本發(fā)明涉及一種控制大白菜葉數(shù)的BrGRF12基因及其應(yīng)用，特別是一種促進大白菜葉數(shù)增加的BrGRF12基因及其應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)起源于中國，是我國乃至世界性的重要蔬菜作物之一。葉數(shù)的多少是大白菜的重要農(nóng)藝性狀之一，其多寡直接關(guān)系到大白菜產(chǎn)量的高低。但到目前為止，關(guān)于大白菜葉數(shù)多少的分子調(diào)控機制仍未知。

生長調(diào)控因子(growth-regulating factors,GRFs)是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子。它可以通過N-末端QLQ結(jié)構(gòu)域與GIF(GRF-interaction factor)蛋白中的SNH結(jié)構(gòu)域互作，形成功能復(fù)合體，共同參與下游基因的表達調(diào)控。GRF蛋白在植物生長發(fā)育過程中起到重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中過量表達OsGRF1基因可明顯抑制花序軸的伸長。但隨后對擬南芥GRF基因的研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中過量表達AtGRF1和AtGRF2基因可明顯促進轉(zhuǎn)基因植株葉片和子葉的增大，并抑制花序軸的伸長；相反，AtGRF1–AtGRF3基因功能同時缺失則可導(dǎo)致葉片和子葉變小，但單獨突變上述任何一個基因?qū)χ仓甑谋硇投紵o顯著影響，而同時突變上述任意兩個基因時只能輕微影響植株的表型。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，過量表達AtGRF2基因可促進轉(zhuǎn)基因植株細胞體積的增大，而AtGRF1–AtGRF3基因功能缺失體的細胞體積則明顯變小，這說明擬南芥GRF1-3基因是通過調(diào)控細胞的大小來促進或抑制器官的增大。但Kim和Lee對AtGRF4的研究表明，其在調(diào)控細胞分裂過程中具有重要作用。Horiguchi等和Vercruyssen等對AtGRF5基因的研究也發(fā)現(xiàn)，AtGRF5可通過維持或者促進細胞的分裂能力來促進植株器官的增大，并且過量表達AtGRF5還可促進葉綠體增殖、抑制暗處理條件下葉片的衰老。而對于AtGRF1和AtGRF3基因來說，只有同時突變掉AtGIF1基因時，Atgrf1/Atgrf3雙突變體才會顯著影響植株細胞的增值。另外，Horiguchi等對AtGRF9基因的研究發(fā)現(xiàn)，其在調(diào)控植物生長發(fā)育過程中無明顯作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種控制大白菜葉數(shù)的BrGRF12基因及其應(yīng)用。

一種控制大白菜葉數(shù)的BrGRF12基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

上述BrGRF12基因全長1281bp，編碼426個氨基酸，在進化上，與BrGRF12基因具有較近親緣關(guān)系的為擬南芥AtGRF9基因；二者的核苷酸序列一致性僅為78.59％，氨基酸序列一致性僅為70.09％，種間差異較大。另外，對擬南芥AtGRF9基因的研究發(fā)現(xiàn)，其在調(diào)控植物生長發(fā)育中無明顯作用，而發(fā)明人對大白菜BrGRF12的研究則發(fā)現(xiàn)其在調(diào)控葉數(shù)發(fā)育中具有重要作用，并且這一功能在其他GRF基因上未見報道。

一種上述BrGRF12基因編碼的調(diào)控因子，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

一種插入上述SEQ ID No.1所示核苷酸序列的重組載體。

上述BrGRF12基因、重組載體在經(jīng)濟作物生產(chǎn)改良中的應(yīng)用。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述的經(jīng)濟作物為大白菜。

有益效果

本發(fā)明從大白菜中克隆了BrGRF12基因，并驗證了該基因具有促進葉片數(shù)目增多的功能，經(jīng)試驗，通過過量表達該基因，可以獲得比野生型植株葉數(shù)增多的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的基因可為培育農(nóng)作物新品種提供理論依據(jù)和基因來源。

附圖說明

圖1為蛭石上生長40天的野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的對比照片；

圖中：A、野生型和轉(zhuǎn)基因植株整體表型，B、為野生型和轉(zhuǎn)基因植株不同葉位葉片的分解表型。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例及說明書附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步說明，但本發(fā)明所保護范圍不限于此。

實施例

大白菜mRNA的提取

以大白菜品種福山包頭10天苗齡幼苗的地上部分為材料，置于液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮快速磨成粉末，將100mg粉末裝入1.5ml離心管中，加入1ml Trizol(購自Invitrogen公司)顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。在4℃，12000rpm離心10分鐘，取上清液移至新的1.5ml離心管中。加入200μl氯仿，用手劇烈搖晃15秒鐘，室溫靜置2～3分鐘。4℃，12000rpm離心10分鐘。取無色上層水相至一新的離心管中，加入600μl～20℃冰箱預(yù)冷異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。4℃，12000rpm離心10分鐘，除上清液。加入1ml 75％(v/v)乙醇，渦旋震蕩。4℃，7500rpm離心3分鐘。室溫干燥3～5分鐘，加入30μl的無RNase的水溶解沉淀，然后置于55℃水浴中溶解10分鐘，迅速冰浴5分鐘后瞬時離心，制得mRNA。

BrGRF12基因的獲得

利用RT-PCR方法擴增BrGRF12基因的編碼序列，具體操作方法如下：

將制得的mRNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，所用反轉(zhuǎn)錄酶為Takara公司生產(chǎn)的M-MLV reverse transcriptase，反應(yīng)體系為20μl。依次加入1μl oligo dT、2μg RNA和無RNase水至13.5μl，在70℃水浴中變性5分鐘，迅速冰浴5分鐘，瞬時離心，然后依次加入1μl 10mM dNTP，4μl 5×RT緩沖液，0.5μl RNase inhibitor和1μl反轉(zhuǎn)錄酶?；旌暇鶆?，42℃反應(yīng)60分鐘，70℃水浴10分鐘使酶失活，制得第一鏈cDNA。

以第一鏈cDNA為模板擴增目的基因，所用引物核苷酸序列如下：

BrGRF12-F:5'-GGGGTACCTTACAAAGTAACAAGATGCAGAGC-3'(SEQ ID NO.3)

BrGRF12-R:5'-GCGTCGACTGTTTTTTTAAACACCTGAAGAAC-3'(SEQ ID NO.4)

PCR反應(yīng)體系為25μl，依次加入10×PCR緩沖液2.5μl，2.5mM dNTP 2μl，第一鏈cDNA 2μl，10mM正向引物0.5μl，10mM反向引物0.5μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.25μl，最后加水至25μl。

PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃3分鐘；變性94℃30秒，退火58℃30秒，延伸72℃2分鐘，30個循環(huán)；最后延伸10分鐘，4℃保存。

將上述PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，加入pUC18 DNA vector中，pUC18 DNA vector由Takara公司產(chǎn)售，經(jīng)連接反應(yīng)，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞進行檢測，取陽性菌株，制得連接好的載體；

上述連接體系10μl，各組分為1μl pUC18 DNA vector，2μl PCR產(chǎn)物，1μl T4 DNA連接酶，1μl 10×反應(yīng)緩沖液，加水補至10μl；上述連接條件為：16℃水浴中反應(yīng)12-16小時。

將連接好的載體進行測序，確認正確無誤，經(jīng)檢測，BrGRF12基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，全長1281bp，編碼426個氨基酸。

轉(zhuǎn)基因植株的獲得

將上述連接好的載體用Takara公司生產(chǎn)的KpnI和SalI內(nèi)切酶酶切，操作如下：

反應(yīng)體系50μl，包括7.5μl 10×T緩沖液，20μl連接好的載體，2μl KpnI內(nèi)切酶，2μl SalI內(nèi)切酶和18.5μl水；反應(yīng)條件為：在37℃水浴4個小時；

將酶切后的BrGRF12基因經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，用杭州博日科技有限公司產(chǎn)售的Biospin Gel Extraction Kit回收基因片段，操作如下：用干凈、鋒利的手術(shù)刀，將含有BrGRF12基因的瓊脂糖凝膠切下，并放入1.5ml離心管中。按1:3的比例加入Extraction buffer。于50℃恒溫水浴中直到凝膠融化。將混合液全部轉(zhuǎn)入Spin column內(nèi)，于6000rpm離心1分鐘，棄去接液管內(nèi)液體。向Spin column中加入500μl Extraction buffer，于12000rpm離心1分鐘，棄去接液管內(nèi)液體。向Spin column中加入750μl Wash Buffer，于12000rpm離心1分鐘，棄去接液管內(nèi)液體。再次于12000rpm離心1分鐘，然后將Spin column轉(zhuǎn)移至無菌的1.5ml離心管內(nèi)。向Spin column中加入50μl Elution Buffer，并于室溫放置1分鐘。12000rpm離心1分鐘，收集含有BrGRF12基因的溶液。上述詳細操作可參見Biospin Gel Extraction Kit的產(chǎn)品使用說明書。

將上述含有BrGRF12基因的溶液中的BrGRF12基因連接入植物表達載體pCAMBIA2300-35S-OCS(購自Biovector公司)中，操作如下：

反應(yīng)體系10μl，包括1μl pCAMBIA2300-35S-OCS，5μl含有BrGRF12基因的溶液，1μl 10×T4連接酶緩沖液和1μl T4連接酶，加水至10μl；反應(yīng)條件為：在16℃下連接12-16小時；

經(jīng)上述反應(yīng)，制得質(zhì)粒DNA，然后將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒進行鑒定，制得構(gòu)建好的質(zhì)粒DNA。

將構(gòu)建好的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404(購自Biovector公司)中，操作如下：

取100μl農(nóng)桿菌LBA4404細胞溶液經(jīng)電擊制備農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞，加入3μl構(gòu)建好的質(zhì)粒DNA，冰浴5分鐘，液氮冷凍1分鐘，37℃水浴5分鐘，然后加入1ml LB培養(yǎng)基(1升LB培養(yǎng)基含：5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10g氯化鈉)，28℃，200rpm振蕩3小時。10000rpm離心1分鐘，棄上清，加入100μl LB培養(yǎng)基重懸細胞，涂布于含有50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平的LB平板培養(yǎng)基上(1升LB平板培養(yǎng)基含：5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10g氯化鈉，15g瓊脂)，28℃培養(yǎng)2-3天，選取經(jīng)轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌LBA4404；

通過浸花法將上述經(jīng)轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化擬南芥(Columbia ecotype)，操作如下：

將經(jīng)轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌LBA4404接種于5ml LB培養(yǎng)基中，28℃，200rpm振蕩過夜，按2wt％的接種量接種于200ml新鮮LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD₆₀₀為1.0，4500rpm離心5分鐘收集菌體，重懸于侵染液中，將擬南芥的花序浸入侵染液中30秒，把花盆側(cè)放于托盤中，蒙上地膜避光24小時，第二天取下地膜，將花盆直立；

上述侵染液含有5wt％蔗糖，0.03wt％Tween(吐溫)-20。

制備1/2MS篩選平板(1/2MS培養(yǎng)基加50mg/L卡那霉素，100mg/L羧芐青霉素)，T₁代種子用70％(v/v)乙醇消毒5分鐘，2wt％次氯酸鈉消毒10分鐘后播種于1/2MS篩選平板，每板播種100μg的擬南芥種子。4℃春化3天后放于培養(yǎng)箱(22℃，16小時光照/8小時黑暗)中。6天后選出綠色的生長正常的陽性植株，移入蛭石中培養(yǎng)，單株收獲T₂代種子。繁殖后獲得T₃代，鑒定T₃代，獲得純合的轉(zhuǎn)基因株系10株。

BrGRF12基因功能的鑒定

純合的轉(zhuǎn)基因株系和野生型擬南芥種子在4℃冰箱中春化3天，消毒后將種子播于1/2MS培養(yǎng)基平板。待1/2MS培養(yǎng)基平板上生長的幼苗的子葉完全張開后，將轉(zhuǎn)基因株系和野生型幼苗轉(zhuǎn)入蛭石中，然后置于培養(yǎng)間(22℃，16小時光照/8小時黑暗)中培養(yǎng)，培養(yǎng)40天后觀察純合的轉(zhuǎn)基因株系和野生型植株的表型(結(jié)果如圖1所示)。通過觀察發(fā)現(xiàn)純合的轉(zhuǎn)基因株系葉片數(shù)目明顯增多，說明BrGRF12基因的過量表達促進了葉數(shù)的增加。

SEQUENCE LISTING

<110> 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所

<120> 控制大白菜葉數(shù)的BrGRF12基因及其應(yīng)用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1281

<212> DNA

<213> Brassica rapa L. ssp. pekinensis

<400> 1

atgcagagcc ctaaaacaga ggaggaggat gagtggagga ggaagaagtg gccgtgtatg 60

aaagctgctc agttacaaga gtttagaatg caagctttgg tttatagata catagaagct 120

ggtgttcgcg tgcctaatca tcttgttgtc cctatttgga acagtcttgc tctctcttct 180

tcctcatcct ccggttacct tatccaccac aactatccct cctcttccaa tgcagtgttg 240

aatgataagg tggatcctga acccacaagg tgcaggagaa cagatgggaa gaaatggagg 300

tgtagcaaca aagtcctcct gtttcagaag tactgtgaac ggcacatgca tagaggccgt 360

aaacgttcaa gaaagcttgt ggaatcttct tcttcttatg acgttgcttc gtcctttgct 420

tcaaccaaac gagacaatac tgatggtctt aacagtagca ctgagagtca tagtgtttct 480

catggggcaa tgtcagtttc tagtaatgct caggttgtca ccattgcttc actgcctagt 540

gcaagagtct gtgataacat ccctcgacca tctctagtgg tcaccgagtc cacaaacaaa 600

agtgtgagaa ggaggatcac ggacatgagt tatgatgact tcatcaaaca aagaggcgcg 660

actacgtgtg ttagagggtt tcccgttcaa ggttctgaga ggttaccttc tgttcaaaag 720

ttctttcctg aggcatctga taacacctca gaagctgcaa gaatctcaag caacaggaag 780

aatgagatca ttgcaagaag cagagaatgg aagaacatga atgttaattg cggtggcttg 840

tttcctggca tccacttctc tccagacact gttcttcaag atcgtggtgg gtttggttta 900

cacagagttg aaacagacag cgaaccagga aggtgcagaa gaacagatgg aaagaagtgg 960

agatgcagca aagatgtgtt gtctggtcag aagtattgcg ataggcacat gcatagaggt 1020

agtattaaga agaagcatcc agtggaaacg actcacacac atgagaatac cgtgaaaaca 1080

gctgctagat ctgtgacttg ccaagatgga gatggccaga agctccctgt ttcagtcctg 1140

ggaagagagc agctgtccag agtttcagat gagaagaata ccactaacag ttgcagtacc 1200

gacaccacca tcactgacat agctttaaag ggtgaagaag acaatgagga ggtcttgtca 1260

ttgtgttctt caggtgttta a 1281

<210> 2

<211> 426

<212> PRT

<213> Brassica rapa L. ssp. pekinensis

<400> 2

Met Gln Ser Pro Lys Thr Glu Glu Glu Asp Glu Trp Arg Arg Lys Lys

1 5 10 15

Trp Pro Cys Met Lys Ala Ala Gln Leu Gln Glu Phe Arg Met Gln Ala

20 25 30

Leu Val Tyr Arg Tyr Ile Glu Ala Gly Val Arg Val Pro Asn His Leu

35 40 45

Val Val Pro Ile Trp Asn Ser Leu Ala Leu Ser Ser Ser Ser Ser Ser

50 55 60

Gly Tyr Leu Ile His His Asn Tyr Pro Ser Ser Ser Asn Ala Val Leu

65 70 75 80

Asn Asp Lys Val Asp Pro Glu Pro Thr Arg Cys Arg Arg Thr Asp Gly

85 90 95

Lys Lys Trp Arg Cys Ser Asn Lys Val Leu Leu Phe Gln Lys Tyr Cys

100 105 110

Glu Arg His Met His Arg Gly Arg Lys Arg Ser Arg Lys Leu Val Glu

115 120 125

Ser Ser Ser Ser Tyr Asp Val Ala Ser Ser Phe Ala Ser Thr Lys Arg

130 135 140

Asp Asn Thr Asp Gly Leu Asn Ser Ser Thr Glu Ser His Ser Val Ser

145 150 155 160

His Gly Ala Met Ser Val Ser Ser Asn Ala Gln Val Val Thr Ile Ala

165 170 175

Ser Leu Pro Ser Ala Arg Val Cys Asp Asn Ile Pro Arg Pro Ser Leu

180 185 190

Val Val Thr Glu Ser Thr Asn Lys Ser Val Arg Arg Arg Ile Thr Asp

195 200 205

Met Ser Tyr Asp Asp Phe Ile Lys Gln Arg Gly Ala Thr Thr Cys Val

210 215 220

Arg Gly Phe Pro Val Gln Gly Ser Glu Arg Leu Pro Ser Val Gln Lys

225 230 235 240

Phe Phe Pro Glu Ala Ser Asp Asn Thr Ser Glu Ala Ala Arg Ile Ser

245 250 255

Ser Asn Arg Lys Asn Glu Ile Ile Ala Arg Ser Arg Glu Trp Lys Asn

260 265 270

Met Asn Val Asn Cys Gly Gly Leu Phe Pro Gly Ile His Phe Ser Pro

275 280 285

Asp Thr Val Leu Gln Asp Arg Gly Gly Phe Gly Leu His Arg Val Glu

290 295 300

Thr Asp Ser Glu Pro Gly Arg Cys Arg Arg Thr Asp Gly Lys Lys Trp

305 310 315 320

Arg Cys Ser Lys Asp Val Leu Ser Gly Gln Lys Tyr Cys Asp Arg His

325 330 335

Met His Arg Gly Ser Ile Lys Lys Lys His Pro Val Glu Thr Thr His

340 345 350

Thr His Glu Asn Thr Val Lys Thr Ala Ala Arg Ser Val Thr Cys Gln

355 360 365

Asp Gly Asp Gly Gln Lys Leu Pro Val Ser Val Leu Gly Arg Glu Gln

370 375 380

Leu Ser Arg Val Ser Asp Glu Lys Asn Thr Thr Asn Ser Cys Ser Thr

385 390 395 400

Asp Thr Thr Ile Thr Asp Ile Ala Leu Lys Gly Glu Glu Asp Asn Glu

405 410 415

Glu Val Leu Ser Leu Cys Ser Ser Gly Val

420 425

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ggggtacctt acaaagtaac aagatgcaga gc 32

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gcgtcgactg tttttttaaa cacctgaaga ac 32