能夠阻斷t3ss組裝(例如，顯性負性易位子蛋白提前與針相互作用，從而干擾t3ss組裝并使其失活(參見下文實施例部分的實施例3)。

表2：示例性五肽插入和hrpa基因中核酸插入和缺失的位點

根據(jù)本發(fā)明的這方面的核酸序列可以是互補多核苷酸序列(cdna)，基因組多核苷酸序列和/或復合多核苷酸序列(例如，上述的組合)。

本文使用的短語“互補多核苷酸序列”是由信使rna通過逆轉(zhuǎn)錄酶或任何其它rna依賴性dna聚合酶反轉(zhuǎn)錄而形成。這樣的序列隨后可在體內(nèi)或體外用dna依賴性dna聚合酶進行擴增。

本文使用的短語“基因組多核苷酸序列”是指這樣的序列，其來源(分離)于染色體，因此其代表了染色體連續(xù)的部分。

本文使用的短語“復合多核苷酸序列”是指這樣的序列，其至少部分地互補并且至少部分為基因組序列。復合序列可以包括一些外顯子序列，這些序列為編碼本發(fā)明所述多肽所必需，也包括一些相互間隔的內(nèi)含子序列。內(nèi)含子序列可以是任何來源，包括其它基因，并且通常包括保守的剪接信號序列。這樣的內(nèi)含子序列可以進一步包括順式作用表達調(diào)控元件，如下文中將進一步詳細描述的。

根據(jù)一個具體的實施方式，所述核酸序列包含如seqidno：1，3，5，7，9和11所示的插入。

在本發(fā)明所述方法中有用的構建體可以使用本領域技術人員熟知的重組dna技術來構建。基因構建體可被插入到商業(yè)可獲得的載體中，該載體適于轉(zhuǎn)化入植物，并適于在轉(zhuǎn)化細胞中表達目標基因?；驑嫿w可以是表達載體，其中所述異源核酸序列可操作地連接至能在植物細胞中表達的順式作用調(diào)控元件。

本文使用的短語“順式作用調(diào)控元件”是指多核苷酸序列，優(yōu)選啟動子，其與反式作用調(diào)控子結(jié)合，并調(diào)控位于其下游的編碼序列的轉(zhuǎn)錄。

本文使用的短語“可操作地連接”是指功能性地放置順式調(diào)控元件(如啟動子)使其能調(diào)控所選擇的核酸序列的表達。例如，按照轉(zhuǎn)錄和翻譯的方向，啟動子序列可能位于所選擇的核酸序列的上游。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述核酸構建體中的啟動子是植物啟動子，其用于指導異源核酸分子在植物細胞內(nèi)的表達。

可以理解的是，編碼嵌入元件(如seqidno:2，4，6，8，10或12所示)的新型核酸序列是一種用于在細菌或植物細胞中表達的核酸表達載體或其一部分。

本文使用的短語“植物啟動子”是指至少能夠誘導，賦予，激活或增強在植物(優(yōu)選單子葉或雙子葉植物)細胞、組織或器官中表達的啟動子序列，其包括加入其中或包含其中的任何其它調(diào)控元件。這樣的啟動子可以來自于植物，細菌，病毒，真菌或動物來源。這樣的啟動子可以是組成型的，即，能夠在多種植物組織中指導高水平的基因表達，組織特異性的，即，能夠在一個或多個特定的植物組織中指導基因表達，誘導型的，即，能夠在刺激下指導基因表達，或嵌合型的，即，由至少兩個不同的啟動子的一部分形成。

組成型植物啟動子的例子包括，但不限于，camv35s啟動子和camv19s啟動子，fmv34s啟動子，甘蔗桿狀病毒啟動子，csvmv啟動子，擬南芥act2/act8肌動蛋白啟動子，擬南芥泛素ubq1啟動子，大麥葉硫堇bth6啟動子，和水稻肌動蛋白啟動子。

根據(jù)一個具體的實施方式，啟動子是組成型啟動子，例如camv35s啟動子。

可用于本發(fā)明一些實施方式的其他示例性啟動子如表3，4，5和6所示。

表3

用于實施本發(fā)明的一些實施方式的示例性組成型啟動子

表4

用于實施本發(fā)明的一些實施方式的示例性種子首選啟動子

表5

用于實施本發(fā)明的示例性花特異性啟動子

表6

用于實施本發(fā)明的備選稻谷啟動子

本發(fā)明的核酸構建體還可以包含其它核酸序列，所述核酸序列編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號肽，其允許顯性負性t3ss前肽轉(zhuǎn)運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并通過分泌途徑。這樣的信號肽通常在框內(nèi)與多肽的氨基末端(即其上游)相連接，并將編碼的多肽導向細胞分泌途徑，并最終分泌(例如，分泌至質(zhì)外體)。

通過er將多肽直接導向胞外的示例性分泌信號序列包括sp|q56yt0|lac3_at漆酶(seqidno：16)的植物分泌前導肽，和tr|q6tds6|q6tds6_gosar(seqidno：17)的植物分泌前導肽。

可用于本文的其它示例性信號肽包括煙草致病相關蛋白(pr-s)信號序列(sijmons等，1990，bio/technology，8:217-221)，凝集素信號序列(boehn等，2000年，transgenicres，9(6):477-86)，菜豆富含羥脯氨酸糖蛋白的信號序列(yan等，1997，plantphyiol.115(3):915–24和corbin等，1987，molcellbiol7(12):4337-44)，馬鈴薯糖蛋白(patatin)信號序列(iturriaga，g.等，1989，plantcell1:381-390和bevan等，1986，nuc.acidsres.41:4625-4638)和大麥α-淀粉酶信號序列(rasmussen和johansson，1992，plantmol.biol.18(2):423-7)。

根據(jù)本發(fā)明的實施方式，本發(fā)明的核酸構建體可進一步包含翻譯增強子，如ω-翻譯增強子。

本發(fā)明一些實施方式中的多肽的核酸序列可以優(yōu)化用于植物表達。這樣的序列修飾的例子包括，但不限于，將g/c含量改為更接近在目標植物種中通常發(fā)現(xiàn)的含量，常被稱為密碼子優(yōu)化的將植物物種中非典型的密碼子除去。

短語“密碼子優(yōu)化”指的是選擇適當?shù)膁na核苷酸以用于結(jié)構基因或其片段內(nèi)，其接近于目標植物中密碼子使用。因此，優(yōu)化的基因或核酸序列是指這樣的基因，其中天然或天然存在的基因的核苷酸序列已被改變，以便在植物內(nèi)使用統(tǒng)計學首選或統(tǒng)計學優(yōu)選的密碼子。核苷酸序列通常在dna水平檢測，并且用任何適當?shù)姆椒ù_定植物種類中優(yōu)化用于表達的編碼區(qū)，例如sardana等所述(1996，plantcellreports:15:677-681)。在該方法中，密碼子使用的標準偏差，密碼子使用偏好的檢測的計算，可通過先找到天然基因每個密碼子使用相對于高表達植物基因中每個密碼子使用的平方比偏差，然后計算平均方差。所使用的公式為：1sdcu＝n＝1n[(xn–yn)/yn]2/n，其中xn是指在高表達植物基因中密碼子n的使用頻率，而yn是指在目標基因中密碼子n的使用頻率，n是指目標基因中密碼子的總數(shù)。雙子葉植物高表達基因使用的密碼子的表符合murray等的數(shù)據(jù)(1989，nucacidsres.17:477-498)。

根據(jù)針對特定植物細胞類型使用的優(yōu)選密碼子優(yōu)化核酸序列的一種方法，是基于直接使用密碼子優(yōu)化表，例如在密碼子使用數(shù)據(jù)庫通過日本nias(國家農(nóng)業(yè)生物資源研究所(nationalinstituteofagrobiologicalsciences))dna庫(www.kazusa.or.jp/codon/)在線提供的那些，而無需進行任何額外的統(tǒng)計計算。密碼子數(shù)據(jù)庫包含用于許多不同物種的密碼子使用表，每個密碼子使用表均基于genbank中的數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計確定。

通過使用上述的表來確定特定物種(例如，稻谷)中對于每個氨基酸的最優(yōu)選或最偏好的密碼子，編碼目標蛋白質(zhì)的天然存在的核苷酸序列可以根據(jù)特定植物物種進行密碼子優(yōu)化。這是通過將特定物種基因組中統(tǒng)計學上的出現(xiàn)率可能低的密碼子，替換為對于某一氨基酸的相應的統(tǒng)計學上更偏好的密碼子。然而，可以選擇一個或多個較不偏好的密碼子，以刪除存在的酶切位點，以在潛在有用的接頭處(5'和3'端添加信號肽或終止盒，內(nèi)部位點，其可以用來將片段切割和剪接在一起，以產(chǎn)生正確的全長序列)創(chuàng)建新的酶切位點，或用來消除可能會對mrna的穩(wěn)定性或表達產(chǎn)生負面影響核苷酸序列。

在進行任何修飾前，天然存在的編碼核苷酸序列可能已經(jīng)包含許多對應于特定植物物種中統(tǒng)計學上偏愛的密碼子。因此，天然核苷酸序列的密碼子優(yōu)化可能包括在天然核苷酸序列里確定那些對于特定植物并不是統(tǒng)計學上偏愛的密碼子，并根據(jù)特定植物的密碼子使用表修改這些密碼子，以產(chǎn)生密碼子優(yōu)化的衍生物。對于植物密碼子的使用，修飾的核苷酸序列可完全或部分被優(yōu)化，只要與相應的自然存在的或天然基因編碼的蛋白相比，由修飾的核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的水平更高。在例如pct專利申請93/07278中描述了通過改變密碼子使用來構建合成基因。

因此，本發(fā)明的一些實施方式，包括上文所述的核酸序列，其片段，與其雜交的序列，與其同源的(homologous)序列，與其直系同源的(orthologous)序列，用不同的密碼子編碼類似多肽的序列，具有突變特征的改變的序列。所述突變包括一個或多個核苷酸的缺失，插入或取代，無論是天然存在的或人為誘導，無論是隨機的或有針對性的方式形成。

可以用本發(fā)明的一些實施方式的核酸構建體對植物細胞進行穩(wěn)定或瞬時轉(zhuǎn)化。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化中，本發(fā)明一些實施方式的核酸分子被整合入植物基因組中，因此它代表了穩(wěn)定且遺傳的特性。對于瞬時轉(zhuǎn)化，由轉(zhuǎn)化細胞表達核酸分子，但核酸分子并沒有整合到基因組中，因此具有短暫表達的特性。

有各種不同的方法將外源基因引入單子葉和雙子葉植物(potrykus，i.，annu.rev.plant.physiol.,plant.mol.biol.(1991)42:205-225；shimamoto等,nature(1989)338:274-276)。

將外源dna穩(wěn)定整合入植物基因組dna的原理方法包括兩個主要的途徑：

(i)農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)移：klee等(1987)annu.rev.plantphysiol.38:467-486；klee和rogers，cellcultureandsomaticcellgeneticsofplants,vol.6,molecularbiologyofplantnucleargenes,編輯schell,j.,和vasil,l.k.,academicpublishers,圣地亞哥，加利福尼亞州(1989)p.2-25；gatenby,plantbiotechnology,編輯kung,s.和arntzen,c.j.,butterworthpublishers,波士頓，馬薩諸塞州(1989)p.93-112。

(ii)直接dna攝?。簆aszkowski等，cellcultureandsomaticcellgeneticsofplants,vol.6,molecularbiologyofplantnucleargenes編輯schell,j.,和vasil,l.k.,academicpublishers,圣地亞哥，加利福尼亞州(1989)p.52-68；包括直接攝取dna進入原生質(zhì)體的方法,toriyama,k.等，(1988)bio/technology6:1072-1074。通過短暫電休克植物細胞誘導的dna攝?。簔hang等plantcellrep.(1988)7:379-384.fromm等nature(1986)319:791-793。通過粒子轟擊注射dna進入植物細胞或組織，klein等.bio/technology(1988)6:559-563；mccabe等bio/technology(1988)6:923-926；sanford,physiol.plant.(1990)79:206-209；通過使用微量移液器系統(tǒng)：neuhaus等,theor.appl.genet.(1987)75:30-36；neuhaus和spangenberg,physiol.plant.(1990)79:213-217；玻璃纖維或硅碳化物頸須轉(zhuǎn)化細胞培養(yǎng)物、胚胎或胼胝組織，美國專利號5,464,765或通過dna直接與正在發(fā)育的花粉孵育，dewet等，experimentalmanipulationofovuletissue,eds.chapman,g.p.和mantell,s.h.和daniels,w.朗曼，倫敦(1985)p.197-209；以及ohta,proc.natl.acad.sci.usa(1986)83:715-719。

農(nóng)桿菌系統(tǒng)包括使用質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體包含確定的dna片段，其被整合入植物基因組dna。植物組織接種的方法根據(jù)植物物種和農(nóng)桿菌遞送系統(tǒng)的不同而不同。廣泛使用的方法是葉盤(leafdisc)方法，其可以通過能為整個植物分化提供良好來源的任何組織外植塊來進行。horsch等,plantmolecularbiologymanuala5，kluweracademicpublishers,多德雷赫特(1988)p.1-9。補充的方法采用農(nóng)桿菌與真空滲透相結(jié)合。農(nóng)桿菌系統(tǒng)對于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物方面是特別可行的。

有各種方法將dna直接轉(zhuǎn)移至植物細胞中。電穿孔法將原生質(zhì)體與強電場短暫接觸。顯微注射法用非常小的微量移液器將dna機械地直接注射進入細胞。微粒轟擊法則將吸附dna的微發(fā)射體，如硫酸鎂晶體或鎢顆粒，用物理加速打入植物細胞或組織。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)化后的植物可以進行繁殖。植物繁殖最常用的方法是用種子。但是，通過種子繁殖再生有不足之處，因為種子是由植物根據(jù)孟德爾法則決定的遺傳變異而產(chǎn)生的，由于雜合現(xiàn)象作物間缺乏統(tǒng)一性。基本上，每個種子基因不同，并且將各自帶著其自身的具體特征成長。因此，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物優(yōu)選具有與親代轉(zhuǎn)基因植物相同的特征和特性。因此，轉(zhuǎn)化植物優(yōu)選通過微繁殖再生，所述微繁殖提供快速，一致的轉(zhuǎn)化植物的再生。

微繁殖是從單個組織中生長出新一代植物的過程，所述單個組織切除自選定的親代植物或栽培種。這個過程允許植物的大量繁殖，所述植物具有表達融合蛋白的優(yōu)選組織。產(chǎn)生的新一代植物基因上與原植物完全相同，并具有原植物的所有特征。微繁殖允許優(yōu)質(zhì)的植物材料在很短的時間內(nèi)大量產(chǎn)生，以及使選定的栽培種能快速成倍成長，并保留原轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)化植物的特性?？寺≈参锏膬?yōu)點為植物繁殖的速度以及其產(chǎn)生的植物的質(zhì)量和均一性。

微繁殖是一個多階段的過程，需要改變各階段間的培養(yǎng)基或生長條件。因此，微繁殖過程涉及四個基本階段：第一階段，最初的組織培養(yǎng)；第二階段，組織培養(yǎng)倍增；第三階段，分化和植物的形成；以及第四階段，溫室培養(yǎng)和硬化。在第一階段，最初的組織培養(yǎng)，建立組織培養(yǎng)并確認無污染。在第二階段，初始的組織培養(yǎng)倍增直至產(chǎn)生足夠數(shù)量的組織樣本，以滿足制備目標。在第三階段，第二階段生長的組織樣本分開成并生成為單個小植株。在第四階段，轉(zhuǎn)化的植物被轉(zhuǎn)移到溫室中硬化，其中植物對光的耐受性逐漸增加，以便它可以在自然環(huán)境中生長。

雖然目前優(yōu)選穩(wěn)定的換化，本發(fā)明的一些實施方式還構想了葉細胞、分生組織細胞或整個植物的瞬時轉(zhuǎn)化。

可以通過上述任何直接dna轉(zhuǎn)移方法進行瞬時轉(zhuǎn)化，或使用改性植物病毒通過病毒感染進行。

已證明病毒可用于植物宿主的轉(zhuǎn)化，病毒包括，camv，tmv和bv。用植物病毒轉(zhuǎn)化植物的描述見美國專利號4,855,237(bgv)，ep-a67,553(tmv)，日本公開申請?zhí)?3-14693(tmv)，epa194,809(bv)，epa278,667(bv)和gluzman，y.等，communicationsinmolecularbiology:viralvectors,冷泉港實驗室，紐約，pp.172-189(1988)。wo87/06261描述了用于在許多宿主，包括植物，中表達外源dna的假病毒顆粒。

上述參考文獻，以及dawson，w.o.等，virology(1989)172:285-292；takamatsu等emboj.(1987)6:307-311；french等science(1986)231:1294-1297；和takamatsu等febsletters(1990)269:73-76證明了植物rna病毒的構建，所述rna病毒用于在植物中引入并表達非病毒外源核酸序列。

當病毒是dna病毒時，可對病毒本身作適當修飾。或者，可將該病毒首先克隆到細菌質(zhì)粒，以便于構建帶有外源dna的所需病毒載體。然后，可從質(zhì)粒上切下該病毒。如果病毒是dna病毒，可以將細菌復制起點與病毒dna連接，然后由細菌對其進行復制。該dna的轉(zhuǎn)錄和翻譯將產(chǎn)生外殼蛋白，所述外殼蛋白會將病毒dna包裝。如果病毒是rna病毒，通常將該病毒的cdna克隆插入質(zhì)粒。然后用所述質(zhì)粒進行所有的構建。然后通過轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒的病毒序列產(chǎn)生rna病毒，通過翻譯病毒基因產(chǎn)生外殼蛋白，并用外殼蛋白包裝病毒rna。

上述參考文獻，以及美國專利號5,316,931描述了植物rna病毒的構建，所述植物rna病毒用于在植物中引入并表達非病毒外源核酸序列，所述核酸序列如本發(fā)明一些實施方式中所包括的那些。

本發(fā)明的一個實施方式提供了一種植物病毒核酸，所述病毒核酸中刪除了天然外殼蛋白編碼序列，插入了非天然植物病毒外殼蛋白編碼序列和非天然啟動子，優(yōu)選使用非天然外殼蛋白編碼序列的亞基因組啟動子，所述非天然植物病毒外殼蛋白編碼序列能在植物宿主中表達，包裝重組植物病毒核酸，并確保重組植物病毒核酸系統(tǒng)地感染宿主。或者，可以通過在所述病毒核酸中插入非天然核酸序列使外殼蛋白基因失活，從而不產(chǎn)生蛋白質(zhì)。重組植物病毒核酸可以含有一種或多種其它非天然亞基因組啟動子。每個非天然亞基啟動子能夠在植物宿主中轉(zhuǎn)錄或者表達鄰近的基因或核酸序列，并能夠互相重組以及與天然亞基因組啟動子重組。如果包括一個以上核酸序列，可以在鄰近天然植物病毒亞基因組啟動子或天然和非天然植物病毒亞基因組啟動子處插入非天然(外源)核酸序列。在亞基因組啟動子的控制下，在宿主植物中轉(zhuǎn)錄或表達非天然核酸序列，從而產(chǎn)生所需產(chǎn)物。

在第二個實施方式中，提供了與第一個實施方式相同的重組植物病毒核酸，不同的是天然外殼蛋白編碼序列被置于與非天然外殼蛋白亞基因組啟動子中的一個相鄰，而不是與非天然外殼蛋白編碼序列相鄰。

在第三個實施方式中，提供了重組植物病毒核酸，其中天然外殼蛋白基因與其亞基因組啟動子相鄰，并且一個或多個非天然亞基因組啟動子都已經(jīng)被插入到病毒核酸中。插入的非天然亞基因組啟動子能夠在植物宿主中轉(zhuǎn)錄或表達相鄰的基因，但不能互相重組以及與天然亞基因組啟動子重組?？梢圆迦敕翘烊缓怂嵝蛄惺蛊渑c非天然亞基因組植物病毒啟動子相鄰，使得所述序列在亞基因組啟動子的控制下，在宿主植物中轉(zhuǎn)錄或表達，以產(chǎn)生所需產(chǎn)物。

在第四個實施方式中，提供了與第三個實施方式相同的重組植物病毒核酸，不同的是用非天然外殼蛋白編碼序列替換天然外殼蛋白編碼序列。

用由重組植物病毒核酸編碼的外殼蛋白包裝病毒載體，以產(chǎn)生重組植物病毒。所述重組植物病毒核酸或重組植物病毒能感染適當?shù)乃拗髦参?。所述重組植物病毒核酸能夠在宿主中復制，在宿主中系統(tǒng)性擴散，并且在宿主中轉(zhuǎn)錄或表達外源基因(分離的核酸)，以產(chǎn)生所需的蛋白質(zhì)。

除上述外，本發(fā)明一些實施方式所述的核酸分子也可以被引入到葉綠體基因組中，從而使葉綠體表達。

將外源核酸序列引入到葉綠體基因組中的技術是已知的。所述技術涉及以下步驟。首先，化學處理植物細胞，使每個細胞的葉綠體數(shù)量減少到1左右。然后，通過粒子轟擊將外源核酸引入細胞中，目的是在葉綠體中引入至少一個外源核酸分子。選擇外源核酸，從而通過同源重組將其整入葉綠體基因組中，同源重組可以容易地通過葉綠體固有的酶進行。為此，除了目標基因外,外源核酸包括至少一段來自于葉綠體基因組的核酸序列。此外，外源核酸包括可用于篩選的標記，通過篩選，所述標記可以確保全部或幾乎全部的葉綠體在其基因組中包括外源核酸。有關該技術的更詳細的描述見美國專利號4,945,050和5,693,507，其通過參考并入本文。因此，可以通過葉綠體蛋白表達系統(tǒng)產(chǎn)生多肽，并整合入葉綠體的內(nèi)膜。

根據(jù)本發(fā)明的其他方面，提供了宿主細胞，所述宿主細胞包含本發(fā)明所述的核酸表達載體。

本發(fā)明中的“宿主細胞”是指新的單個細胞，其通過將核酸表達載體引入細胞而產(chǎn)生，所述核酸表達載體包含編碼顯性負性t3ss蛋白的核酸序列。根據(jù)具體的實施方式，宿主細胞是植物細胞。宿主細胞可以包含作為染色體外(游離的)復制分子的核酸構建體，或可選地，可包含被整合在宿主細胞的細胞核或質(zhì)體基因組中的嵌合基因。

根據(jù)本發(fā)明的再一個方面，提供了一種基因修飾植物，所述基因修飾植物包含本發(fā)明的核酸表達載體。

根據(jù)本發(fā)明的再一個方面，提供了一種表達外源多核苷酸的基因修飾植物，所述外源多核苷酸編碼顯性負性t3ss蛋白，如seqidno：2，4，6，8，10或12所示。

根據(jù)具體的實施方式，與未修飾的植物相比，表達顯性負性t3ss蛋白的基因修飾植物對細菌病原體的抗性增強(如上文中詳細描述)。

可以理解的是，當指一個基因修飾植物或植物細胞，本發(fā)明人還指由此產(chǎn)生的后代。

可以通過核酸或蛋白質(zhì)的探針(例如抗體)驗證外源mrna和/或多肽的存在，來選擇繁殖產(chǎn)生的后代或從轉(zhuǎn)化植物得到的后代。或者，可以通過檢測對細菌病原體抗性的增強，來驗證本發(fā)明的顯性負性t3ss蛋白的表達，所述檢測是通過感染基因修飾植物和野生型(即非修飾的相同類型的植物)，并比較所述植物的疾病(例如，觀察植物萎蔫)。

本發(fā)明還提供了評價植物對細菌病原體的抗性的方法，所述方法包括：(a)在植物內(nèi)表達外源核酸序列和順式作用調(diào)控元件，所述外源核酸序列編碼顯性負性t3ss蛋白質(zhì)，所述順式作用調(diào)控元件能夠驅(qū)動核酸序列在植物細胞中的轉(zhuǎn)錄；(b)使細菌病原體作用于所述植物，以及(c)比較所述植物和野生型植物的疾病，所述野生型植物被培養(yǎng)于相同條件下并被所述細菌病原體感染。

本文所述的細菌病原體可能會在植物中引起各種疾病。因此，例如，青枯雷爾氏菌可能會引起青枯萎蔫病，蘑菇假單胞菌可能導致滴落性爛鰓病(例如，對于栽培蘑菇)，托拉氏假單胞菌可能引起細菌斑(例如，對于栽培蘑菇)，野油菜黃單胞菌可能引起黑腐病(例如，十字花科蔬菜，如甘藍型油菜和擬南芥)，白葉枯黃單胞菌可能引起細菌枯萎病(如稻谷)，解淀粉歐文氏菌可能導致火疫病(例如，對于蘋果和梨)，軟腐歐文氏菌可能會導致細菌軟腐病。

因此，例如，對于萎蔫病，通常由認定者(不知治療情況)在24周內(nèi)對每天的癥狀計分，計分的病情指數(shù)從04，其中0表示無疾病，1表示1至25％的葉片枯萎，2表示2550％的葉片枯萎，3表示51至75％的葉片枯萎，以及4表示76至100％的葉片枯萎。

本文使用的術語“約”是指±10％。

術語“包含(comprises)”，“包含(comprising)”，“包括(includes)”，“包括(including)”，“具有(having)”及它們的組合是指“包括但不限于”。

術語“由……組成”是指“包括并且限于”。

術語“基本由……組成”是指組合物，方法或結(jié)構，其可以包括其他組分，步驟和/或部分，但只有當其他組分，步驟和/或部分不實質(zhì)性地改變所要求保護的組合物，方法或結(jié)構的基本和新穎的特性時。

除非上下文清楚地另有規(guī)定，本文所用單數(shù)形式的“一(a)”，“一個(an)”和“所述”包括復數(shù)指代。例如，術語“化合物”或“至少一種化合物”可包括多種化合物，包括其混合物。

在本申請中，本發(fā)明的各種實施方式可以以范圍的形式呈現(xiàn)。應當理解，范圍形式中的描述僅僅是為了方便和簡潔起見，不應該被解釋為對本發(fā)明范圍的硬性限制。因此，范圍的描述應當被理解為具體地公開了所有可能的子范圍，以及該范圍內(nèi)的各個數(shù)值。例如，范圍的描述如1至6應被視為已具體公開了以下子范圍，例如1至3，1至4，1至5，2至4，2至6，3至6等，以及在該范圍內(nèi)的各個數(shù)值，例如，1，2，3，4，5和6。這適用于無論多廣的范圍。

每當本文指出一個數(shù)值范圍時，所指的是包括在所指出范圍內(nèi)的任何引用的數(shù)字(分數(shù)或整數(shù))。本文互換使用的短語“介于”第一個指示的數(shù)和第二個指示數(shù)間或“在”第一個指示的數(shù)和第二個指示的數(shù)“的范圍間”，“從(ranging)/從(rangesfrom)”第一個指示的數(shù)“至”第二個指示的數(shù)，是指包括所述第一個和第二個指示的數(shù)以及它們之間的所有分數(shù)和整數(shù)。

本文使用的術語“方法”是指為完成給定任務的方式，手段，技術和程序，包括，但不限于，方式，手段，技術和程序，它們或者是化學，藥學，生物學，生物化學和醫(yī)學領域已知的，或可容易地通過上述領域的從業(yè)人員從公知的方式，手段，技術和程序得到。

可以理解，為清楚起見，描述于各個實施方式的上下文中的本發(fā)明的某些特征，也可以被組合在一個實施方式中。反之，為簡潔起見，在單個實施方式的上下文中描述的本發(fā)明的不同特征，也可以單獨地或以任何合適的子組合或適用于任何其他的本發(fā)明的實施方式中提供。各種實施方式的上下文中描述的某些特征不被認為是這些實施方式的必要特征，除非所述實施方式?jīng)]有這些元素是不起作用的。

如上文所述以及如本發(fā)明的權利要求所要求的本方面的各個實施方式和方面，可以在下文的實施例中找到實驗性支持。

實施例

現(xiàn)在參考下面的實施例，其與上文的描述一同以非限制的方式對本發(fā)明進行說明。

一般來說，本文所使用的術語，以及在本發(fā)明中使用的實驗程序，包括分子生物學，生物化學，微生物學和重組dna技術。這些技術在文獻中已有詳細解釋。參見，例如，“molecularcloning:alaboratorymanual”sambrook等，(1989)，“currentprotocolsinmolecularbiology”卷i–iii,ausubel,r.m.編輯(1994)；ausubel等，“currentprotocolsinmolecularbiology”，johnwiley和sons，巴爾的摩，馬里蘭州(1989)；perbal，“apracticalguidetomolecularcloning”，johnwiley和sons，紐約州(1988)watson等，“recombinantdna”，scientificamericanbooks，紐約；birren等(eds)“genomeanalysis:alaboratorymanualseries”卷1-4，coldspringharborlaboratorypress，紐約(1998年)；如美國專利號4,666,828，4,683,202，4,801,531，5,192,659，和5,272,057，“cellbiology:alaboratoryhandbook”，卷i-iiicellis,j.e.編輯(1994)，“currentprotocolsinimmunology”卷i-iiicoliganj.e.編輯(1994)；stites等(eds)，“basicandclinicalimmunology”(第8版)，appleton&lange，諾沃克，康涅狄格州(1994)；mishell和shiigi(eds)，“selectedmethodsincellularimmunology”，w.h.freemanandco.,紐約(1980)描述的方法；可用的免疫測定法，其被廣泛描述于專利和科學文獻中，參見，例如，美國專利號3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；“oligonucleotidesynthesis”gaitm.j.編輯(1984)；“nucleicacidhybridization”hames,b.d.,和higginss.j.，編輯(1985)，“transcriptionandtranslation”hames，b.d.,和higginss.j.，編輯(1984)，"animalcellculture"freshney,r.i.,編輯(1986)；"immobilizedcellsandenzymes"irlpress,(1986)；"apracticalguidetomolecularcloning"perbal,b.,(1984)以及"methodsinenzymology"vol.1-317,academicpress；"pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications",academicpress,圣地亞哥，加利福尼亞州(1990)；marshak等,"strategiesforproteinpurificationandcharacterization-alaboratorycoursemanual"cshlpress(1996)；上述所有通過參考完整并入本文。本文件提供了其它一般參考文獻。其中的過程相信為本領域所公知，將其提供以方便讀者。其中包含的所有信息通過參考并入本文。

實施例1

在植物中制備并表達青枯雷爾氏菌iii型分泌系統(tǒng)(t3ss)針通道的嵌入閉鎖元件

材料及實驗程序

基因合成，密碼子使用的表達：

根據(jù)如前所述[deane等，pnas2006103：12529-33]的弗氏志賀菌(mxih)的t3ss針的三維模板設計t3ss-ibe變體，所述模板代表假設的hrpy的自然結(jié)構模型(圖2a-f)。

系統(tǒng)地合成青枯雷爾氏菌(rs)hrpy嵌入閉鎖元件(hy-ibe)基因，并將其優(yōu)化用于目標植物密碼子使用。植物特異分泌前導肽被融合至hy–ibe的5’端，從而將成熟蛋白轉(zhuǎn)運和定位于質(zhì)外體或細胞壁內(nèi)。

雙載體中克隆并轉(zhuǎn)化：

通過xbai和saci限制性位點，合成片段被克隆至基于pbi121質(zhì)粒(ncbigenebank編號af485783)的轉(zhuǎn)化載體中camv35s組成型啟動子的下游和nos終止子的上游，所述合成片段由具有5’未翻譯的增強子的ibe1-6編碼區(qū)組成(圖7a)。

如之前對煙草植物所述[參見，例如，svab，z.,p.hajdukiewicz和p.maliga(1975)transgenictobaccoplantsbyco-cultivationofleafdiskswithppzpagrobacteriumbinaryvectors.in“methodsinplantmolecularbiology-alaboratorymanual”,p.maliga,d.klessig,a.cashmore,w.gruissem和j.varner,編輯，coldspringharborpress:55-77]，對于番茄植物，擬南芥植物和桉樹植物，以及桉樹植物[spokeviciusav.,vanbeverenk.,leitchma和bossingerg.(2005)agrobacterium-mediatedinvitrotransformationofwood-producingstemsegmentsineucalypts.plantcellreports,volume23(9),617-624]作用土壤桿菌-轉(zhuǎn)化方法。

番茄植物轉(zhuǎn)化

如前所述轉(zhuǎn)化番茄植物[qiu等，scientiahorticulturae112(2007)172-175]。簡言之：

植物材料

對番茄種子，蕃茄(l.esculentum)m82在70％酒精里進行表面消毒30秒，并用無菌水洗10秒，然后在1％次氯酸鈉溶液中滅菌10分鐘，并用無菌水洗兩次共30分鐘，隨后播種于培養(yǎng)基a中(如表7所示)。種子播種在品紅盒里，在24℃光照16小時和黑暗8小時使其發(fā)芽。播種的半直立苗的子葉在萌芽后4-5使用。

培養(yǎng)基，抗生素和激素

培養(yǎng)基msb5(m0404)獲取自sigmachemicalco.，并存儲在2-8℃。蔗糖和葡萄糖室溫下保存。植物培養(yǎng)基中還使用了卡那霉素，羧芐青霉素，頭孢噻肟，利福平，zr，iaa，iba(如下面的表7中描述)。

表7：在番茄轉(zhuǎn)化方法中使用的植物培養(yǎng)基

(摘自qiu等，scientiahorticulturae112(2007)172-175并入本文)

不同培養(yǎng)基的成分

菌株和質(zhì)粒

對于轉(zhuǎn)化實驗，使用含有目標基因的土壤桿菌。在本研究中所用的雙載體是包含作為選擇標記的nptii基因的pbi121；本研究中所用的土壤桿菌菌株載有利福平選擇標記。細菌在lb培養(yǎng)基中生長過夜，培養(yǎng)基中含抗生素(利福平30mg/l，卡那霉素100mg/l)，稀釋至od600＝0.2，并在無抗生素的lb中生長至希望od600。細菌懸浮液在50毫升隼(falcon)管中于4000rpm下離心15分鐘。細菌重懸于b1培養(yǎng)基中，并用于共培養(yǎng)實驗。

轉(zhuǎn)化方法

子葉的制備如下：從幼苗中非常小心地切除子葉，以防止擦傷。分離的子葉僅在基底和側(cè)面切割，并倒置到培養(yǎng)基b(如表7所示)上。約50個外植塊被置于單個有蓋培養(yǎng)皿(petridish)中培養(yǎng)過夜。次日在有蓋培養(yǎng)皿(petridish)中將外植體小心的浸入土壤桿菌接種物中20分鐘。將其在無菌紙上印干，并轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基b中。72小時后，將外植體轉(zhuǎn)移到含有培養(yǎng)基c(如表7所示)的盤中。每3周將外植體傳代至相同的培養(yǎng)基中。在約6-8周后，切除芽，并轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基e(如表7所示)中。轉(zhuǎn)化頻率表示為從中回收芽的子葉數(shù)量對培育的外植體總數(shù)的百分比。

表達和克隆確認：

使用常規(guī)的分子方法，如pcr，rt-pcr，以及western分析法分析t3ss-ibe在植物基因組中的整合及表達[如前所述，參見，例如sambrookj.和russelldw.,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress；第3版(2001年1月15日)]，所述分子方法中使用ibe1-6特異性引物，所述western分析使用抗ibe的多克隆抗體。具體而言，用于hrpy1突變體的pcr引物為正向引物：

tctctttgctctcctttatagccctac和反向引物：

tcgcagcgtctaacatatcttgttgtc(分別為seqidno:95-96)；用于hrpy2突變體的引物為正向引物：gtcacatggttcgttggtgtactcttc和反向引物：

catctgggttctattcagcgcattttg(分別為seqidno:97-98)；并且用于hrpy突變體6的引物為正向引物：gtcttgttcctgtctaccttgctcc和反向引物：

gagattaggtctttcgcagctttgg(分別為seqidno:93-94)。

生物測定：

用生物測定測試轉(zhuǎn)基因植物的每個轉(zhuǎn)基因株相對于野生型(即，不表達ibe基因)的抗性水平。使用了三種生物測定方法：

1.浸泡土壤-接種無創(chuàng)傷的19至20天的植物：所述接種通過將細菌懸液倒入土壤中直至終密度約1×10⁸cfu/g土，然后在28℃保溫。用無菌水模擬接種對照植物。由評價者每天對癥狀以0至4的疾病指數(shù)進行評分，評價者并不知曉治療，其中0表示沒有疾病，1表示125％的葉片萎蔫，2表示2550％的葉片萎蔫，3表示51～75％的葉片萎蔫，4表示76～100％的葉片萎蔫。每個實驗包括：每種治療16株植物，并且實驗至少重復3次。

2.帶柄接種–切割下葉未創(chuàng)傷的19至21天植物，將2微升細菌懸液，以終密度約1×10⁸cfu/ml滴到開葉柄上。用無菌水模擬接種對照植物。由評價者每天對癥狀以0至4的疾病指數(shù)進行評分，評價者并不知曉治療，其中0表示沒有疾病，1表示125％的葉片萎蔫，2表示2550％的葉片萎蔫，3表示51～75％的葉片萎蔫，4表示76～100％的葉片萎蔫。每個實驗包括：每種治療16株植物，并且實驗至少重復3次。

3.莖接種–接種未創(chuàng)傷的19至21天的植物，所述接種通過用無菌刀垂直切割莖。向1厘米長和0.5厘米深的傷口注射100μl終密度約1×10⁸cfu/ml的細菌懸液。用無菌水模擬接種對照植物。由評價者每天對癥狀以0至4的疾病指數(shù)進行評分，評價者并不知曉治療，其中0表示沒有疾病，1表示125％的葉片萎蔫，2表示2550％的葉片萎蔫，3表示51～75％的葉片萎蔫，4表示76～100％的葉片萎蔫。每個實驗包括：每種治療16株植物，并且實驗至少重復3次。

結(jié)果

本發(fā)明通過對hrpy蛋白的結(jié)構修飾，生成了青枯雷爾氏菌(rs)iii型分泌系統(tǒng)(t3ss)針通道的植物表達閉鎖元件(t3ss或t3ss-ibe的嵌入閉鎖元件)，用于保護植物不得萎蔫病，所述hrpy蛋白為所述針的構建單體。將轉(zhuǎn)基因植物(作物和木本)中結(jié)構修飾的hrpy(seqidno:2，4，6，8，10和12和在圖2a-f，圖3a-d，圖4a-c，5a-c和6a-d中詳細描述)整合入rs的天然菌毛，使其功能失活，并且與野生型植物相比，阻止或減少rs對轉(zhuǎn)基因植物的細菌感染。設計表達t3ss-ibe的轉(zhuǎn)基因植物，使其分泌t3ss-ibe至細胞外，t3ss-ibe在細胞外組裝成進行攻擊的rs的菌毛，從而使所述菌毛無功能或功能失調(diào)。具有嵌入在細菌菌毛中的結(jié)構修飾的植物源性蛋白的細菌，能使t3ss無功能，并因此無法克服植物的天然防御。這樣的轉(zhuǎn)基因抗性植物是能夠抵御rs感染的。

根據(jù)如前所述的shigelaflexneri(mxih)t3ss針的三維模型[deane等，pnas2006103：12529-33]，設計t3ss-ibe的變體?；谶@個模型，預計結(jié)構修改的rshrpy能產(chǎn)生修飾的t3ss針單體，所述針單體能嵌入針結(jié)構內(nèi)，并阻斷針通道和導管。植物細胞壁降解果膠酶，內(nèi)切葡聚糖酶，和毒力eps和效應蛋白質(zhì)都通過所述導管轉(zhuǎn)運進入或通過宿主細胞壁(圖1a-c)。因此，修飾后的菌毛含有位于菌毛導管內(nèi)的結(jié)構變化了的蛋白質(zhì)結(jié)構域，并因此可理解為可以在功能上和物理上阻斷導管。該菌毛由于結(jié)構不穩(wěn)定將終止其早期組裝，這導致相對短的菌毛，并將進一步損害其功能及將蛋白轉(zhuǎn)移至植物的能力。這種合理的設計基于在保護和利用天然hrpy的亞單位-亞單位相互作用位點的同時，在翻譯水平上整合融合的通道阻斷肽和/或使α-螺旋結(jié)構變形。這些t3ss-ibe包含植物分泌信號，從而能從植物細胞分泌至細胞外的空間。

如上文中“材料和實驗方法”部分中所述，通過用構建子轉(zhuǎn)化蕃茄，從而產(chǎn)生萎蔫抗性(wiltr)的番茄植物，所述構建子載有青枯雷爾氏菌hrpy突變1，2或6(分別為seqidno：1，3和11)。通過基因組pcr和半定量rt-pcr進一步分析這些植物，所述分析使用特異于hrpy突變1的引物(seqidno:95-96)，特異于hrpy突變2的引用(seqidno:97-98)或特異于hrpy突變6的引物(seqidno:93-94)。測定轉(zhuǎn)化的蕃茄植物中hrpy突變1，2或6的表達(分別參見圖11a-c，圖12a-c和圖10a-c)。

實施例2

在植物中制備和表達不同細菌的t3ss-ibe

除了上文實施例1中描述的ibe外，正通過上述方法開發(fā)和識別針對其它革蘭氏陰性菌的其它ibe。例如，通過下述方法開發(fā)ibe：通過繪制菌毛構建蛋白的結(jié)合區(qū)域，確定在天然菌毛在體內(nèi)形成時，結(jié)合并整合入天然菌毛的候選肽，對候選肽進行修飾，從而使導管不能分泌效應蛋白和產(chǎn)生修飾的候選ibe。

修飾可包括任何基于以下原則的那些修飾：

在概念上而言，天然蛋白質(zhì)可以根據(jù)許多不同方法中的一種或多種來進行修飾，所述不同方法包括：

1.將翻譯融合體加入天然蛋白的n-末端區(qū)域，天然蛋白如ibe1，2和3，其帶有(ibe1&3)或不帶有(ibe2)天然n-末端結(jié)構域，以及在天然n-末端結(jié)構域之前(ibe1)或之后(ibe3)(參見圖3a-d，4a-c和7c)。

2.將翻譯融合體加入天然蛋白的c-末端區(qū)域，天然蛋白如ibe4，其帶有或不帶有氨基酸橋，所述氨基酸橋使得翻譯融合片段能夠旋轉(zhuǎn)運動(參見圖5a-c和7c)。這樣的橋可以是，例如，一個或多個甘氨酸或丙氨酸殘基。

3.將脯氨酸氨基酸加入沿天然結(jié)構單元序列的隨機點，如ibe5或6中(參見圖6a-d和7c)。

4.插入五肽。

實施例3

在植物中制備和表達修飾的青枯雷爾氏菌易位子蛋白(popf1)

本發(fā)明采用的另一種方法是在轉(zhuǎn)基因植物中過表達野生型(wt)和修飾rs易位子蛋白(如popf1或popf2)。popf1popf2是針門的結(jié)構單元，并在毒力和植物過敏性反應(hr)中發(fā)揮重要作用。過表達的野生型和修飾的popf1/f2蛋白通過與不成熟的針的相互作用能阻止t3ss組裝。在該過程的最后階段，通常會出現(xiàn)細菌控制的針延伸以及易位子蛋白。轉(zhuǎn)基因易位子蛋白過早地與針相互作用，干擾受控制的連續(xù)的t3ss組裝并使其失活。因此，修飾的popf1/f2蛋白被整合入易位子門，并阻止它或使其結(jié)構變形從而引起功能失調(diào)。綜上所述，本發(fā)明的教導能允許野生型和修飾的popf1蛋白被轉(zhuǎn)基因植物輸出至質(zhì)外體/細胞壁。

雖然本發(fā)明已結(jié)合其具體的實施方式進行了描述，顯而易見的是，許多替換，修改和變化對于本領域技術人員將是顯而易見的。因此，其意在包括落入本發(fā)明權利要求書精神和范圍之內(nèi)的所有這些替換，修改和變化。

在本說明書中提到的所有公開文獻、專利和專利申請全文并入本文的說明書中，其并入的程度相當于每個單獨的公開文獻、專利或?qū)＠暾埍痪唧w地和單獨地指出從而通過引用并入本文。此外，本申請中對任何參考文獻的引用或標識并不應解釋為承認這些參考文獻是本發(fā)明的現(xiàn)有技術。本文中各章節(jié)使用的標題不應該被解釋為限制性的。