本發(fā)明屬于抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因水稻Bt63的檢測(cè)技術(shù)，尤其涉及抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因水稻Bt63的現(xiàn)場(chǎng)定量檢測(cè)技術(shù)，具體為米或米制品中是否含有轉(zhuǎn)基因水稻Bt63的檢測(cè)法。
背景技術(shù)：
：近年來(lái)，全球轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化迅猛發(fā)展，種植面積由1996年的170萬(wàn)公頃增加至2014年的1.8億公頃，19年中增加了100多倍。水稻是世界上最重要的糧食作物之一，在我國(guó)糧食生產(chǎn)中占有舉足輕重的地位，轉(zhuǎn)基因水稻研發(fā)進(jìn)展也較為迅速，已經(jīng)有多個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻優(yōu)良品系進(jìn)入環(huán)境釋放階段，申請(qǐng)商業(yè)化種植。與此同時(shí)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)環(huán)境和食品安全的潛在風(fēng)險(xiǎn)已引起全球的廣泛關(guān)注，國(guó)際貿(mào)易糾紛時(shí)有發(fā)生。2012年初，歐盟委員會(huì)發(fā)布了《對(duì)中國(guó)出口大米制品中含有轉(zhuǎn)基因成分采取緊急措施的決定》，歐盟將對(duì)中國(guó)25種米制品采取強(qiáng)制性轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)，并依據(jù)檢測(cè)結(jié)果采取退貨和銷毀處理措施，中國(guó)官方必須在向歐盟出口前提交米制品非轉(zhuǎn)基因證明的檢驗(yàn)報(bào)告，表明是否含有轉(zhuǎn)基因成分。2006年以來(lái)，已有法國(guó)、德國(guó)、意大利和奧地利等7個(gè)國(guó)家因?yàn)檗D(zhuǎn)基因大米污染對(duì)我國(guó)出口米制品采取了拒絕入境或撤架、召回等措施。另一方面，目前公眾關(guān)注的焦點(diǎn)已從“是否是轉(zhuǎn)基因”轉(zhuǎn)移到“含有哪些轉(zhuǎn)基因成分及各自的含量”上來(lái)，為滿足公眾知情權(quán)、管理水平和檢測(cè)技術(shù)能力的需求，許多國(guó)家紛紛出臺(tái)了轉(zhuǎn)基因限量規(guī)定，如歐盟規(guī)定轉(zhuǎn)基因作物的成分超過(guò)0.9％，必須進(jìn)行標(biāo)識(shí)；而日本的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為5％；我國(guó)目前的標(biāo)準(zhǔn)最為嚴(yán)格，對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)行“零容忍”，只要在產(chǎn)品中檢出轉(zhuǎn)基因成分就需要進(jìn)行標(biāo)識(shí)，考慮到轉(zhuǎn)基因低水平混雜等客觀實(shí)際，目前這一“零容忍”政策在技術(shù)執(zhí)法角度來(lái)講過(guò)于苛刻。因此，從我國(guó)各口岸轉(zhuǎn)基因檢測(cè)水平的實(shí)際出發(fā)，為國(guó)家政策部門(mén)提出合理的轉(zhuǎn)基因閾值迫在眉睫，首當(dāng)其沖的便是開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)基因成分的精準(zhǔn)定量檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的絕對(duì)定量。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：鑒于目前食品安全領(lǐng)域?qū)κ称钒踩珯z測(cè)技術(shù)和產(chǎn)品的迫切需求，本發(fā)明基于微滴式數(shù)字PCR技術(shù)，開(kāi)發(fā)了一款可用于抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因水稻Bt63的精準(zhǔn)定量檢測(cè)方法和試劑盒。所述檢測(cè)方法即為一種米或米制品中是否含有轉(zhuǎn)基因水稻Bt63的微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)方法，包括：(1)設(shè)計(jì)引物探針：設(shè)計(jì)抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因水稻Bt63的內(nèi)源和品系特異性引物探針：PLD-Forward：TGGTGAGCGTTTTGCAGTCPLD-Reverse：CTGATCCACTAGCAGGAGGTCPLD-Probe：FAM-TGTTGTGCTGCCAATGTGGCCT-TAMRABt63-Forward：AGAGACTGGTGATTTCAGCGGBt63-Reverse：GCGTCCAGAAGGAAAAGGAATBt63-Probe：FAM-ATCTGCCCCAGCACTCGTCC-BHQ1(2)提取待測(cè)樣品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照的DNA：(3)數(shù)字微滴式PCR擴(kuò)增：將步驟2)所得的待測(cè)樣品的DNA、陽(yáng)性對(duì)照的DNA、陰性對(duì)照的DNA分別利用步驟1)所得的引物探針進(jìn)行以下操作：①步驟1)所得的引物引物探針用DEPC處理水進(jìn)行溶解稀釋，引物稀釋至濃度為900nM，探針稀釋至濃度250nM；②設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)體系從而分別得待測(cè)樣品反應(yīng)體系、陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)體系、陰性對(duì)照反應(yīng)體系；③所述待測(cè)樣品反應(yīng)體系、陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)體系、陰性對(duì)照反應(yīng)體系分別進(jìn)行以下操作：將反應(yīng)體系加入微滴發(fā)生板的樣品孔中(避免產(chǎn)生氣泡)，在相應(yīng)微滴發(fā)生油孔中加入70μL微滴發(fā)生油，裝好膠條，置于微滴發(fā)生器中形成微滴。之后，將發(fā)生好的微滴用8道移液器轉(zhuǎn)移至0.2mLPCR反應(yīng)管中(緩吸緩放)，用配套鋁箔封口后，置于PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)參數(shù)為：95℃/10min；94℃/30s，57℃/30s，40個(gè)循環(huán)；98℃/10min。Ramprate2℃/s。從而分別得待測(cè)樣品反應(yīng)液、陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)液、陰性對(duì)照反應(yīng)液；(4)結(jié)果檢測(cè)與分析：將步驟(3)所得的反應(yīng)液放入微滴式數(shù)字PCR儀的微滴分析器中，并在軟件QuantaSoft上設(shè)定檢測(cè)模式為ABS，檢測(cè)FAM的熒光信號(hào)。儀器會(huì)自動(dòng)分析每個(gè)微滴中熒光信號(hào)，然后，由QuantaSoft計(jì)算各樣品相關(guān)基因拷貝數(shù)濃度。本發(fā)明所述的引物可委托TAKARA公司制備，HPLC純化。本發(fā)明的步驟(3)的設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)體系中：2×ddPCRTMSupermixforProbes可通過(guò)市購(gòu)的方式獲得。本發(fā)明還提供一種米或米制品中是否含有轉(zhuǎn)基因水稻Bt63的微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)試劑盒，包括：抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因水稻Bt63的內(nèi)源引物和探針：PLD-Forward：TGGTGAGCGTTTTGCAGTCPLD-Reverse：CTGATCCACTAGCAGGAGGTCPLD-Probe：FAM-TGTTGTGCTGCCAATGTGGCCT-TAMRA抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因水稻Bt63品系的特異性引物和探針：Bt63-Forward：AGAGACTGGTGATTTCAGCGGBt63-Reverse：GCGTCCAGAAGGAAAAGGAATBt63-Probe：FAM-ATCTGCCCCAGCACTCGTCC-BHQ1。所述試劑盒還包括2×ddPCRTMSupermixforProbes。在本發(fā)明中，提取待測(cè)樣品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照的DNA可使用CTAB分步離心法進(jìn)行DNA提取，或使用性能等同或超過(guò)本方法的DNA提取試劑盒(如QIAGENDNA提取試劑盒等)，當(dāng)采用商業(yè)試劑盒時(shí)，則操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。本發(fā)明屬于基于核酸的食品安全檢測(cè)領(lǐng)域，不同于傳統(tǒng)的核酸擴(kuò)增，檢測(cè)靈敏度高，能實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定量檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的絕對(duì)定量。并且該方法還具有很強(qiáng)的前瞻性，可以方便的增加所需要檢測(cè)的其他轉(zhuǎn)基因品種。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。以下實(shí)施例1中所用到的5份樣品，預(yù)先按照傳統(tǒng)的熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，具體檢測(cè)結(jié)果如表1所示。表1熒光定量PCR方法檢測(cè)結(jié)果備注說(shuō)明：1、陽(yáng)性對(duì)照(positive)為Bt63轉(zhuǎn)基因水稻標(biāo)準(zhǔn)品。2、陰性對(duì)照(negative)為非轉(zhuǎn)基因稻米。實(shí)施例1米或米制品中是否含有轉(zhuǎn)基因水稻Bt63的檢測(cè)以表1中的樣品1～5作為待測(cè)樣品，以Bt63轉(zhuǎn)基因水稻標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性對(duì)照，以非轉(zhuǎn)基因稻米為陰性對(duì)照；依次進(jìn)行以下步驟：1)設(shè)計(jì)引物：設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)基因水稻Bt63的對(duì)應(yīng)探針引物，已采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)設(shè)計(jì)合成的內(nèi)源基因和品系基因引物探針進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明所有引物探針均能有效擴(kuò)增出靶基因(表1)，具體為：PLD-Forward：TGGTGAGCGTTTTGCAGTCPLD-Reverse：CTGATCCACTAGCAGGAGGTCPLD-Probe：FAM-TGTTGTGCTGCCAATGTGGCCT-TAMRABt63-Forward：AGAGACTGGTGATTTCAGCGGBt63-Reverse：GCGTCCAGAAGGAAAAGGAATBt63-Probe：FAM-ATCTGCCCCAGCACTCGTCC-BHQ12)待測(cè)大米或米制品的前處理，依次進(jìn)行以下步驟：使用CTAB分步離心法進(jìn)行DNA提取，從而提取獲得待測(cè)樣品(即樣品1～5)的DNA、陽(yáng)性對(duì)照的DNA、陰性對(duì)照的DNA。3)數(shù)字微滴式PCR擴(kuò)增：將步驟2)所得的待測(cè)樣品的DNA(即，樣品1～5的DNA)、陽(yáng)性對(duì)照的DNA、陰性對(duì)照的DNA分別利用步驟1)的引物組進(jìn)行以下操作：引物的溶解稀釋：引物用DEPC處理水稀釋至濃度成900nM；探針用DEPC處理水稀釋至濃度成250nM。設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)體系，見(jiàn)表2：表2PCR反應(yīng)體系從而分別得待測(cè)樣品反應(yīng)體系、陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)體系、陰性對(duì)照反應(yīng)體系；③所述待測(cè)樣品反應(yīng)體系、陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)體系、陰性對(duì)照反應(yīng)體系分別進(jìn)行以下操作：將反應(yīng)體系加入微滴發(fā)生板的樣品孔中(避免產(chǎn)生氣泡)，在相應(yīng)微滴發(fā)生油孔中加入70μL微滴發(fā)生油，裝好膠條，置于微滴發(fā)生器中形成微滴。之后，將發(fā)生好的微滴用8道移液器轉(zhuǎn)移至0.2mLPCR反應(yīng)管中(緩吸緩放)，用配套鋁箔封口后，置于PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)參數(shù)為：95℃/10min；94℃/30s，57℃/30s，40個(gè)循環(huán)；98℃/10min。Ramprate2℃/s。從而分別得待測(cè)樣品反應(yīng)液、陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)液、陰性對(duì)照反應(yīng)液；4)結(jié)果的判讀：將步驟3)所得的反應(yīng)液放入微滴式數(shù)字PCR儀的微滴分析器中，并在軟件QuantaSoft上設(shè)定檢測(cè)模式為ABS，檢測(cè)FAM的熒光信號(hào)。儀器會(huì)自動(dòng)分析每個(gè)微滴中熒光信號(hào)，然后，由QuantaSoft計(jì)算各樣品相關(guān)基因拷貝數(shù)濃度。具體結(jié)果如表3所示。表3微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性對(duì)照(positive)檢出陰性對(duì)照(negative)未檢出轉(zhuǎn)基因大米Bt63(1)檢出轉(zhuǎn)基因大米科峰6號(hào)(2)未檢出轉(zhuǎn)基因大米克螟稻(3)未檢出轉(zhuǎn)基因大米LLRICE601(4)未檢出米粉(5)未檢出實(shí)施例2以非轉(zhuǎn)基因大米及含量為0.1％、1％、10％的轉(zhuǎn)基因水稻Bt63樣品為模板，進(jìn)行3次的重復(fù)定量試驗(yàn)，驗(yàn)證數(shù)字PCR檢測(cè)方法的定量靈敏度。在非轉(zhuǎn)基因大米定量結(jié)果為0％時(shí)，10％轉(zhuǎn)基因大米Bt63樣品檢測(cè)結(jié)果為9.94％，1％轉(zhuǎn)基因大米Bt63樣品檢測(cè)結(jié)果為1.01％，0.1％轉(zhuǎn)基因大米Bt63樣品檢測(cè)結(jié)果為0.114％，表明本研究建立的ddPCR方法對(duì)轉(zhuǎn)基因大米Bt63的定量檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.1％，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。表4不同含量Bt63水稻樣品定量檢測(cè)結(jié)果理論值(％)重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3平均值(％)109.959.899.979.9410.9751.0181.0231.010.100.1120.1090.1210.1140000/當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3