本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，更具體地說，涉及擬柱孢藻毒素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及單克隆抗體的制備方法。
背景技術(shù)：
藍(lán)藻毒素是由淡水水體中某些有毒水華藍(lán)藻產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，常見種類包括微囊藻毒素、魚腥藻毒素和擬柱孢藻毒素等，會(huì)對人體產(chǎn)生潛在的肝毒性、神經(jīng)毒性、基因毒性、胚胎毒性和致癌性，因此飲用水中藻毒素的殘留會(huì)為人類帶來嚴(yán)重的健康風(fēng)險(xiǎn)。
擬柱孢藻毒素(Cylindrospermopsin，CYN)主要由擬柱孢藻(Cylindrospermopsis raciborskii)產(chǎn)生，是藍(lán)藻毒素中近年來非常受關(guān)注的新型種類之一，目前，擬柱孢藻毒素已在澳大利亞、美國、德國、巴西等多個(gè)國家的富營養(yǎng)化水體中檢測到，我國廣東省的某些水庫擬柱孢藻毒素濃度也高達(dá)8.25μg·L-1。
擬柱孢藻毒素是一種分子量為415.43的生物堿(C15H21N5O7S),,對小鼠具急性毒性，腹腔注射小鼠的LD50為2.1mg·kg-1。研究表明，CYN進(jìn)入體內(nèi)后可損傷肝臟、腎臟、心臟等多個(gè)器官，進(jìn)入細(xì)胞后可抑制蛋白合成，損傷DNA，具廣泛的細(xì)胞毒性，可作用于大量的水生、半水生植物和動(dòng)物及浮游植物；另外，CYN還可以在生物中富集和轉(zhuǎn)移，這使得該毒素的環(huán)境影響延伸至陸生生物，更有研究認(rèn)為CYN是一種潛在的致癌物，嚴(yán)重危害人類健康。
抗體作為診斷和分析試劑已被研究和開發(fā)了近一個(gè)世紀(jì)。一個(gè)多世紀(jì)以來，抗體作為體內(nèi)最奇妙的蛋白質(zhì)分子，一直是生命科學(xué)，尤其是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，為人類多種疾病的預(yù)防、診斷和治療做出了巨大貢獻(xiàn)。抗體技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了三個(gè)階段，傳統(tǒng)抗體是用抗原免疫動(dòng)物后獲得的，稱為多克隆抗體，也稱第一代抗體。多克隆抗體可用于一般抗原的檢測以及被動(dòng)免疫治療等。由于這種抗體的成分復(fù)雜，制備費(fèi)用高，只在感染早期有效，具有一定的毒性，故使其廣泛應(yīng)用受到限制。
1975年，第二代抗體——B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的單克隆抗體的出現(xiàn)，成為生命科學(xué)劃時(shí)代的偉大進(jìn)展之一。雜交瘤技術(shù)主要依賴于一個(gè)骨髓瘤細(xì)胞系與免疫動(dòng)物的B細(xì)胞相融合，獲得的融合細(xì)胞既具有B細(xì)胞分泌特異性抗體的能力，又具有小鼠骨髓瘤細(xì)胞永生的特性。目前這一技術(shù)仍是生物技術(shù)中的核心技術(shù)之一，成千上萬的醫(yī)學(xué)及診斷學(xué)相關(guān)的雜交瘤細(xì)胞已經(jīng)形成。單克隆抗體的分泌細(xì)胞都來源于同一祖先細(xì)胞，抗體具有極高的均一性，其與抗原的反應(yīng)性具有多克隆抗體無法比擬的特異性，因此引發(fā)了生命科學(xué)研究及臨床疾病診斷、治療的重大革新，以單克隆抗體為基本技術(shù)衍生出的診斷、治療技術(shù)層出不窮。單抗已用于器官移植、腫瘤、感染性疾病、心血管疾病和炎癥等多種疾病的治療，成為研發(fā)最活躍的生物技術(shù)藥物之一。
ELISA是酶聯(lián)免疫吸附性試驗(yàn)(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)的簡稱。此項(xiàng)技術(shù)自70年代初問世以來，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。以ELISA為主的免疫學(xué)檢測法近十年來被廣泛應(yīng)用于藍(lán)藻毒素的檢測，ELISA法具有快速、靈敏度高、樣品前處理簡單等優(yōu)點(diǎn)，市場應(yīng)用前景廣闊。目前市場上出售的兩種CYN試劑盒(Beacon和Abraxis LLC)均是基于兔多克隆抗體而建立的直接競爭ELISA法，兩者的檢測限分別為0.1和0.05ppb，檢測范圍均在2ppb以內(nèi)，ELISA法的靈敏度明顯高于CYN的化學(xué)和生物測試法。
目前市售的進(jìn)口擬柱孢藻毒素ELISA試劑盒極為昂貴，單個(gè)樣品檢測成本達(dá)上百元，且線性范圍極窄。目前國外有有基于CYN抗體的ELISA試劑盒出售，但尚沒有單獨(dú)的CYN抗體產(chǎn)品。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供了擬柱孢藻毒素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟：
步驟一，制備KLH-CYN連接物；
步驟二，用所述KLH-CYN連接物免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；
步驟三，對所述步驟二的所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清進(jìn)行效價(jià)測定；
步驟四，取血清效價(jià)大于1:104的所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫、細(xì)胞融合、并篩選得到雜交瘤細(xì)胞株。
進(jìn)一步的，所述步驟一，KLH-CYN連接物制備方法為：將KLH蛋白直接溶于磷酸鹽緩沖液，隨后加入CYN和甲醛并攪拌反應(yīng)，反應(yīng)完成后進(jìn)行透析。
進(jìn)一步的，所述步驟二中用所述KLH-CYN連接物免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括如下步驟：
步驟一，取KLH-CYN連接物對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥；
步驟二，采集實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清；
步驟三，利用間接ELISA法實(shí)時(shí)檢測血清達(dá)到1:104以上時(shí)，待用。
進(jìn)一步的，所述步驟三中所述效價(jià)測定方法包括如下步驟：
步驟一，制備BSA-CYN連接物，溶于碳酸鹽緩沖液并包被酶標(biāo)板；
步驟二，取免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清加入所述酶標(biāo)板，并加入標(biāo)記物；
步驟三，顯色并測試免疫血清的效價(jià)。
進(jìn)一步的，所述步驟三中所述效價(jià)測定的方法為間接ELISA法。
進(jìn)一步的，所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為BALB/c小鼠。
本申請?zhí)峁┮环N擬柱孢藻毒素單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：
步驟一，將所述擬柱孢藻毒素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行增殖；
步驟二，對增殖的所述擬柱孢藻毒素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行純化。
所述步驟一中的所述增殖包括如下步驟：
步驟一，將所述雜交瘤細(xì)胞以1×106/只的量注入經(jīng)過液體石蠟預(yù)處理的8-10周齡的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹腔；
步驟二，飼養(yǎng)6-7天后抽取腹水。
所述步驟二中所述純化包括如下步驟：取腹水，離心，通過純化柱洗脫。
所述純化柱采用Protein G填料。
本申請中，首先，制備了BSA-CYN連接物和KLH-CYN連接物；進(jìn)一步的，取KLH-CYN連接物對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行了免疫，采用間接ELISA法測定免疫血清效價(jià)來跟蹤實(shí)驗(yàn)過程，取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清效價(jià)達(dá)到1:104進(jìn)行進(jìn)一步加強(qiáng)免疫，并進(jìn)行細(xì)胞融合，再通過間接ELISA法進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn)，最后獲得穩(wěn)定分泌擬柱孢藻毒素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。
進(jìn)一步的，將擬柱孢藻毒素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞通過增殖和純化，得到擬柱孢藻毒素單克隆抗體。
目前市售的進(jìn)口擬柱孢藻毒素ELISA試劑盒極為昂貴，單個(gè)樣品檢測成本達(dá)上百元，且線性范圍極窄。目前國外有有基于CYN抗體的ELISA試劑盒出售，但尚沒有單獨(dú)的CYN抗體產(chǎn)品。本申請中的擬柱孢藻毒素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的制備方法和擬柱孢藻毒素單克隆抗體的制備方法首次實(shí)現(xiàn)了CYN抗體產(chǎn)品的制備，填補(bǔ)了國內(nèi)產(chǎn)品的空白。
附圖說明
應(yīng)當(dāng)理解的是，以下附圖僅示出了本申請的某些實(shí)施例，因此不應(yīng)被看作是對范圍的限定，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。
圖1為本申請中單克隆抗體與擬柱孢藻毒素反應(yīng)特性圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例的方式對本發(fā)明的權(quán)利要求做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進(jìn)，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實(shí)施的限制。
本申請?zhí)峁┝藬M柱孢藻毒素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟：
步驟一，制備KLH-CYN連接物；
步驟二，用所述KLH-CYN連接物免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；
步驟三，對所述步驟二的所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清進(jìn)行效價(jià)測定；
步驟四，取血清效價(jià)大于1:104的所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫、細(xì)胞融合、并篩選得到雜交瘤細(xì)胞株。
需要理解的是，藍(lán)藻毒素是由淡水水體中某些有毒水華藍(lán)藻產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，包括微囊藻毒素、魚腥藻毒素和擬柱孢藻毒素等會(huì)對人體產(chǎn)生潛在的肝毒性和神經(jīng)毒性，導(dǎo)致健康風(fēng)險(xiǎn)，備受關(guān)注。
需要理解的是，擬柱孢藻毒素(Cylindrospermopsin，CYN)是藍(lán)藻毒素中近年來非常關(guān)注的新型種類之一，主要由擬柱孢藻(Cylindrospermopsis raciborskii)產(chǎn)生。擬柱孢藻毒素已在澳大利亞、美國、德國、巴西等多個(gè)國家的富營養(yǎng)化水體中檢測到，我國廣東省的某些水庫擬柱孢藻毒素濃度也高達(dá)8.25μg·L-1。
需要理解的是，擬柱孢藻毒素是由擬柱孢藻等藍(lán)藻產(chǎn)生的一種藍(lán)藻毒素，是一種分子量為415.43的生物堿(C15H21N5O7S),對小鼠具急性毒性，腹腔注射小鼠的LD50為2.1mg·kg-1。研究表明，CYN進(jìn)入體內(nèi)后可損傷肝臟、腎臟、心臟等多個(gè)器官，進(jìn)入細(xì)胞后可抑制蛋白合成，損傷DNA，具廣泛的細(xì)胞毒性，可作用于大量的水生、半水生植物和動(dòng)物及浮游植物；另外，CYN還可以在生物中富集和轉(zhuǎn)移，這使得該毒素的環(huán)境影響延伸至陸生生物，更有研究認(rèn)為CYN是一種潛在的致癌物，嚴(yán)重危害人類健康。因此研究者一直致力于發(fā)展更敏感、有效的監(jiān)測方法，以便對有毒物質(zhì)的出現(xiàn)進(jìn)行有效預(yù)警，減少毒性事件的發(fā)生，保障供水安全。
進(jìn)一步的，所述步驟一，KLH-CYN連接物制備方法為：將KLH蛋白直接溶于磷酸鹽緩沖液，隨后加入CYN和甲醛并攪拌反應(yīng)，反應(yīng)完成后進(jìn)行透析。
需要理解的是，鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)是具有高度免疫原性的蛋白大分子，作為載體蛋白用于免疫原的制備，交聯(lián)于半抗原和其他抗原，增強(qiáng)小分子化合物的免疫原性。
上述，KLH-CYN連接物可自行制備，具體步驟為，將的1.5mg KLH蛋白直接溶于200μL的磷酸鹽緩沖液，隨后加入250μg CYN，再加入甲醛6μL，在室溫黑暗條件下攪拌反應(yīng)50小時(shí)，連接反應(yīng)完成后進(jìn)行透析，凍干備用。
進(jìn)一步的，所述步驟二中用所述KLH-CYN連接物免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括如下步驟：
步驟一，取KLH-CYN連接物對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥；
步驟二，采集實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清；
步驟三，利用間接ELISA法實(shí)時(shí)檢測血清達(dá)到1:104以上時(shí)，待用。
上述，免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物方法為：取凍干的KLH-CYN連接物與250μL佐劑混合，以100μg/500μL的量腹部皮下多點(diǎn)注射BALB/c小鼠，間隔三周以100μg/500μL的量腹部皮下多點(diǎn)注射BALB/c小鼠，從第三次免疫開始，每次免疫后的第二周尾靜脈采集小鼠血，間接ELISA方法檢測血清效價(jià)達(dá)到1:104以上后準(zhǔn)備融合，融合前3天，尾靜脈注射加強(qiáng)免疫一次，抗原劑量100μg。
進(jìn)一步的，所述步驟三中所述效價(jià)測定方法包括如下步驟：
步驟一，制備BSA-CYN連接物，溶于碳酸鹽緩沖液并包被酶標(biāo)板；
步驟二，取免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清加入所述酶標(biāo)板，并加入標(biāo)記物；
步驟三，顯色并測試免疫血清的效價(jià)。
需要理解的是，牛血清白蛋白(BSA)，又稱第五組分，是牛血清中的一種白蛋白，在生化實(shí)驗(yàn)中有廣泛的應(yīng)用。
上述，本申請中采用間接ELISA法測定免疫血清效價(jià)。
上述，BSA-CYN連接物可自行制備，具體方法為：將10mg BSA溶于MES緩沖液中，隨后將同樣溶解的EDC和NHS液體緩慢加入BSA溶液中，混合后室溫放置5分鐘，再將1M的Jeffamine(聚醚胺)50μL加入上述混合液中，并反應(yīng)3小時(shí)。Jeffamine-BSA連接物用PD-10柱子純化后凍干。將2mg的冷凍干燥的Jeffamine-BSA溶于400μL的磷酸鹽緩沖液，隨后加入CYN 550μg，再加入甲醛約12μL，在室溫黑暗條件下攪拌反應(yīng)50小時(shí)，連接反應(yīng)完成后進(jìn)行透析，凍干備用。
進(jìn)一步的，對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清進(jìn)行間接ELISA法測定效價(jià)，取30μg BSA-CYN連接物溶解于碳酸鹽緩沖液，包被于酶標(biāo)板，100μL/孔，4℃過夜。次日，使用PBS緩沖液(含有0.1％(V/V)Tween-20)洗板三次，用0.5％明膠封閉液200μL/孔，37℃封閉1小時(shí)，使用PBS緩沖液洗板三次，小鼠于第三次免疫后15天尾靜脈采血，鼠免疫血清用含2％新生牛血清10mM PBS緩沖液稀釋，加入酶標(biāo)板，100μL/孔37℃1小時(shí)，洗板三次后加入1：104倍稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG，100μL/孔37℃1小時(shí)，洗板后100μL/孔加入TMB顯色，室溫避光20min，加50μL/孔2M H2SO4終止反應(yīng)，測450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作為陰性對照，以測定值與對照值得比≥2.1為陽性來判斷免疫血清的效價(jià)。
進(jìn)一步的，所述步驟三中所述效價(jià)測定的方法為間接ELISA法。
需要理解的是，ELISA是酶聯(lián)免疫吸附性試驗(yàn)的簡稱。ELISA法是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)自70年代初問世以來，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。
以ELISA(酶聯(lián)免疫吸附性試驗(yàn))為主的免疫學(xué)檢測法近十年來被廣泛應(yīng)用于藍(lán)藻毒素的檢測，ELISA法具有快速、靈敏度高、樣品前處理簡單等優(yōu)點(diǎn)，市場應(yīng)用前景廣闊。目前市場上出售的幾種CYN試劑盒均是基于兔多克隆抗體而建立的直接競爭ELISA法，兩者的檢測限分別為0.1和0.05ppb，檢測范圍均在2ppb以內(nèi)，ELISA法的靈敏度明顯高于檢測CYN的化學(xué)和生物測試法。
進(jìn)一步的，所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為BALB/c小鼠。
需要理解的是，BALB/c是白變種實(shí)驗(yàn)室老鼠，與眾多常用亞系一樣，起源于小家鼠Mus musculus。從1920年它們在紐約誕生至今，BALB/c小鼠在全球研究機(jī)構(gòu)繁衍了超過200代，廣泛用于免疫學(xué)、生理學(xué)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
本申請?zhí)峁┮环N擬柱孢藻毒素單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：
步驟一，將所述擬柱孢藻毒素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行增殖；
步驟二，對增殖的所述擬柱孢藻毒素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行純化。
所述步驟一中的所述增殖包括如下步驟：
步驟一，將所述雜交瘤細(xì)胞以1×106/只的量注入經(jīng)過液體石蠟預(yù)處理的8-10周齡的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹腔；
步驟二，飼養(yǎng)6-7天后抽取腹水。
所述步驟二中所述純化包括如下步驟：取腹水，離心，通過純化柱洗脫。
所述純化柱采用Protein G填料。
上述，為本申請中提供的擬柱孢藻毒素單克隆抗體的制備方法，具體為：將雜交瘤細(xì)胞以1×106/只的量注入液體石蠟預(yù)處理的8-10周齡的BALB/c雌性小鼠腹腔，飼養(yǎng)觀察6-7天后小鼠腹部膨大時(shí)抽取腹水。7-10天后采集小鼠腹水，離心10min收集上清，用Protein G親和層析技術(shù)進(jìn)行純化：將Protein G填料裝于純化柱中，用平衡緩沖液平衡，待純化的腹水用平衡緩沖液稀釋10倍后以1.5mL/min速度上樣，上樣后用平衡緩沖液洗至基線，用洗脫緩沖液洗脫抗體，收集抗體峰，洗脫的抗體用Tris-HCl緩沖液中和后，即獲得擬柱孢藻毒素單克隆抗體。擬柱孢藻毒素單克隆抗體可于-20℃凍存。
進(jìn)一步的，本申請中制備的擬柱孢藻毒素單克隆抗體可采用直接競爭時(shí)間分辨熒光免疫分析法考查純化單抗與CYN的反應(yīng)特性，如圖1，在0.1ng/mL濃度下CYN即展示良好的競爭抑制反應(yīng)，表明擬柱孢藻毒素單克隆抗體與擬柱孢藻毒素的親和力高。
實(shí)施例
制備擬柱孢藻毒素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞及單克隆抗體需進(jìn)行以下步驟，具體為：
1、制備KLH-CYN連接物
將1.5mg KLH蛋白直接溶于200μL的磷酸鹽緩沖液，隨后加入250μg CYN，再加入甲醛6μL，在室溫黑暗條件下攪拌反應(yīng)50小時(shí)，連接反應(yīng)完成后進(jìn)行透析，凍干備用。
2、小鼠免疫
取凍干的KLH-CYN連接物與250μL佐劑混合，以100μg/500μL的量腹部皮下多點(diǎn)注射BALB/c小鼠，間隔三周以1100μg/500μL的量腹部皮下多點(diǎn)注射BALB/c小鼠，從第三次免疫開始，每次免疫后的第二周尾靜脈采集小鼠血，間接ELISA方法檢測血清效價(jià)達(dá)到1:104以上后準(zhǔn)備融合，融合前3天，尾靜脈注射加強(qiáng)免疫一次，抗原劑量100μg。
3、免疫血清效價(jià)跟蹤測定
采用間接ELISA法測定免疫血清效價(jià)。取30μg BSA-CYN溶解于碳酸鹽緩沖液，包被酶標(biāo)板，100μL/孔，4℃過夜。次日，使用PBS(含有0.1％(V/V)Tween-20)緩沖液洗板三次，用0.5％明膠封閉液200μL/孔，37℃封閉1小時(shí)，使用PBS緩沖液洗板三次，小鼠于第三次免疫后15天尾靜脈采血，鼠免疫血清用含2％新生牛血清10mM PBS緩沖液稀釋，加入酶標(biāo)板，100μL/孔37℃1小時(shí)，洗板三次后加入1：104倍稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG，100μL/孔37℃1小時(shí)，同上洗板后，TMB顯色，100μL/孔，室溫避光20分鐘，加50μL/孔2M H2SO4終止反應(yīng)，測450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作為陰性對照，以測定值與對照值得比≥2.1為陽性來判斷免疫血清的效價(jià)。
4、制備擬柱孢藻毒素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞
取血清效價(jià)大于1:104的小鼠，融合前3天，取KLH-CYN與等體積的PBS緩沖液混勻后，以每只100μg/500μL的量腹腔注射BALB/c待融合小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫。無菌取小鼠脾臟，制成脾細(xì)胞懸液與對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞株SP20按10：1的比例混合，離心，棄上清，離心管置于37℃水浴中，將在37℃水浴保溫的50％聚乙二醇用滴管一滴滴加入離心管中，邊滴邊搖動(dòng)離心管，1分鐘內(nèi)滴完，滴完后靜置2分鐘，每隔1分鐘加入37℃預(yù)熱的無血清1640培養(yǎng)基1mL、2mL、3mL、4mL、5mL和10mL來終止聚乙二醇的作用，細(xì)胞混合物離心5分鐘，棄上清，加入HAT培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞分至96孔板中，每孔200μL。培養(yǎng)三天后，觀察細(xì)胞融合情況，更換一半HAT培養(yǎng)液，連續(xù)數(shù)日，直至有克隆形成，更換HT培養(yǎng)液培養(yǎng)三天，通過間接ELISA方法篩選出能與BSA-KLH連接物反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞，更換1640完全培養(yǎng)基，即得擬柱孢藻毒素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞。
5、篩選分泌抗CYN單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞
利用間接ELISA法篩選細(xì)胞培養(yǎng)上清，選擇效價(jià)較高的陽性克隆雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆化，并用有限稀釋法連續(xù)克隆化2-3次，直至到100％細(xì)胞陽性率，最后獲得穩(wěn)定分泌抗CYN單克隆抗體細(xì)胞株1株。將克隆化后陽性率達(dá)100％的細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)后液氮凍存。
6、細(xì)胞增殖及純化
將雜交瘤細(xì)胞以1×106/只的量注入液體石蠟預(yù)處理的8-10周齡的BALB/c雌性小鼠腹腔，飼養(yǎng)觀察6-7天后小鼠腹部膨大時(shí)抽取腹水。7-10天后采集小鼠腹水，離心10分鐘收集上清，用Protein G親和層析技術(shù)進(jìn)行純化：將Protein G填料裝于純化柱中，用平衡緩沖液平衡，待純化的腹水用平衡緩沖液稀釋10倍后以1.5mL/min速度上樣，上樣后用平衡緩沖液洗至基線，用洗脫緩沖液洗脫抗體，收集抗體峰，洗脫的抗體用Tris-HCl緩沖液中和后，即得擬柱孢藻毒素單克隆抗體。擬柱孢藻毒素單克隆抗體可于-20℃凍存。
7、擬柱孢藻毒素單克隆抗體與擬柱孢藻毒素的反應(yīng)特性分析及驗(yàn)證
以直接競爭時(shí)間分辨熒光免疫分析法考查并驗(yàn)證擬柱孢藻毒素單克隆抗體與擬柱孢藻毒素的反應(yīng)特性。