本發(fā)明涉及生物制品領(lǐng)域；具體地，涉及共同培養(yǎng)表皮細(xì)胞與黑素形成細(xì)胞以形成人工表皮片的方法，以及上述人工表皮片在醫(yī)療、美容和/或物質(zhì)篩選中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

皮膚指身體表面包在肌肉外面的組織，是人體最大的器官，主要承擔(dān)著保護(hù)身體、排汗、感覺冷熱和壓力等功能。皮膚覆蓋全身，它使體內(nèi)各種組織和器官免受物理性、機(jī)械性、化學(xué)性和病原微生物性的侵襲。由于外界原因和/或生物體自身原因，皮膚可能會發(fā)生各種損傷和/或病變，其中有些損傷或病變不僅涉及皮膚表皮細(xì)胞，還涉及皮膚中的黑素細(xì)胞的缺失或損傷(例如白癜風(fēng))。

普通白癜風(fēng)是一種因皮膚黑素細(xì)胞缺失所致的疾患。其主要病因是黑素細(xì)胞自毀，從而被視為一種自身免疫疾病。白癜風(fēng)的患部會因黑色素缺失而形成白斑，從而與身體其它部位產(chǎn)生明顯色差。

目前，針對白癜風(fēng)一般會采用涂抹甾類化合物軟膏、活性型維他命軟膏等藥物的治療方式，有時也會采用他克莫司等免疫抑制劑來進(jìn)行治療。此外，現(xiàn)有療法還包括：puva療法、短波長紫外線療法，以及癥狀發(fā)展至全身時采用的內(nèi)服甾類化合物的療法。然而，上述療法均存在療效不足、治療后患部仍逐步擴(kuò)大等問題。

然而，當(dāng)身體開始對藥物產(chǎn)生耐藥性時，上述療法無法達(dá)到預(yù)期效果，且癥狀將逐步擴(kuò)大。在此情況下，可采用另一種療法，即從患者正常部位獲取皮膚，并進(jìn)行移植。這種療法的缺點(diǎn)在于，無法進(jìn)行大面積的移植¹。

還可采用的另一種療法是：從患者患部以外的、不明顯的正常身體部位采集一小塊皮膚，利用該皮膚進(jìn)行角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)，并將培養(yǎng)獲得的表皮皮片移植到患部。研究結(jié)果表明，這種療法對于節(jié)段型白癜風(fēng)有效。其之所以有效，主要是基于白癜風(fēng)的病理學(xué)：攻擊自身黑素細(xì)胞的免疫細(xì)胞侵入表皮，這不僅造成黑素細(xì)胞的死亡，連周邊的角質(zhì)形成細(xì)胞也一同被殺滅²。許多報告表明，白癜風(fēng)中，患部的角質(zhì)形成細(xì)胞也受到損傷^3-7。

據(jù)研究報道，正常情況下，角質(zhì)形成細(xì)胞在uvb的照射下會釋放出多種物質(zhì)，這些物質(zhì)會促進(jìn)毛囊部黑素形成細(xì)胞的增殖和分化^8,9。然而，受損的角質(zhì)形成細(xì)胞則缺失上述能力，這也是大多數(shù)uvb療法失效的原因。相反，只要將患部的角質(zhì)細(xì)胞替換成正常的表皮角質(zhì)細(xì)胞，就能夠治療白癜風(fēng)。這就是移植正常表皮皮片能夠治愈白癜風(fēng)的原因之一。

然而，上述這種療法的有效性僅限于針對節(jié)段型白癜風(fēng)的治療，其對于出現(xiàn)在兩側(cè)的全身型白癜風(fēng)是無效的。

根據(jù)如前文獻(xiàn)報道，白癜風(fēng)患部的黑素細(xì)胞會因受到免疫細(xì)胞的攻擊而死亡。不過，在毛囊根部區(qū)域可能仍存在一些不具有被免疫細(xì)胞識別的抗原的黑素形成細(xì)胞，因?yàn)槲词艿焦舳靡陨妗Ｓ纱?，多?shù)的uvb療法也正是利用該原理，使該部位的表皮細(xì)胞活化，分泌對黑素形成細(xì)胞的移動、分化和/或成熟有利的細(xì)胞因子，使黑素形成細(xì)胞產(chǎn)生黑色素。但是，如果該部位的黑素形成細(xì)胞也受到傷害，則不僅uvb療法會失效，移植正常的角質(zhì)形成細(xì)胞也仍然達(dá)不到治療效果。而在僅僅移植黑素細(xì)胞的情況中，若免疫細(xì)胞活動頻繁，黑素細(xì)胞的存活率也會受到免疫細(xì)胞攻擊的影響而低下¹⁰。

目前，雖然已報道了幾種無血清、無飼養(yǎng)層細(xì)胞的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)方法，但是在無血清的狀態(tài)下使細(xì)胞分化，并由此獲得可以進(jìn)行移植的皮片的培養(yǎng)方法至今無報道。并且，本領(lǐng)域中也從未曾嘗試并開發(fā)出使這樣的皮片中含有黑素形成細(xì)胞，并使其與表皮細(xì)胞共同增殖、分化的培養(yǎng)方法。

因此，本領(lǐng)域仍需要用以治療白癜風(fēng)的高安全性新型產(chǎn)品和技術(shù)手段。并且，除了針對白癜風(fēng)之外，本領(lǐng)域也仍需要用于治療或美化其他涉及皮膚表皮以及黑素形成細(xì)胞受損的皮膚癥狀和/或疾病(例如皮膚燒傷、灼傷、疤痕等)的高安全性新型產(chǎn)品和技術(shù)手段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供一種人工表皮片，所述人工表皮片的培養(yǎng)與制備過程安全性高。并且，所制得的人工表皮片還包含黑素形成細(xì)胞，這對于需要皮膚移植和/或皮膚修補(bǔ)的疾病(如白癜風(fēng))和/或狀況(如美容相關(guān)狀況)而言是極為有利的。

本發(fā)明的第一方面提供一種人工表皮片，其包含：活的黑素形成細(xì)胞和表皮細(xì)胞，其中，所述人工表皮片不包含動物源性的血清和蛋白質(zhì)以及營養(yǎng)支持細(xì)胞。

在一些實(shí)施方式中，所述人工表皮片不包含腦衍生物質(zhì)和動植物源性的過敏原物質(zhì)；在另一實(shí)施方式中，所述人工表皮片還包含用于支持所述黑素形成細(xì)胞和表皮細(xì)胞的支持材料，例如纖維蛋白凝膠。

本發(fā)明的第二方面提供一種制備人工表皮片的方法，其包括如下步驟：

(i)皮膚組織預(yù)處理：用酶溶液處理以分解皮膚組織，獲得包含活細(xì)胞的制備物；

(ii)細(xì)胞增殖與分化：使所得制備物中的細(xì)胞增殖，并分化為黑素形成細(xì)胞和表皮細(xì)胞，進(jìn)一步使所述細(xì)胞多層化以形成含有黑素形成細(xì)胞的人工表皮片；

其中，所述方法不采用動物源性的血清、蛋白質(zhì)以及營養(yǎng)支持細(xì)胞。

在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括：在用酶溶液分解皮膚組織之后，采用酶抑制劑完全抑制胰蛋白酶活性，隨后進(jìn)行細(xì)胞增殖與分化。

在另一些實(shí)施方式中，所述方法還包括在細(xì)胞增殖與分化之后進(jìn)行調(diào)配步驟，所述調(diào)配步驟將分化的細(xì)胞或碎片化的細(xì)胞皮片包埋進(jìn)入適當(dāng)載體，獲得含有分化細(xì)胞的載體。

在一些具體實(shí)施方式中，所述載體是纖維蛋白。

在另一些實(shí)施方式中，所述酶溶液包含蛋白水解酶，所述蛋白水解酶包括中性蛋白酶(例如，分散酶)、胰蛋白酶、膠原酶中的一種或多種。

在另一些實(shí)施方式中，所述分化過程中，逐步將分化培養(yǎng)液相對于增殖培養(yǎng)液的占比提高。

在一些具體實(shí)施方式中，細(xì)胞分化過程中添加的分化培養(yǎng)液與增殖培養(yǎng)液的體積比從1:2逐步過渡至全部為分化培養(yǎng)液。例如，從1:1到2:1，再到3:1，最終達(dá)到全部為分化培養(yǎng)液。

在一些具體實(shí)施方式中，所述分化培養(yǎng)液在基礎(chǔ)培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上還包含：胰島素、促腎上腺皮質(zhì)激素、全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白和維生素d。

在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞增殖的過程中，對所述細(xì)胞的傳代不超過5代。

在一些實(shí)施方式中，傳代后采用的增殖培養(yǎng)液在傳代前采用的增殖培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上另添加干細(xì)胞培養(yǎng)因子scf和wnt-3a。

本發(fā)明的第三方面提供采用本發(fā)明方法制備獲得的人工表皮片。

本發(fā)明的第四方面提供本發(fā)明的人工表皮片在制備針對以皮膚黑素細(xì)胞缺失為特征的疾病(例如，白癜風(fēng))或狀況的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第五方面提供本發(fā)明的人工表皮片在篩選用于皮膚疾病或狀況的藥物或化妝品中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的方法中，既不使用含有危險因子的培養(yǎng)液，例如，含有動物源性(例如，人源性)血清、腦衍生物質(zhì)、?；蜇i源性的蛋白質(zhì)，或者動植物源性的過敏原物質(zhì)的培養(yǎng)液，又不使用營養(yǎng)支持細(xì)胞(例如，小鼠源性的支架細(xì)胞)。所述方法安全性高，并且，所制得的人工表皮片還包含黑素形成細(xì)胞，這對于需要通過人工皮膚來治療和/或美化的疾病或狀況，尤其是以皮膚黑素細(xì)胞缺失為特征(例如白癜風(fēng))疾病或狀況的治療和/或美化而言是極為有利的。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員可對前述的技術(shù)方案和技術(shù)特征進(jìn)行任意組合而不脫離本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思和保護(hù)范圍。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，其中這些顯示僅為了圖示說明本發(fā)明的實(shí)施方案，而不是為了局限本發(fā)明的范圍。

圖1：界面培養(yǎng)vd3的濃度影響(實(shí)施例5)。(a)：1α,25(oh)2vd3:10^-11m；(b)：1α,25(oh)2vd3:10^-9m。

圖2：將含有細(xì)胞的纖維蛋白凝膠從培養(yǎng)皿中取出放置到手背上并拍攝的照片(實(shí)施例9)。

圖3：分化方法的研究1：多階分化、vd3濃度和傳代次數(shù)對于黑色素形成細(xì)胞數(shù)的影響(實(shí)施例11)。

圖4：分化方法的研究2：細(xì)胞因子和vd3對于黑素形成細(xì)胞成熟的影響(實(shí)施例12)。(a)：對照；(b)：添加細(xì)胞因子；(c)：添加細(xì)胞因子+vd3。

圖5：分化方法的研究3：細(xì)胞因子和vd3對于黑素形成細(xì)胞數(shù)量的影響(實(shí)施例13)。(a)：對照；(b)：添加細(xì)胞因子；(c)：添加vd3。

圖6：分化方法的研究4：acth對于角質(zhì)形成細(xì)胞的維持作用(實(shí)施例14)。分化時維持基底細(xì)胞：(a)acth(+)，(b)acth(-)；上下圖放大倍率相同。

圖7：分化方法的研究5：胰島素、全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白對于分化的影響(實(shí)施例15)。分化時添加acth基礎(chǔ)上再加胰島素與轉(zhuǎn)鐵蛋白(即it)，獲得的多層化結(jié)果與應(yīng)用血清時所得結(jié)果相同。

圖8：分化方法的研究6：細(xì)胞因子對于酪氨酸酶活性的影響(實(shí)施例16)。(a)：wnt+scf；(b)：scf+內(nèi)皮素。

圖9：不同的采集部位，對于黑素形成細(xì)胞出現(xiàn)數(shù)量的差異確認(rèn)。(a)胸部皮膚；(b)包皮皮膚。

具體實(shí)施方式

通過長期而深入的研究，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種細(xì)胞培養(yǎng)的新式方法。通過該方法，能夠在無血清、無滋養(yǎng)層的環(huán)境中培養(yǎng)出皮膚表皮細(xì)胞，并使其形成人工表皮片。同時，所述人工表皮片中還包含與表皮細(xì)胞共同增殖的黑素形成細(xì)胞。通過本發(fā)明安全且低成本的方法獲得的人工表皮片能夠用于多種應(yīng)用，例如，針對以皮膚黑素細(xì)胞缺失為特征的疾病(如白癜風(fēng))的治療、針對皮膚疾病相關(guān)的藥物或化妝品進(jìn)行的研發(fā)篩選等等。本發(fā)明就是在此發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上完成的。

具體而言，本發(fā)明的方法涉及從收集的皮膚樣品中分離(例如通過蛋白分解酶處理)包含表皮細(xì)胞和黑素形成細(xì)胞的細(xì)胞群，培養(yǎng)所述細(xì)胞群使其增殖和/或傳代以獲得所需的細(xì)胞數(shù)量，使得所述培養(yǎng)細(xì)胞分化形成含有表皮細(xì)胞和黑素形成細(xì)胞的人工表皮片或使得分化細(xì)胞與適當(dāng)載體材料結(jié)合以形成適于移植的皮片材料。

本發(fā)明的方法與現(xiàn)有技術(shù)中常用方法的不同之處主要在于：在本發(fā)明的方法中，既不使用含有危險因子的培養(yǎng)液，例如，含有動物源性(例如，人源性)血清、腦衍生物質(zhì)、動物源性(例如，?；蜇i源性)的蛋白質(zhì)，或者動植物源性的過敏原物質(zhì)的培養(yǎng)液，又不使用營養(yǎng)支持細(xì)胞(例如，小鼠源性的支架細(xì)胞、飼養(yǎng)層細(xì)胞等)。所述方法安全性高，并且，所制得的人工表皮片還包含黑素形成細(xì)胞，這對于需要皮膚移植和/或皮膚修補(bǔ)的疾病如(白癜風(fēng))和/或癥狀(如美容相關(guān)癥狀)而言是極為有利的。

術(shù)語說明

本文中所用的術(shù)語“白癜風(fēng)”指一種常見的色素性皮膚病，以皮膚、粘膜和/或毛發(fā)的色素脫失為特征。其由于黑素細(xì)胞功能缺失所引起，表現(xiàn)為皮膚、粘膜和/或毛發(fā)上大小和形狀各異的脫色性白斑，周圍皮膚顏色正?；蛴猩卦黾?。白癜風(fēng)的皮損可出現(xiàn)在全身各部位，常見于指背、腕、前臂、顏面、頸項及生殖器周圍等。

術(shù)語“節(jié)段型白癜風(fēng)”是白癜風(fēng)的一種亞型，沿皮神經(jīng)節(jié)段分布。與其它類型的白癜風(fēng)相比，其在臨床上具有發(fā)病早、皮損不對稱、進(jìn)展迅速的特點(diǎn)。

術(shù)語“泛發(fā)型白癜風(fēng)”是白癜風(fēng)的一種亞型，其皮損為邊界清楚的白斑，呈圓形、卵圓形或不整形?？砂l(fā)生于身體任何部位，無自覺癥狀，白斑超過體表總面積的50％以上，多由久病發(fā)展而來。

本文中所用術(shù)語“黑素細(xì)胞”也即“黑色素細(xì)胞”，是主要位于皮膚和粘膜的特殊細(xì)胞，其能夠合成并分泌黑色素，并將黑色素傳遞給周圍的角質(zhì)形成細(xì)胞，以產(chǎn)生抵抗光線輻射的保護(hù)作用?！昂谒馗杉?xì)胞”主要存在于毛囊隆突(bulge)部分，其具有多種分化潛能和高度增殖能力，在合適的環(huán)境條件下能夠分化成黑素細(xì)胞。本文中，“黑素干細(xì)胞”和“黑素細(xì)胞”統(tǒng)稱為“黑素形成細(xì)胞”。

本文中所用的術(shù)語“表皮細(xì)胞”主要指動物皮膚的上皮細(xì)胞，其除了具有一般的上皮細(xì)胞的特征之外，還可產(chǎn)生角質(zhì)，具有很強(qiáng)的角質(zhì)化特點(diǎn)，起到保護(hù)皮膚的作用。

術(shù)語“角質(zhì)形成細(xì)胞”是一種能夠合成角質(zhì)蛋白的表皮細(xì)胞，其為表皮的主體，由表皮深層開始逐漸增殖、分化。本領(lǐng)域已知，角質(zhì)形成細(xì)胞最終產(chǎn)生角質(zhì)蛋白，并且，在其向角質(zhì)細(xì)胞演變的過程中，一般可大致分為四層，即基底層、棘層、顆粒層以及角質(zhì)層，這一形成兩個或更多層的過程在本文中稱作“多層化”。在角質(zhì)化的角質(zhì)細(xì)胞中，細(xì)胞核與細(xì)胞器完全消失，細(xì)胞亦失去生理功能。

本文中所用的術(shù)語“皮片”指一種用于修復(fù)體表組織的淺層缺損的片狀材料，其通常不含皮下脂肪組織。一般而言，皮片可經(jīng)移植或以敷料形式施加于需要修復(fù)、填補(bǔ)的皮膚、粘膜處。

本文中所用的術(shù)語“營養(yǎng)支持細(xì)胞”或“飼養(yǎng)層細(xì)胞”(feedercells)指本領(lǐng)域已知的、已在體外培養(yǎng)的細(xì)胞，其常用于輔助或促進(jìn)目標(biāo)細(xì)胞的生長與增殖。常用的營養(yǎng)支持細(xì)胞的示例有：小鼠源性的胎兒纖維芽細(xì)胞、3t3細(xì)胞、皮膚纖維芽細(xì)胞、cho細(xì)胞、cos-7細(xì)胞、vero細(xì)胞、mdbk細(xì)胞、sto細(xì)胞、brl細(xì)胞，sl-10細(xì)胞等。

如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”、和“由……構(gòu)成”；“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”和“由……構(gòu)成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

人工表皮片

本發(fā)明提供一種人工表皮片，其包含：活的黑素形成細(xì)胞和表皮細(xì)胞。其中，所述人工表皮片不包含動物源性的血清和蛋白質(zhì)以及營養(yǎng)支持細(xì)胞。

在本發(fā)明的人工表皮片中，不包含腦衍生物質(zhì)和動植物源性的過敏原物質(zhì)。

在本發(fā)明的一個實(shí)例中，所述人工表皮片還包含用于支持所述黑素形成細(xì)胞和表皮細(xì)胞的支持材料。在一個具體實(shí)例中，所述支持材料是纖維蛋白凝膠。

人工表皮片的制造方法

本發(fā)明提供一種制造人工表皮片的方法。

在本發(fā)明的上述制造人工表皮片的方法中，包括皮膚組織預(yù)處理：用酶溶液處理以分解皮膚組織，以獲得包含活細(xì)胞的制備物。

在本發(fā)明的方法中，所述皮膚組織預(yù)處理包括酶溶液浸漬步驟。

在本發(fā)明的方法中，酶溶液浸漬涉及：將通過組織采集獲得的組織浸入含有蛋白水解酶的酶溶液。

在本發(fā)明的一個示例性方法中，酶溶液處理在0℃～37℃的環(huán)境溫度下進(jìn)行。在一個實(shí)例中，酶溶液處理在4℃～37℃的環(huán)境溫度下進(jìn)行。

在本發(fā)明的方法中，酶溶液處理不采用動物源性的蛋白水解酶。

在本發(fā)明的一個示例性方法中，酶溶液浸漬處理采用遺傳重組的蛋白水解酶。在一個實(shí)例中，可用的蛋白水解酶包括但不限于：胰蛋白酶、tryple酶、中性蛋白酶(例如，分散酶)、膠原酶、釋放酶、酶、明膠酶b、金屬彈性蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶等，或其任意組合。

在本發(fā)明的一個示例性方法中，酶溶液浸漬處理也可采用市售的酶溶液。所述市售的酶溶液例如但不限于：trypzean(sigma公司)、trypleselect(gibco公司)、trypleexpress(gibco公司)、dispase分散酶(三光純藥株式會社)、膠原酶i、ii、iii、iv、v或vi型(和光純藥株式會社)等，或其任意組合。

在本發(fā)明的一個示例性方法中，可采用兩種或更多種酶溶液，依次或同時浸漬皮膚組織。在一個實(shí)例中，分散酶溶液在tryple溶液之前使用。在又一個實(shí)例中，采用tryple溶液的酶溶液浸漬不采用分散酶溶液。在另一個實(shí)例中，先采用分散酶和tryple依次或同時處理組織，最后添加膠原酶進(jìn)行消化處理。

在本發(fā)明的一個示例性方法中，酶溶液中的蛋白水解酶濃度隨所采用的酶的種類不同而變化。一般而言，所采用的蛋白水解酶在緩沖溶液(如pbs)中的濃度是0.001％～0.7％w/v)。在一個實(shí)例中，所述蛋白水解酶的濃度可以是：0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.3％、0.5％、0.7％，或以上述任意兩個數(shù)值為端點(diǎn)形成的范圍。在一個具體實(shí)例中，若酶溶液中采用tryple，則tryple可根據(jù)需要在原有的母液濃度基礎(chǔ)上稀釋一定倍數(shù)(例如1～10倍)后使用。

在本發(fā)明的一個示例性方法中，為了避免細(xì)胞死亡，可任選地在酶溶液中添加防止細(xì)胞死亡的試劑，例如rock抑制劑。在一個實(shí)例中，這類抑制劑包括但不限于：y-27632、thiazovivin、fasudil、gsk429286a、rki-1447等。在一個優(yōu)選實(shí)例中，添加1μm～20μm濃度范圍的y-27632或asudil。

在本發(fā)明的一個示例性方法中，酶溶液處理持續(xù)0.1小時～24小時的時間長度。在一個實(shí)例中，酶溶液處理持續(xù)1小時～16小時的時間長度。

在本發(fā)明的一個示例性方法中，酶溶液處理步驟還包括：對經(jīng)過酶溶液處理的物料進(jìn)行過濾，以去除未消化的大塊組織殘渣。在一個實(shí)例中，過濾采用未消化的大塊組織殘渣無法通過的尺寸的過濾網(wǎng)進(jìn)行。在另一個實(shí)例中，過濾采用40～100μm的濾網(wǎng)進(jìn)行。

在本發(fā)明的一個示例性方法中，酶溶液處理步驟還包括：從所得濾液分離并回收細(xì)胞與組織小碎片。在一個實(shí)例中，所述分離通過離心方式進(jìn)行。

必要時，回收未被消化的殘渣并以殘渣用酶溶液對其重復(fù)浸漬處理。所述殘渣用酶溶液包含的蛋白水解酶與先前在酶溶液處理步驟中所用的酶溶液中的蛋白水解酶相同或不同。然后，可將所得細(xì)胞和/或組織小碎片與之前所得細(xì)胞和/或組織小碎片合并，用于后續(xù)處理。

在本發(fā)明的方法中，所述皮膚組織預(yù)處理還任選地包括組織采集步驟。所述組織采集步驟在酶溶液處理步驟之前進(jìn)行。

在本發(fā)明的方法中，組織采集涉及：從皮膚采集含有細(xì)胞的組織。

在本發(fā)明的一個示例性方法中，所述組織采集是自體組織采集。

對于組織采集的區(qū)域沒有特殊限制，其可以選自對象全身皮膚的任何部位。

在本發(fā)明的一個示例性方法中，選擇對象頸部以上區(qū)域，例如面部、頭頸部的皮膚組織。因?yàn)閾?jù)文獻(xiàn)報道，頸部以上的皮膚組織中的干細(xì)胞的含量較高，而干細(xì)胞具有分化成各種皮膚所需細(xì)胞的潛能。例如，可選擇頭部毛發(fā)部位的皮膚作為組織采集區(qū)域，因?yàn)樵搮^(qū)域中含有毛囊干細(xì)胞。

在本發(fā)明的一個示例性方法中，選擇對象腹股溝的皮膚作為組織采集區(qū)域，因?yàn)樵搮^(qū)域中含有大量黑素形成細(xì)胞，這同樣有利于形成本發(fā)明的人工表皮片。

在本發(fā)明的一個示例性方法中，采集的組織是皮膚組織全層。在一個實(shí)例中，采集的組織至少包括皮膚的表皮層和真皮層。

對于組織采集的對象的年齡沒有特殊限制，優(yōu)選采集的組織來源于對象自體。

在本發(fā)明的方法中，所述皮膚組織預(yù)處理還任選地包括抑制劑溶液處理步驟。

在本發(fā)明的方法中，抑制劑溶液處理涉及：將經(jīng)過酶溶液處理的混合物與含有蛋白水解酶抑制劑的抑制劑溶液接觸。其主要目的是：抑制先前酶溶液處理步驟所用的蛋白水解酶溶液中存在的易引起細(xì)胞死亡和/或引起對后續(xù)培養(yǎng)和/或分化產(chǎn)生不利影響的蛋白酶(主要為胰蛋白酶)活性。

在本發(fā)明的一個示例性方法中，所述蛋白水解酶抑制劑可以是，例如，胰蛋白酶抑制劑(大豆源性、利馬豆源性等)、抑酶肽(aprotinin)等。在一個實(shí)例中，還可采用市售的蛋白水解酶抑制劑，例如但不限于，trypsininhibitor(大豆)(wako公司)、trypsininhibitor(利馬豆)(sigma公司)、重組aprotinin(煙草)(sigma公司)等。

在本發(fā)明的方法中，蛋白水解酶抑制劑的用量需要考慮以下方面。一方面，本發(fā)明的抑制劑溶液處理步驟和細(xì)胞培養(yǎng)步驟中均不采用血清，從而對于具有胰蛋白酶活性的蛋白水解酶，需盡快使其完全失活。因此，含有大量蛋白水解酶抑制劑的抑制溶液是必要的。另一方面，如果蛋白水解酶抑制劑的用量過多，則會對后續(xù)的細(xì)胞增殖產(chǎn)生不利影響(例如，阻礙后續(xù)的細(xì)胞增殖)。

在本發(fā)明的一個示例性方法中，為了同時滿足上述兩方面的要求(即，使胰蛋白酶活性完全失活，同時不造成對于后續(xù)細(xì)胞增殖的抑制)，抑制劑溶液用量只需達(dá)到本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)和常識中所揭示的完全抑制胰蛋白酶活性的用量即可。例如，抑制劑溶液處理步驟中所用的蛋白水解酶抑制劑的用量是酶溶液處理步驟中所用胰蛋白酶的2倍～10倍(體積比)。在一個實(shí)例中，抑制劑溶液處理步驟中所用的蛋白水解酶抑制劑的用量是酶溶液處理步驟中所用胰蛋白酶的2倍～5倍。在一個實(shí)例中，抑制劑溶液處理步驟中所用的蛋白水解酶抑制劑的用量是酶溶液處理步驟中所用胰蛋白酶的2倍～3倍。

在本發(fā)明的一個示例性方法中，抑制劑溶液處理步驟在0℃～37℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。在一個實(shí)例中，抑制劑溶液處理步驟在4℃～25℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。

在本發(fā)明的一個示例性方法中，抑制劑溶液處理持續(xù)10分鐘～6小時的時間長度。在一個實(shí)例中，抑制劑溶液處理持續(xù)10分鐘～2小時的時間長度。

在本發(fā)明的一個示例性方法中，抑制劑溶液處理還包括：從經(jīng)過抑制劑溶液浸漬處理的物料去除抑制劑。在一個實(shí)例中，所述抑制劑通過離心去除。

在本發(fā)明的一個示例性方法中，在所述抑制劑溶液處理之后，可將未消化的組織殘渣經(jīng)回收并以殘渣用酶溶液處理，所述殘渣用酶溶液包含的蛋白水解酶與酶溶液處理步驟的酶溶液中所用的蛋白水解酶不同，然后將通過殘渣酶溶液處理所得的細(xì)胞和通過抑制劑溶液處理得到的細(xì)胞共同用于細(xì)胞培養(yǎng)步驟。

在本發(fā)明的上述制造人工表皮片的方法中，包括細(xì)胞增殖與分化：使所得制備物中的細(xì)胞增殖，并分化為黑素形成細(xì)胞和表皮細(xì)胞，進(jìn)一步使所述細(xì)胞多層化以形成含有黑素形成細(xì)胞的人工表皮片。

在本發(fā)明的方法中，細(xì)胞增殖與分化過程中不使用含有危險因子的培養(yǎng)液。所述危險因子包括非臨床級異體或異種源性的、可能會對后續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)造成污染或影響，或者可能會在后續(xù)的移植過程中引起不希望的免疫反應(yīng)(例如過敏、排斥等)的組分，但應(yīng)注意，此處不包括無熱源的重組蛋白。示例性的危險因子包括：動物源性血清、腦衍生物質(zhì)、動物源性的蛋白質(zhì)，或者動植物源性的過敏原物質(zhì)。

具體而言，所述動物源性的血清通常包括(但不限于)：人血清、猴血清、猿血清、胎牛血清、牛血清、豬血清、馬血清、驢血清、雞血清、鵪鶉血清、綿羊血清、山羊血清、狗血清、貓血清、兔血清、小鼠血清、豚鼠血清以及老鼠血清等。

所述腦衍生物質(zhì)通常包括(但不限于)：腦下垂體提取物、腦提取物、以及腦源性提取脂質(zhì)等。

所述動物源性蛋白質(zhì)(例如?；蜇i)指來源于動物(例如?；蜇i)的任何蛋白質(zhì)，其特定示例包括但不限于動物(例如?；蜇i)來源的：白蛋白、鐵傳遞蛋白、膠原蛋白、明膠、酶等。

所述動植物源性的過敏原物質(zhì)通常包括(但不限于)：花生、面粉、貝殼類、小麥、牛乳和雞蛋等衍生的物質(zhì)，以及任何其它能夠引起過敏反應(yīng)的物質(zhì)。應(yīng)注意，此處不包括無熱源的重組蛋白。

在本發(fā)明的方法中，細(xì)胞培養(yǎng)步驟不使用營養(yǎng)支持細(xì)胞。

組織工程領(lǐng)域常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)中，多數(shù)會采用營養(yǎng)支持細(xì)胞(例如，飼養(yǎng)層細(xì)胞)來支持目標(biāo)細(xì)胞的生長與增殖。本領(lǐng)域中常用的營養(yǎng)支持細(xì)胞類型包括但不限于：小鼠源性的胎兒纖維芽細(xì)胞、3t3細(xì)胞、皮膚纖維芽細(xì)胞、cho細(xì)胞、cos-7細(xì)胞、vero細(xì)胞、mdbk細(xì)胞、sto細(xì)胞、brl細(xì)胞、sl-10細(xì)胞，以及其它一般培養(yǎng)株細(xì)胞。但是，在本發(fā)明方法中，不使用任何類似的外來營養(yǎng)支持細(xì)胞。因此，最終獲得的細(xì)胞中沒有混入營養(yǎng)支持細(xì)胞，可以保證其安全性。同時，優(yōu)選培養(yǎng)所采用的是自體細(xì)胞，以保證培養(yǎng)的細(xì)胞具有高移植率。

在本發(fā)明的方法中，可在本發(fā)明的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中分別加入合適的組分以分別形成本發(fā)明的增殖培養(yǎng)液、傳代培養(yǎng)液和/或分化培養(yǎng)液。根據(jù)本發(fā)明的不同培養(yǎng)階段需求，可采用不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，并在此基礎(chǔ)上添加適當(dāng)組分。對于基礎(chǔ)培養(yǎng)液沒有特別的限制，只需要選用的培養(yǎng)液含有細(xì)胞生存所必要的維生素、礦物質(zhì)、氨基酸，且不含有任何危險因子即可。

在一個實(shí)例中，可選用的基礎(chǔ)培養(yǎng)液例如但不限于：mcdb151培養(yǎng)液(sigma公司)、mcdb153培養(yǎng)液(sigma公司)、mcdb154培養(yǎng)液(sigma公司)、角質(zhì)形成細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液(keratinocytebasalmedium，stemline公司)、限定成分的角化細(xì)胞無血清培養(yǎng)液(definedkeratinocyte-sfm，invitrogen公司)、dmem/f-12培養(yǎng)液(invitrogen公司)或它們的適當(dāng)組合等。

在本發(fā)明的方法中，細(xì)胞增殖所用的增殖培養(yǎng)液通過向所選的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加適合和/或促進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)和增殖的添加劑來配制。適合細(xì)胞培養(yǎng)的添加劑包括，例如，細(xì)胞增殖促進(jìn)劑、防止或減少細(xì)胞死亡的保護(hù)劑(例如脂質(zhì)添加劑、自由基清除劑)，及其任意組合。

在一個實(shí)例中，增殖培養(yǎng)液中具有細(xì)胞增殖促進(jìn)劑。在一個具體實(shí)例中，所述細(xì)胞增殖促進(jìn)劑包括但不限于如下物質(zhì)中的一種或多種：kgf(角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子，例如fgf7)、胰島素、人全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鹽、乙醇胺、脂質(zhì)、維生素c，以及維生素c誘導(dǎo)物。上述物質(zhì)中，kgf的添加濃度優(yōu)選在0.1～100ng/l范圍內(nèi)，而除了kgf以外的其它添加劑的添加濃度優(yōu)選在1～2000nm/l范圍內(nèi)。

在一個實(shí)例中，增殖培養(yǎng)液中具有脂質(zhì)添加劑。在一個具體實(shí)例中，所述脂質(zhì)添加劑包括但不限于如下物質(zhì)中的一種或多種：花生四烯酸、膽固醇、dl-α-醋酸生育酚、亞油酸、亞麻酸、豆蔻酸、油酸、棕櫚油酸、維生素a棕櫚酸酯、硬脂酸、吐溫-80、pluronicf68(可購自sigma公司、invitrogen公司等)，及其本領(lǐng)域常用的其它脂質(zhì)添加劑。所述脂質(zhì)添加劑的濃度優(yōu)選在1/10000～1/1000(體積比，基于培養(yǎng)液終體積)。

在一個實(shí)例中，增殖培養(yǎng)液中具有自由基清除劑。在一個具體實(shí)例中，所述自由基清除劑包括但不限于如下物質(zhì)中的一種或多種：還原型谷胱甘肽、維生素e，維生素e誘導(dǎo)物、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶(sod)等。其中，所述自由基清除劑的添加濃度優(yōu)選在1～1000nm/l范圍內(nèi)。

在本發(fā)明的一個具體實(shí)例中，增殖培養(yǎng)所用的增殖培養(yǎng)液在基礎(chǔ)培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上另添加，例如，胰島素、人全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白、cd脂質(zhì)濃縮物、維生素、角質(zhì)細(xì)胞生長因子、表皮細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、rock抑制劑、促腎上腺皮質(zhì)激素、抗生素等。

在一個實(shí)例中，還可向增殖培養(yǎng)液中添加如下物質(zhì)中的一種或多種：表皮生長因子(egf)、成纖維細(xì)胞生長因子(fgf2)、肝細(xì)胞生長因子(hgf)、胰島素樣生長因子-1(igf-1)、干細(xì)胞因子(scf)、wnt-1、wnt-3a、促腎上腺皮質(zhì)激素(acth)、內(nèi)皮素-1(et-1)、活性型維生素d3、前列腺素e2(pge2)、作為細(xì)胞死亡保護(hù)劑的rho相關(guān)激酶(rock)抑制劑的法舒地(fasudi)、y-27632等。上述添加劑按照常規(guī)的添加量范圍使用即可，優(yōu)選是1nm/l～0.1mm/l。

在本發(fā)明的一個示例性方法中，細(xì)胞開始培養(yǎng)時，將細(xì)胞以適當(dāng)?shù)拿芏龋?×10^2-6個細(xì)胞/cm²或1×10^2-6個細(xì)胞/ml的密度，接種于細(xì)胞培養(yǎng)容器內(nèi)的增殖培養(yǎng)液中，然后將其置于37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱或自動培養(yǎng)裝置內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

在本發(fā)明的一個示例性方法中，所述細(xì)胞培養(yǎng)容器包括但不限于，培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、微板等。在一個實(shí)例中，為了提高細(xì)胞與培養(yǎng)容器之間的附著性，可采用膠原、凝膠、l型多聚賴氨酸、d型多聚賴氨酸、層粘連蛋白、纖維連接蛋白、多聚-l-鳥氨酸、纖維蛋白、透明質(zhì)酸等的中的一種或多種細(xì)胞支持用基材對培養(yǎng)容器進(jìn)行涂覆預(yù)處理。在另一個實(shí)例中，采用適合無血清培養(yǎng)液用的專用培養(yǎng)容器。

在本發(fā)明的一個示例性方法中，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)采用馴化培養(yǎng)方式。應(yīng)理解，常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)一般每隔幾日就需要更換全部的培養(yǎng)液，而所謂的“馴化培養(yǎng)”則是在更換培養(yǎng)液的時候要部分或全部保留原培養(yǎng)液中能使細(xì)胞自我生長的成分。具體而言，馴化培養(yǎng)表示在更換培養(yǎng)液時，不是把舊的培養(yǎng)液全部除去并更換成新的培養(yǎng)液，而是保留部分或全部舊培養(yǎng)液，且在此基礎(chǔ)上添加新的培養(yǎng)液。若在此過程中有部分舊培養(yǎng)液被棄去，則對該部分待棄去的舊培養(yǎng)液的進(jìn)行提取。例如，將待棄去的舊培養(yǎng)液放入離心管離心，除去上清液，向離心管中沉淀團(tuán)塊(包括殘留細(xì)胞)添加新培養(yǎng)液，使其重懸，然后再將其添加回原來的培養(yǎng)容器中。在一個實(shí)例中，更換培養(yǎng)液時保留培養(yǎng)物質(zhì)體積5～50％的舊培養(yǎng)液。在另一個實(shí)例中，保留培養(yǎng)物質(zhì)體積10～30％的舊培養(yǎng)液。

在本發(fā)明的一個示例性方法中，本發(fā)明的細(xì)胞增殖包括初代增殖培養(yǎng)。在一個實(shí)例中，所述初代增殖培養(yǎng)采用增殖培養(yǎng)液進(jìn)行。

在本發(fā)明的一個具體實(shí)例中，初代增殖培養(yǎng)所用的增殖培養(yǎng)液在基礎(chǔ)培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上另添加，例如，胰島素、人全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白、cd脂質(zhì)濃縮物、維生素、角質(zhì)細(xì)胞生長因子、表皮細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、rock抑制劑、促腎上腺皮質(zhì)激素、抗生素等。

在一個實(shí)例中，從細(xì)胞培養(yǎng)開始，持續(xù)約3～10天的時間進(jìn)行第一次培養(yǎng)液更換。在另一個實(shí)例中，從細(xì)胞培養(yǎng)開始，持續(xù)約3～8天的時間進(jìn)行第一次培養(yǎng)液更換。在另一個實(shí)例中，從細(xì)胞培養(yǎng)開始，持續(xù)約3～6天的時間進(jìn)行第一次培養(yǎng)液更換。在一個具體實(shí)例中，所述第一次培養(yǎng)液更換不去除舊培養(yǎng)液，而是僅添加新鮮培養(yǎng)液。

在一個實(shí)例中，本發(fā)明的初代增殖培養(yǎng)持續(xù)10～16天。在另一個實(shí)例中，本發(fā)明的初代增殖培養(yǎng)持續(xù)10～14天。在另一個實(shí)例中，本發(fā)明的初代增殖培養(yǎng)持續(xù)10～12天。

在本發(fā)明的一個示例性方法中，本發(fā)明的細(xì)胞增殖還包括細(xì)胞傳代，所述細(xì)胞傳代可在初代增殖培養(yǎng)的細(xì)胞達(dá)到融合時進(jìn)行。在一個具體實(shí)例中，對增殖培養(yǎng)的細(xì)胞傳代少于5代。在一個具體實(shí)例中，對增殖培養(yǎng)的細(xì)胞傳代少于4代。在一個具體實(shí)例中，對增殖培養(yǎng)的細(xì)胞傳代少于3代。在一個具體示例中，對增殖培養(yǎng)的細(xì)胞傳代少于2代。在一個具體示例中，對增殖培養(yǎng)的細(xì)胞傳代不超過1代。

在本發(fā)明的一個示例性方法中，本發(fā)明的細(xì)胞增殖還包括傳代后增殖培養(yǎng)。在一個實(shí)例中，傳代后增殖培養(yǎng)采用傳代培養(yǎng)液。在一個具體實(shí)例中，所述傳代培養(yǎng)液在前述增殖培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上另添加干細(xì)胞培養(yǎng)因子scf和wnt-3a。

在一個實(shí)例中，所述傳代后增殖培養(yǎng)持續(xù)3～10天。在另一個實(shí)例中，所述傳代后增殖培養(yǎng)持續(xù)5～7天。

在本發(fā)明的一個示例性方法中，本發(fā)明的細(xì)胞分化采用分化培養(yǎng)液進(jìn)行。在一個實(shí)例中，分化培養(yǎng)液在基礎(chǔ)培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上配置。

在一個實(shí)例中，所述分化培養(yǎng)液中包含胰島素。在一個實(shí)例中，分化培養(yǎng)液中的胰島素含量為1～10mg/l。在另一個實(shí)例中，分化培養(yǎng)液中的胰島素含量為3～8mg/l。在另一個實(shí)例中，分化培養(yǎng)液中的胰島素含量為5～7mg/l。

在一個實(shí)例中，所述分化培養(yǎng)液中包含促腎上腺皮質(zhì)激素(acth)。在一個實(shí)例中，分化培養(yǎng)液中acth含量為0.5～3μm。在另一個實(shí)例中，分化培養(yǎng)液中acth含量為0.8～2μm。在另一個實(shí)例中，分化培養(yǎng)液中的acth含量為1～1.5μm。

在一個實(shí)例中，所述分化培養(yǎng)液中包含全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白。在一個實(shí)例中，分化培養(yǎng)液中的全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白含量為1～10mg/l。在另一個實(shí)例中，分化培養(yǎng)液中的全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白含量為3～8mg/l。在另一個實(shí)例中，分化培養(yǎng)液中全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白含量為5～7mg/l。

在一個實(shí)例中，所述分化培養(yǎng)液中包含維生素d3。在一個實(shí)例中，分化培養(yǎng)液中的維生素d3含量為5×10^-12m～5×10^-11m。在另一個實(shí)例中，分化培養(yǎng)液中的維生素d3含量為7×10^-12m～3×10^-11m。分化培養(yǎng)液中的維生素d3含量為9×10^-12m～2×10^-11m。在一個實(shí)例中，所用的維生素d3是1α,25-二羥基維生素d3。

在一個實(shí)例中，細(xì)胞分化過程中所用的培養(yǎng)液中不含角質(zhì)細(xì)胞生長因子(kgf)和表皮細(xì)胞生長因子(egf)。

在本發(fā)明的一個示例性方法中，所述分化培養(yǎng)液中的鈣含量高于所述增殖培養(yǎng)液中的鈣含量。在一個具體實(shí)例中，增殖培養(yǎng)液中的鈣含量為0.05～0.15mm。在另一個具體實(shí)例中，增殖培養(yǎng)液中的鈣含量為0.08～0.12mm。在另一個具體實(shí)例中，增殖培養(yǎng)液中的鈣含量為0.09～0.1mm。在一個具體實(shí)例中，分化培養(yǎng)液中的鈣含量為1～2mm。在另一個具體實(shí)例中，分化培養(yǎng)液中的鈣含量為1.5～1.8mm。

在一個實(shí)例中，所述細(xì)胞分化采用多階分化方式進(jìn)行。具體地，所述“多階分化方式”指，在分化過程中，逐步將分化培養(yǎng)液相對于增殖培養(yǎng)液的占比提高，以實(shí)現(xiàn)所需的細(xì)胞分化。

在一個實(shí)例中，細(xì)胞分化過程中添加的分化培養(yǎng)液與增殖培養(yǎng)液的體積比從1:2逐步過渡至全部為分化培養(yǎng)液。在另一個實(shí)例中，細(xì)胞分化過程中添加的分化培養(yǎng)液與增殖培養(yǎng)液的體積比從1:1.5逐步過渡至全部為分化培養(yǎng)液。在另一個實(shí)例中，細(xì)胞分化過程中添加的分化培養(yǎng)液與增殖培養(yǎng)液的體積比從1:1逐步過渡至全部為分化培養(yǎng)液。

在一個實(shí)例中，分化培養(yǎng)液相對于增殖培養(yǎng)液的體積比分四個階段逐步提高。在一個具體實(shí)例中，分化培養(yǎng)液與增殖培養(yǎng)液的體積比以：0.8:1～1.2:1、1.5:1～2.5:1、2.8:1～4:1、全部為分化培養(yǎng)液，分四個階段逐步提高。在另一個具體實(shí)例中，分化培養(yǎng)液與增殖培養(yǎng)液的體積比以：1:1、2:1、3:1、全部為分化培養(yǎng)液，分四個階段逐步提高。在本發(fā)明的一個示例性方法中，上述各階段持續(xù)2～4天。

在本發(fā)明的方法中，細(xì)胞增殖與分化還包括使所述細(xì)胞多層化以形成含有黑素形成細(xì)胞的人工表皮片。在一個實(shí)例中，細(xì)胞群可形成片狀結(jié)構(gòu)，優(yōu)選多層片狀結(jié)構(gòu)，其中包含表皮細(xì)胞和黑素形成細(xì)胞。收集該片狀物，即為本發(fā)明的人工表皮片?？蛇x地，將所述人工表皮片轉(zhuǎn)移到醫(yī)用載體上，以備應(yīng)用。

在本發(fā)明的上述制備人工表皮片的方法中，出于進(jìn)一步提高移植率的考慮，還可包括調(diào)配步驟。所述調(diào)配步驟中，可使細(xì)胞培養(yǎng)步驟中獲得細(xì)胞或人工表皮片碎片包埋進(jìn)入適當(dāng)載體(例如纖維蛋白)中，獲得含有分化細(xì)胞的人工表皮片(例如纖維蛋白凝膠皮片)。

在本發(fā)明的一個示例性實(shí)例中，將通過本發(fā)明方法培養(yǎng)獲得的人工表皮片，再次通過酶處理進(jìn)行剝離，并將其包埋到纖維蛋白中，制成纖維細(xì)胞皮片。

在本發(fā)明的一個示例性實(shí)例中，將通過本發(fā)明方法培養(yǎng)獲得的人工表皮片，通過酶處理進(jìn)行剝離，并將其轉(zhuǎn)移到適當(dāng)支持物上以在保存和/或運(yùn)輸中支持所述皮片。

人工表皮片的應(yīng)用

本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明方法制備獲得人工表皮片的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一個示例性實(shí)例中，涉及由本發(fā)明方法制備獲得的人工表皮片在制備用于治療以皮膚黑素細(xì)胞缺失為特征的疾病的施用套件的應(yīng)用。在一個實(shí)例中，所述以皮膚黑素細(xì)胞缺失為特征的疾病是白癜風(fēng)。在一個具體實(shí)例中，所述白癜風(fēng)是節(jié)段型白癜風(fēng)。在另一個具體實(shí)例中，所述白癜風(fēng)是全身型白癜風(fēng)。

在一個實(shí)例中，所述施用套件通過如下方式施用：先對患者的患部表皮進(jìn)行打磨，然后將此人工表皮片移植到該患部。

在本發(fā)明的另一個示例性實(shí)例中，涉及由本發(fā)明方法制備獲得的人工表皮片在針對皮膚疾病相關(guān)的藥物或化妝品所進(jìn)行的研發(fā)篩選中的應(yīng)用。

在一個實(shí)例中，將用于皮膚疾病相關(guān)的藥物或化妝品的測試化合物或組合物施加至由本發(fā)明方法制備獲得的人工表皮片，并通過判斷該化合物或組合物能否促使皮片中的表皮細(xì)胞或黑素形成細(xì)胞的增殖(或減少)，來對所述測試化合物或組合物進(jìn)行研發(fā)篩選。

本文中提供的所有數(shù)值范圍旨在清楚地包括落在范圍端點(diǎn)之間的所有數(shù)值及它們之間的數(shù)值范圍。可對本發(fā)明提到的特征或?qū)嵤├岬降奶卣鬟M(jìn)行組合。本說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。

實(shí)施例

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可對本發(fā)明做出適當(dāng)?shù)男薷?、變動，這些修改和變動都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。

實(shí)施例1.組織采集

以下操作均在完全無菌的狀態(tài)下進(jìn)行。

組織來源為一名62歲女性。獲取其美容整形手術(shù)時從臉部切除的廢棄皮膚組織中面積約2.0cm²的全層，將其浸漬在碘消毒劑中消毒30秒，然后用pbs(上海源培生物科技股份有限公司)溶液清洗3次。洗干凈后放置于采用孔徑<1μm的濾網(wǎng)濾過的70％酒精溶液中，持續(xù)30秒，再次滅菌。然后使用pbs溶液(ph7.4)另清洗3次。洗干凈后的組織用滅菌手術(shù)剪和鑷子切割，只保留含有毛囊的區(qū)塊，進(jìn)一步除去皮下及真皮結(jié)締組織，再用手術(shù)剪剪碎成約1mm²大小的碎片。

實(shí)施例2.酶溶液浸漬處理

(i)酶溶液浸漬工程1

制備包含10μm的rock抑制劑(y-27632，和光純藥工業(yè)株式會社)和22u/ml的分散酶(diapase，gibco)的pbs溶液，制得工程1酶溶液。將如上所述采集并經(jīng)預(yù)處理的組織浸入預(yù)先冷卻到4℃的5ml如上制備的工程1酶溶液中，在4℃靜置過夜，進(jìn)行采集組織的酶處理。

(ii)酶溶液浸漬工程2

將trypleexpress酶溶液(1×)(購自thermofisherscientific公司)用pbs5倍稀釋，并以10μm的濃度添加y-27632，制得工程2酶溶液。將工程1得到的酶處理摻混物離心，棄去上清液，隨后立即添加5ml工程2酶溶液使組織沉淀重懸，37℃放置20分鐘。

(iii)酶溶液浸漬工程3

在dmem培養(yǎng)液中制備i型膠原酶(collagensetypei，gibco)溶液(1400u/ml)，并添加抗菌劑1μg/ml的紅霉素erythromycinabbot公司)和10u/ml的gentasin(辰欣藥業(yè))，制得工程3抗菌劑-酶溶液。將上述酶溶液浸漬工程2得到的酶處理摻混物離心，棄去上清液，隨后立即添加20ml的工程3抗菌劑-酶溶液(37℃溫?zé)?，并用磁力攪拌器(500rpm)37℃攪拌1.5小時，獲得均勻摻混物。

實(shí)施例3.抑制劑溶液浸漬處理

抑制劑溶液：在pbs中以2mg/ml調(diào)配胰蛋白酶抑制劑(trypsininhibitor(大豆)，sigma)溶液。

采用100μm的尼龍濾網(wǎng)過濾經(jīng)過酶溶液浸漬處理所得的均勻摻混物，保留濾液，清除未消化殘渣。用40mlpbs漂洗先前所用的酶處理容器，并進(jìn)一步漂洗過濾網(wǎng)，將所得漂洗液和上述濾液合并，離心，取得細(xì)胞沉淀。

用40ml的pbs對所得細(xì)胞沉淀進(jìn)一步漂洗，隨后離心。然后將得到的細(xì)胞沉淀浸入5ml預(yù)先配制的抑制劑溶液中，重懸，并常溫放置10分鐘。

實(shí)施例4.細(xì)胞培養(yǎng)

(i)初代增殖培養(yǎng)

以下是增殖培養(yǎng)液的具體配方：將基本培養(yǎng)用的mcdb153顆粒狀培養(yǎng)液(sigma公司)置入1l注射用蒸餾水中溶解，添加1.8g的碳酸氫鈉后進(jìn)行過濾滅菌。然后，添加33.3ml的液體培養(yǎng)液dmem(dulbecco’smodifiedeaglemedium，sigma公司)。之后，添加經(jīng)過滅菌處理的以下物質(zhì)至所示濃度：

rh-胰島素(version16公司)(5mg/l)、人全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白(holo-humantransferrin，sigma公司)(5mg/l)、cd脂質(zhì)濃縮物(gibco公司)(1ml/l)、l-抗壞血酸-2-磷酸酯(sigma公司)(50mg/l)、rhkgf/fgf7(prospec公司)(10μg/l)、rhegf(r&d系統(tǒng)公司)(20μg/l)、rhfgf2(peprotech公司)(10μg/l)、y-27632(wako公司)(5mg/l)、b-27supplementxenofreects(gibco公司)(10ml/l)、acth(1-24)(人)(wako公司)(1nm)、1α,25-二羥基維生素d3(sigma公司)(10^-11m)、紅霉素(erythromycin，wako公司)(0.5mg/l)、硫酸慶大霉素(gentamicinsulfate，10,000u/l，辰欣藥業(yè))、制霉菌素(nystatin，1μg/l，lkt-lab)。

初代培養(yǎng)時使用6孔板(costar3335：corningcellbind表面)。離心去除上述抑制劑溶液，向沉淀添加12ml培養(yǎng)液，使細(xì)胞重懸。所述培養(yǎng)液含有10μm的y-27632。然后，以2ml細(xì)胞懸液/孔將細(xì)胞接種至6孔板的孔中。接種2天后，每孔添加包含10μmy-27632的2ml培養(yǎng)液。培養(yǎng)第4天，再次向每孔添加2ml的包含10μmy-27632的培養(yǎng)液。培養(yǎng)第6天，各孔保留1ml培養(yǎng)液，將剩余舊培養(yǎng)液吸出并離心，棄去上清后，加入18ml的新鮮培養(yǎng)液使細(xì)胞重懸。將所得重懸液以3ml/孔接種。之后的3天按照與上述相同的方法換液。培養(yǎng)到第12天時出現(xiàn)融合，進(jìn)行以下的傳代培養(yǎng)工程。

(ii)細(xì)胞傳代

以終濃度10μm將y-27632添加至已達(dá)到融合的細(xì)胞的培養(yǎng)液中，37℃靜置30分鐘。然后將培養(yǎng)液去除，以2ml/孔添加2％edta/pbs溶液，37℃靜置10分鐘。然后，以0.5ml/孔添加trypleexpress酶溶液(1×)，37℃靜置5分鐘。通過正置顯微鏡確認(rèn)細(xì)胞從孔底部脫離后，使用移液器采集細(xì)胞。采集的細(xì)胞用離心管收集，用20ml的pbs清洗2次。洗凈后，將得到的細(xì)胞浸入5ml的抑制劑溶液(胰蛋白酶抑制劑(大豆):2mg/mlpbs)中，常溫放置10分鐘以上。

(iii)傳代后增殖培養(yǎng)

離心去除抑制劑溶液后，將細(xì)胞重懸于添加至40ml傳代后增殖培養(yǎng)液中。所用傳代后增殖培養(yǎng)液是在初代增殖培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上另添加以下兩組分：rhscf(gibco公司)(2.5μg/l)、rhwnt-3a(stemrd公司)(2.5μg/l)。然后以4ml/皿的體積接種到十個細(xì)胞培養(yǎng)皿(corning3295細(xì)胞培養(yǎng)皿：60mm×15mm；cellbind表面)中。37℃放置3天，保留1ml/孔培養(yǎng)液，舊培養(yǎng)液經(jīng)離心去除上清，將細(xì)胞重懸

在4ml/孔的新鮮傳代培養(yǎng)液中，對重懸液進(jìn)行再接種，再培養(yǎng)。培養(yǎng)第7天達(dá)到融合，進(jìn)行界面培養(yǎng)(具體于實(shí)施例5中描述)。保留兩個培養(yǎng)皿進(jìn)行分化培養(yǎng)。

(iv)分化培養(yǎng)工程1

分化培養(yǎng)液配方：在dmem培養(yǎng)液(sigma公司)中添加acth(wako公司)1μm、胰島素(version16公司)(5mg/l)、人全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白(sigma公司)(5mg/l)、1α,25-二羥基維生素d3(sigma公司)(10^-11m)，調(diào)制而成。

增殖培養(yǎng)液(-)：按照與上文關(guān)于初代增殖培養(yǎng)液所述相同的方式配制，不同之處在于不含kgf和egf(即不含先前所用的rhkgf/fgf7(prospec公司)(10μg/l)、rhegf(r&d系統(tǒng)公司)(20μg/l))。

去除達(dá)到融合的細(xì)胞培養(yǎng)皿中的舊培養(yǎng)液，將分化培養(yǎng)液:增殖培養(yǎng)液(-)按照1:1的體積比以總添加體積4ml/皿添加至培養(yǎng)皿中，開始分化培養(yǎng)。觀察到分化第1天細(xì)胞出現(xiàn)間隙，分化第2天增殖細(xì)胞的間隙消失。

(v)分化培養(yǎng)工程2

分化第3天，確認(rèn)皿底部細(xì)胞間隙消失。去除舊培養(yǎng)液后，將分化培養(yǎng)液:增殖培養(yǎng)液(-)按照2:1的體積比以總添加體積4ml/皿添加至培養(yǎng)皿中，進(jìn)行分化。

(vi)分化培養(yǎng)工程3

分化第5天，除去舊培養(yǎng)液。將分化培養(yǎng)液:增殖培養(yǎng)液(-)按照3:1的體積比以總添加體積4ml/皿添加至培養(yǎng)皿中，再進(jìn)行分化。

(vii)分化培養(yǎng)工程4

分化第7天，除去舊培養(yǎng)液。將分化培養(yǎng)液:增殖培養(yǎng)液(-)按照全部為分化培養(yǎng)液的體積比以總添加體積4ml/皿添加至培養(yǎng)皿中，進(jìn)行最終分化。分化第8天終止分化。

實(shí)施例5.界面培養(yǎng)工程和分化時的1α,25-二羥基維生素d3濃度的研究

傳代培養(yǎng)時，使用與先前記載的傳代培養(yǎng)工程相同的方法從融合的兩個培養(yǎng)皿中獲取細(xì)胞，接種至兩個界面培養(yǎng)濾網(wǎng)上。進(jìn)行上文記載的分化培養(yǎng)工程。其中，分化培養(yǎng)工程1是在界面下進(jìn)行培養(yǎng)；從分化培養(yǎng)工程2開始在界面進(jìn)行培養(yǎng)；分化培養(yǎng)工程4的培養(yǎng)時間有所延長(即從第7天-第8天延長為第7天-第11天)，共計進(jìn)行了11天的分化培養(yǎng)工程，進(jìn)行比較研究。

結(jié)果表明，在界面培養(yǎng)分化時，將1α,25-二羥基維生素d3濃度值設(shè)定在10^-9m也可培養(yǎng)出皮片，但在10^-11m的情況下，可以培養(yǎng)出較為理想的較厚的人工表皮片(參見圖1，圖1所示為皮片截面，左右二圖放大倍數(shù)相同)。

實(shí)施例6.人工表皮片的采取

除去最終分化完結(jié)的細(xì)胞的培養(yǎng)液，然后將剩余的細(xì)胞皮片物質(zhì)浸入分散酶(dispase)溶液(4ml/皿，gibco)中，37℃放置1小時。當(dāng)細(xì)胞皮片物質(zhì)處于可剝離狀態(tài)時，使用經(jīng)滅菌的鑷子和尼龍膜將皮狀物剝離。然后，將其轉(zhuǎn)移至醫(yī)用紗布上，即可作為移植用表皮進(jìn)行移植。

實(shí)施例7.重懸分化細(xì)胞的采集

向殘留有分化細(xì)胞的皿(2ml/皿)中添加y-27632達(dá)10μm濃度，37℃靜置30分鐘以上。去除舊培養(yǎng)液，然后添加trypleexpress酶溶液(1×)(0.5ml/孔)，37℃靜置10分鐘。然后繼續(xù)添加trypleexpress酶溶液(1×)(0.5ml/孔)，37℃靜置10分鐘。隨后，通過正置顯微鏡確認(rèn)細(xì)胞能從底部脫離后，使用移液器采集細(xì)胞。將采集到的細(xì)胞收集到離心管中，用20ml的pbs清洗2次。洗凈后，將獲得的細(xì)胞浸入5ml的抑制劑溶液中(胰蛋白酶抑制劑(大豆):2mg/mlpbs)，常溫放置10分鐘以上。

然后，可通過離心分離獲得細(xì)胞，并使獲得的細(xì)胞重懸于pbs溶液，作為分化細(xì)胞懸液備用。

實(shí)施例8.纖維蛋白凝膠預(yù)配制

采用醫(yī)用的fibringluraas-fibrinsealant(人)試劑盒(上海萊士)，配制以下兩種液體。

將纖維蛋白原和注射用水置于37℃溫?zé)?5分鐘，然后，將2ml的注射用水添加至纖維蛋白原中，使其溶解。37℃靜置20分鐘以上，直至確認(rèn)完全溶解為止，作為纖維蛋白原溶液備用。

將凝血酶原和cacl2溶液在37℃放置15分鐘，然后，將2ml的注射用水添加至凝血酶原中，并用移液器反復(fù)柔和吹打直至溶解。然后，取該液體的一部分，用pbs稀釋500倍，作為經(jīng)稀釋的凝血酶原溶液備用。

實(shí)施例9.含有細(xì)胞的纖維蛋白凝膠制備

將上文所述獲得和采集的分化細(xì)胞懸液細(xì)胞(如實(shí)施例7所述重懸于pbs的細(xì)胞懸液)接種于培養(yǎng)皿中(1×10³個細(xì)胞/cm²)，向各皿中的細(xì)胞添加1920μl的經(jīng)稀釋的凝血酶原溶液(如實(shí)施例8所述配制)，使其與皿中細(xì)胞混合。然后加入120μl纖維蛋白原制成2ml溶液(如實(shí)施例8所述配制)輕輕添加至所有皿中。將皿放置在4℃冷藏過夜。第二天，使用鑷子和尼龍膜將含有細(xì)胞的纖維蛋白凝膠從皿剝離，其隨后可用于移植。圖2的照片中顯示了置于手背上拍攝的從的培養(yǎng)皿中取出的含有細(xì)胞的纖維蛋白凝膠。

實(shí)施例10.對細(xì)胞皮片中的黑素形成細(xì)胞進(jìn)行dopa染色確認(rèn)

通過dopa染色確認(rèn)細(xì)胞皮片(如實(shí)施例6制備)中的黑素形成細(xì)胞是否存在。

首先，將3.3g的nah2po4·2h2o和28.7g的na2hpo4·12h2o添加至1l的蒸餾水中，溶解后制成dopa用緩沖液。然后，將0.1g的dopa(3,4-二羥基-l-苯丙氨酸，sigma公司)添加至100ml的dopa用緩沖液中，并使用攪拌器進(jìn)行30分鐘攪拌直至完全溶解。將剝離獲得的細(xì)胞皮片樣品浸入該dopa溶液中，37℃靜置2小時。接下來使用dopa用緩沖液清洗樣品3次，然后再次將樣品浸入dopa用緩沖液中，50℃靜置2小時。完成后，使用顯微鏡觀察確認(rèn)黑素形成細(xì)胞的情況。

實(shí)施例11.分化方法的研究1

將按上文記載的經(jīng)擴(kuò)增培養(yǎng)的細(xì)胞分為兩組：第一組為多階分化組(g)，其按照實(shí)施例4的分化培養(yǎng)工程1-4的順序培養(yǎng)；第二組為單階分化組(s)，其僅采用分化培養(yǎng)工程4中的培養(yǎng)液培養(yǎng)。然后，通過觀察dopa染色陽性細(xì)胞的出現(xiàn)數(shù)來比較判斷上述培養(yǎng)方式對于黑素形成細(xì)胞的形成是否有影響。

結(jié)果可參見圖3。圖3顯示了多階分化、vd濃度和傳代次數(shù)對于黑色素形成細(xì)胞數(shù)的影響。其中，多階分化組中的dopa陽性細(xì)胞遠(yuǎn)多于單階分化組中的dopa陽性細(xì)胞，說明按實(shí)施例4中所述的多階分化(分化培養(yǎng)工程1-4)的順序培養(yǎng)所獲得的黑素細(xì)胞數(shù)量明顯居多。并且，分化時，無論是10^-11m還是10^-9m濃度的1α,25(oh)2vd3均未對黑素細(xì)胞數(shù)量產(chǎn)生顯著影響。僅多階分化的角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)生多層化。且p1代培養(yǎng)物的黑素細(xì)胞數(shù)量大于p2代培養(yǎng)物。

此外，還確認(rèn)了在多階分化組中，傳代1代(p1)的細(xì)胞中觀察到的角化細(xì)胞多層化明顯多于傳代2代(p2)的細(xì)胞。而在單階分化組中未出現(xiàn)角化細(xì)胞多層化。

實(shí)施例12.分化方法的研究2

使用按上文記載的培養(yǎng)至完成實(shí)施例4的步驟(i)的細(xì)胞。以只采用按照上文所述培養(yǎng)傳代1代細(xì)胞作為“對照樣品”；采用培養(yǎng)中添加rhscf(gibco公司)(2.5μg/l)和rhwnt-3a(stemrd公司)(2.5μg/l)這兩種細(xì)胞因子的細(xì)胞作為“細(xì)胞因子添加樣品”；以在添加了上述兩種細(xì)胞因子之外另添加10^-11m的維生素d3(vd3)的細(xì)胞作為“細(xì)胞因子+維生素d(vd)添加樣品”。細(xì)胞融合時，使用與上文所述多階分化相同的條件進(jìn)行分化培養(yǎng)。分化培養(yǎng)后，使用dopa染色和he染色對各樣品的黑素形成細(xì)胞的成熟度進(jìn)行比較。

結(jié)果如圖4顯示，相比對照樣品(a)，細(xì)胞因子添加樣品(b)中黑素形成細(xì)胞的成熟度更高，而細(xì)胞因子+vd添加樣品(c)中的結(jié)果比細(xì)胞因子添加樣品更好。另外，顯示對照樣品中的未成熟黑素細(xì)胞形成了球狀體，由此可以判斷，在形成成熟的黑素細(xì)胞時，向傳代1代的細(xì)胞添加細(xì)胞因子和vd是很有效的。

實(shí)施例13.分化方法的研究3

使用按上文記載的培養(yǎng)至完成實(shí)施例4的步驟(i)的細(xì)胞進(jìn)行分化。以只采用培養(yǎng)液培養(yǎng)的傳代1代細(xì)胞作為“對照樣品”；以培養(yǎng)中添加rhscf(gibco公司)(2.5μg/l)和rhwnt-3a(stemrd公司)(2.5μg/l)這兩種細(xì)胞因子的細(xì)胞作為“細(xì)胞因子添加樣品”；以在添加了10^-11m的vd3的細(xì)胞作為“vd添加樣品”。細(xì)胞融合時，使用與上文所述多階分化相同的條件進(jìn)行分化培養(yǎng)。分化培養(yǎng)后，使用dopa對各樣品的黑素細(xì)胞進(jìn)行染色，在實(shí)體顯微鏡下拍照，并觀察經(jīng)染色的黑素細(xì)胞的出現(xiàn)頻率。

結(jié)果如圖5所示，按照黑素細(xì)胞數(shù)量的多少排序?yàn)椋杭?xì)胞因子添加樣品＞vd添加樣品＞對照樣品，這表明添加細(xì)胞因子和vd3的均有利于提高黑素細(xì)胞的出現(xiàn)頻率。

實(shí)施例14.分化方法的研究4(acth的效果)

使用按上文記載培養(yǎng)的細(xì)胞。分化時，將細(xì)胞分為1μmacth添加樣品和無添加樣品(對照樣品)，使用倒置顯微鏡觀察分化工程1階段的細(xì)胞。

結(jié)果顯示，acth添加樣品的細(xì)胞尺寸比無添加樣品的細(xì)胞小1/4以上(參見圖6)，這表明acth維持角質(zhì)形成細(xì)胞的基底細(xì)胞狀態(tài)。

實(shí)施例15.分化方法的研究5(胰島素、全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白對分化的影響)

使用按上文記載的培養(yǎng)至完成實(shí)施例4的步驟(i)的細(xì)胞。分化時，在添加1μmacth的基礎(chǔ)上，共同添加5mg/l胰島素(version16公司)和5mg/l人全鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白(sigma公司)至分化培養(yǎng)液中。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，上述物質(zhì)的添加得到的結(jié)果(圖7)與應(yīng)用血清所得的結(jié)果(未顯示)相同。因此，采用本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)法能夠?qū)崿F(xiàn)通過無血清培養(yǎng)形成角質(zhì)形成細(xì)胞多層化的效果。

實(shí)施例16.分化方法的研究6(細(xì)胞因子對酪氨酸酶活性的影響)

根據(jù)上文所述方法處理獲自人胸部和包皮區(qū)域的皮膚，分離并獲得黑素形成細(xì)胞。研究來自以下這三種細(xì)胞因子rhscf(gibco公司)(10μg/l)、rhwnt-3a(stemrd公司)(10μg/l)、內(nèi)皮素-1(wako公司)(10μg/l)對酪氨酸酶活性的影響。

結(jié)果如圖8((a)：wnt+scf；(b)：scf+內(nèi)皮素)所示，表明添加wnt+scf的效果更佳。此外，dopa染色實(shí)驗(yàn)顯示，細(xì)胞因子添加的效果優(yōu)異程度排序?yàn)椋簑nt+scf>單獨(dú)添加scf、內(nèi)皮素或wnt>wnt+內(nèi)皮素>scf+內(nèi)皮素。

實(shí)施例17.比較不同部位采集的皮膚組織的黑素細(xì)胞的數(shù)量

按照前文記載的方法對源自人包皮或胸部的皮膚進(jìn)行處理、培養(yǎng)、分化。通過dopa染色研究黑素細(xì)胞的數(shù)量差異。

結(jié)果表明，源自包皮皮膚的黑素細(xì)胞明顯多于源自胸部皮膚的黑素細(xì)胞。因此，可以判定從身體不同部位采集的皮膚進(jìn)行培養(yǎng)的結(jié)果是有差異的。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

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