本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及殺鮭氣單胞菌的SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)最早由Emmerich和Weible在1890年從鱒魚(yú)中分離出并進(jìn)行了描述。現(xiàn)已經(jīng)確定殺鮭氣單胞菌是氣單胞菌科(Aeromonadacea)氣單胞菌屬(Aeromonas)的非運(yùn)動(dòng)性氣單胞菌(non-motile aeromonads)。該菌可引起鮭鱒魚(yú)類如大西洋鮭(Salmo salar)、褐鱒(Salmo trutta)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)等發(fā)生癤瘡病或潰瘍病，患病魚(yú)表現(xiàn)出體側(cè)或尾部形成特征性膿腫，嚴(yán)重膿腫時(shí)可出現(xiàn)潰爛并形成潰瘍；剖檢可觀察到肝臟及脂肪組織有點(diǎn)狀出血。該菌還可與氣單胞菌屬的其它菌如豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)和溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)等混合感染，給鮭科魚(yú)類養(yǎng)殖帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p失。此外，該菌也是一些其他水生動(dòng)物疾病的原發(fā)性病原菌，可經(jīng)皮膚、鰓、口及血液等途徑感染除了鮭科外的其他魚(yú)類如大菱鲆(Psetta maxima)、石鰈(Platichthys bicoloratus)、刺參(Oplopanax elatus Nakai)、鯉魚(yú)(Cyprinus carpio)等。

由殺鮭氣單胞菌感染引起的鮭鱒魚(yú)類癤瘡病嚴(yán)重制約了養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，而我國(guó)尚未研制出針對(duì)該菌的商業(yè)化疫苗，使得養(yǎng)殖魚(yú)類受到殺鮭氣單胞菌感染的潛在威脅更為嚴(yán)峻。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)殺鮭氣單胞菌的檢測(cè)主要依賴于傳統(tǒng)的微生物分離、培養(yǎng)和鑒定方法，其操作過(guò)程費(fèi)時(shí)、繁瑣，且很難得到準(zhǔn)確結(jié)果，常常延誤病情診斷。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)方法的不斷發(fā)展，許多分子生物學(xué)診斷技術(shù)如16S rRNA PCR方法、ELISA快速檢測(cè)法、LAMP檢測(cè)方法、RAPD方法等均可快速檢測(cè)病原。但由于殺鮭氣單胞菌及其亞種的復(fù)雜性，普通PCR技術(shù)很難達(dá)到檢測(cè)要求的高特異性和穩(wěn)定重復(fù)性，使得在實(shí)際應(yīng)用中難以推廣。TaqMan探針?lè)?、SYBR GreenⅠ染料法和分子信標(biāo)技術(shù)等是實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)的常用方法。相比于常規(guī)PCR，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于高靈敏度、可重復(fù)、易于標(biāo)準(zhǔn)化和高通量等，還可以檢測(cè)常規(guī)PCR無(wú)法檢測(cè)的樣品，擴(kuò)增和檢測(cè)在同一塊96孔板內(nèi)完成，不需要電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，減少了污染的可能性，具有優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)殺鮭氣單胞菌的引物。

本發(fā)明提供的檢測(cè)或輔助檢測(cè)殺鮭氣單胞菌的引物由SEQ ID No.1所示的單鏈DNA分子和SEQ ID No.2所示的單鏈DNA分子組成。

上述引物中，所述引物1和所述引物2的摩爾量比為1:1。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)殺鮭氣單胞菌的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑。

本發(fā)明提供的檢測(cè)或輔助檢測(cè)殺鮭氣單胞菌的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑包括上述引物。

上述實(shí)時(shí)熒光PCR試劑中，所述引物1和所述引物2在所述實(shí)時(shí)熒光PCR試劑中的終濃度均為0.25μmol/L。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)殺鮭氣單胞菌的試劑盒。

本發(fā)明提供的檢測(cè)或輔助檢測(cè)殺鮭氣單胞菌的試劑盒包括上述引物或上述實(shí)時(shí)熒光PCR試劑。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供上述引物或上述實(shí)時(shí)熒光PCR試劑或上述試劑盒的新用途。

本發(fā)明提供了上述引物或上述實(shí)時(shí)熒光PCR試劑或上述試劑盒在如下1)-6)中任一種中的應(yīng)用：

1)檢測(cè)或輔助檢測(cè)殺鮭氣單胞菌；

2)制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)殺鮭氣單胞菌的產(chǎn)品；

3)檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品是否感染殺鮭氣單胞菌；

4)制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品是否感染殺鮭氣單胞菌的產(chǎn)品；

5)檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中殺鮭氣單胞菌fstA基因的拷貝數(shù)；

6)制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中殺鮭氣單胞菌fstA基因的拷貝數(shù)的產(chǎn)品。

本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品是否感染殺鮭氣單胞菌的方法。

本發(fā)明提供的檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品是否感染殺鮭氣單胞菌的方法包括如下步驟：

用上述引物對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物滿足如下條件：產(chǎn)生擴(kuò)增曲線，且Ct值為0-38，則說(shuō)明待測(cè)樣品感染或候選感染殺鮭氣單胞菌；若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不滿足上述條件，則說(shuō)明待測(cè)樣品中不含有或候選不含有殺鮭氣單胞菌。

本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中殺鮭氣單胞菌fstA基因的拷貝數(shù)的方法。

本發(fā)明提供的檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中殺鮭氣單胞菌fstA基因的拷貝數(shù)的方法包括如下步驟：

用上述引物對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Ct值；根據(jù)所述Ct值，計(jì)算所述待測(cè)樣品中殺鮭氣單胞菌fstA基因的拷貝數(shù)。

上述方法中，所述根據(jù)所述Ct值，計(jì)算所述待測(cè)樣品中殺鮭氣單胞菌fstA基因的拷貝數(shù)的方法為將Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y＝-4.2552x+39.644(其中，x為lg^{fstA基因拷貝數(shù)}，y為Ct值)，計(jì)算得到fstA基因的拷貝數(shù)。所述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y＝-4.2552x+39.644是以lg^{fstA基因拷貝數(shù)}為x軸，Ct值為y軸建立的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。

上述方法中，所述實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的退火溫度為60℃。

上述方法中，所述實(shí)時(shí)熒光PCR的模板為待測(cè)樣品的基因組DNA。

本發(fā)明根據(jù)GenBank中殺鮭氣單胞菌鐵載受體(ferric siderophore receptor，fstA)基因序列設(shè)計(jì)并合成一對(duì)特異性引物，經(jīng)過(guò)反應(yīng)體系優(yōu)化后建立了檢測(cè)殺鮭氣單胞菌的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。將fstA基因克隆到pMD18T載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18T-fstA并制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示該標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，擴(kuò)增所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝-4.2552x+39.644，相關(guān)系數(shù)R²為0.988；熔解曲線分析顯示產(chǎn)物為單一的特異峰。特異性檢測(cè)結(jié)果表明，該方法對(duì)殺鮭氣單胞菌及其亞種具有良好的特異性，與其他細(xì)菌不發(fā)生交叉反應(yīng)；最低檢測(cè)限為33拷貝/μL，較常規(guī)PCR的靈敏度高出約100倍。應(yīng)用本發(fā)明建立的方法對(duì)人工感染的虹鱒病樣進(jìn)行了檢測(cè)，待檢樣品均呈陽(yáng)性反應(yīng)，表明本發(fā)明的方法準(zhǔn)確、可靠。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)證明：本發(fā)明建立的殺鮭氣單胞菌的SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法不僅具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和重復(fù)性好的特點(diǎn)，相比于現(xiàn)有技術(shù)中的Taqman探針?lè)?，本發(fā)明不需要設(shè)計(jì)和合成有熒光標(biāo)記的探針，還具有操作方便、鑒定快速和結(jié)果客觀等優(yōu)點(diǎn)，可用于殺鮭氣單胞菌的快速診斷及定量檢測(cè)，為鮭鱒魚(yú)癤瘡病的診斷及防控提供技術(shù)手段。

附圖說(shuō)明

圖1為引物特異性檢測(cè)結(jié)果。M：分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1-11：殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種、無(wú)色亞種、殺日本鮭亞種、史氏亞種、嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌、魯氏耶爾森菌、遲緩愛(ài)德華氏菌、金黃色葡萄球菌。

圖2為SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解曲線。

圖3為用pMD18-fstA構(gòu)建的實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中，橫坐標(biāo)代表的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度為10²至10⁷拷貝/μL。

圖4為SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度檢測(cè)結(jié)果。注：1-6：質(zhì)粒稀釋為10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹拷貝/μL。

圖5為普通PCR靈敏度檢測(cè)結(jié)果。注：1-8：質(zhì)粒稀釋為10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹拷貝/μL。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

實(shí)施例1、一種用于檢測(cè)殺鮭氣單胞菌的引物的設(shè)計(jì)及其檢測(cè)方法

一、用于檢測(cè)殺鮭氣單胞菌的引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank上殺鮭氣單胞菌fstA基因(登錄號(hào)：AM712656.1)序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件PrimerExplorer設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，引物序列：

AsF-F：5’-TTGTCGGCGAACCTTGTAG-3’(序列1)；

AsF-R：5’-CAAGAGCAAGACGCAGACG-3’(序列2)。

二、檢測(cè)殺鮭氣單胞菌的方法

以待測(cè)魚(yú)體組織樣品的基因組DNA為模板，采用步驟一的AsF-F/AsF-R引物進(jìn)行熒光定量PCR，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物滿足如下條件：產(chǎn)生擴(kuò)增曲線，且Ct值為0-38，則說(shuō)明待測(cè)樣品感染或候選感染殺鮭氣單胞菌；若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不滿足上述條件，則說(shuō)明待測(cè)樣品中不含有或候選不含有殺鮭氣單胞菌。

實(shí)施例2、用于檢測(cè)殺鮭氣單胞菌的引物的特異性檢測(cè)

1、基因組DNA的提取

采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(購(gòu)自天根生化科技有限公司)分別提取如下各菌株的基因組DNA：殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種、殺鮭氣單胞菌無(wú)色亞種、殺鮭氣單胞菌殺日本鮭亞種、殺鮭氣單胞菌史氏亞種、嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌、魯氏耶爾森菌、遲緩愛(ài)德華氏菌、熒光假單胞菌、金黃色葡萄球菌和溶壁微球菌。各菌株的編號(hào)、拉丁名和來(lái)源見(jiàn)表1。

表1菌株及其來(lái)源

2、常規(guī)PCR擴(kuò)增和熒光定量PCR擴(kuò)增

以步驟1獲得的各個(gè)菌株的基因組DNA為模板，采用步驟一中設(shè)計(jì)的引物分別進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增和熒光定量PCR擴(kuò)增。同時(shí)以滅菌去離子水為陰性對(duì)照。

(1)普通PCR反應(yīng)體系：滅菌去離子水7μL，2×PCR premix 10μL，10μmol/L的引物AsF-F/AsF-R各1μL，DNA模板1μL；PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3min；94℃變性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果，然后采用膠回收試劑盒(購(gòu)自天根生化科技有限公司)將擴(kuò)增得到的電泳條帶進(jìn)行切膠回收并純化；再將純化后的PCR產(chǎn)物直接與pMD18-T Vector(寶生物工程有限公司)于16℃連接3h，得到重組質(zhì)粒pMD18T-fstA；將pMD18T-fstA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布于含有Amp的LB平板上37℃過(guò)夜培養(yǎng)；挑取單菌落，轉(zhuǎn)于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃200rpm振蕩培養(yǎng)12h后提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定及測(cè)序。

(2)熒光定量PCR反應(yīng)體系：thunderbird qPCR mix(日本toyobo公司)10.5μL，上下游引物AsF-F/AsF-R(0.25μmol/L)各0.5μL，DNA模板1μL，滅菌去離子水7.5μL，總體積為20μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30sec；95℃變性10sec；60℃退火30sec；72℃延伸30sec，共40個(gè)循環(huán)。PCR循環(huán)結(jié)束后，樣品加熱到95℃后馬上降至60℃并保持15sec，然后按照1.75℃·s^-1遞增到95℃，在60℃時(shí)收集熒光信號(hào)，建立熔解曲線。

3、檢測(cè)結(jié)果

常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，AsF-F/AsF-R引物的特異性表現(xiàn)良好，以殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種、無(wú)色亞種、殺日本鮭亞種和史氏亞種的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR均擴(kuò)增出大小為170bp的目的條帶，而供試其他病原菌：嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌、魯氏耶爾森菌、遲緩愛(ài)德華氏菌、熒光假單胞菌、金黃色葡萄球菌、溶壁微球菌的結(jié)果均為陰性(圖1)。

SYBR Green I Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果同樣證明了引物具有良好的特異性，從SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解曲線可以看出：只有殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種、無(wú)色亞種、殺日本鮭亞種和史氏亞種有單一的產(chǎn)物吸收峰，而供試其他病原菌：嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌、魯氏耶爾森菌、遲緩愛(ài)德華氏菌、熒光假單胞菌、金黃色葡萄球菌和溶壁微球菌均未檢測(cè)到特異的產(chǎn)物吸收峰(圖2)。由熔解曲線可知，Tm值在86.5-86.9℃范圍內(nèi)，表明反應(yīng)過(guò)程中未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增和引物二聚體。

實(shí)施例3、一種用于檢測(cè)殺鮭氣單胞菌的引物的靈敏度檢測(cè)

一、制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品

用微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定實(shí)施例2步驟二的2中的(1)獲得的含有pMD18T-fstA重組質(zhì)粒的溶液的濃度和純度，根據(jù)摩爾定律計(jì)算出單位體積pMD18T-fstA重組質(zhì)粒所含的DNA拷貝數(shù)，并將該重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算公式如下：

其中，質(zhì)粒濃度為105ng/μL；質(zhì)粒體積為1μL；載體長(zhǎng)度：2692bp；片段長(zhǎng)度為170bp。最終計(jì)算結(jié)果：每μL重組質(zhì)粒所含的DNA拷貝數(shù)為3.3×10¹⁰。

二、熒光定量PCR的靈敏度

將含有pMD18T-fstA重組質(zhì)粒的溶液進(jìn)行10倍梯度稀釋，稀釋成10⁹拷貝/μL至10¹拷貝/μL。取10⁶至10¹拷貝/μL共6個(gè)稀釋度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，采用引物AsF-F/AsF-R進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系和方法同實(shí)施例2步驟二的2中的(2)，并以lg^{質(zhì)?？截悢?shù)(fstA基因拷貝數(shù))}為x軸，以Ct值為y軸，構(gòu)建SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，所能檢出的最低起始模板濃度即為SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR的靈敏度。

SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝-4.2552x+39.644，相關(guān)系數(shù)R²為0.988，由標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看出(圖3)，質(zhì)?？截悢?shù)與PCR的Ct值之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。且SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增最低檢測(cè)限為33拷貝/μL(圖4)。

三、常規(guī)PCR的靈敏度

取10⁸至10¹拷貝/μL共8個(gè)稀釋度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，利用AsF-F/AsF-R引物進(jìn)行常規(guī)PCR，擴(kuò)增體系和方法同實(shí)施例2步驟二的2中的(1)。

常規(guī)PCR在模板濃度為3.3×10⁴拷貝/μL時(shí)能觀察到目的條帶(圖5)，在濃度為3.3×10³時(shí)的條帶亮度很弱比較模糊，由此可以看出熒光定量PCR的靈敏度比常規(guī)PCR高100倍。

四、標(biāo)準(zhǔn)曲線的重復(fù)性檢測(cè)

選取構(gòu)建好的pMD18T-fstA重組質(zhì)粒稀釋6個(gè)梯度，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)，比較在同一次實(shí)驗(yàn)中3個(gè)重復(fù)間的均一性，并通過(guò)組內(nèi)的Ct值變異系數(shù)(標(biāo)準(zhǔn)偏差/重復(fù)值平均數(shù))評(píng)價(jià)該方法的重復(fù)性。具體步驟如下：

分別以10²至10⁷拷貝/μL共6個(gè)稀釋度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，采用引物AsF-F/AsF-R進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系和方法同實(shí)施例2步驟二的2中的(2)，每個(gè)梯度選取3個(gè)重復(fù)管，進(jìn)行組內(nèi)SYBR Green I熒光PCR重復(fù)性分析，計(jì)算其Ct均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。

結(jié)果如表2所示，標(biāo)準(zhǔn)品濃度在10²至10⁷拷貝/μL之間的3個(gè)重復(fù)的Ct值基本一致，標(biāo)準(zhǔn)差在0.073-0.454之間，變異系數(shù)在0.25-2.92％之間。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，本發(fā)明所建立的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法重復(fù)性好，可進(jìn)行穩(wěn)定、可靠的檢測(cè)。

表2以pMD18-fstA重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)模板的實(shí)時(shí)熒光定量PCR重復(fù)試驗(yàn)

實(shí)施例4、SYBR-GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的應(yīng)用

為評(píng)價(jià)殺鮭氣單胞菌SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的有效性，利用殺鮭氣單胞菌人工感染健康虹鱒魚(yú)，于攻毒后1d、3d和7d，采集感染殺鮭氣單胞菌的虹鱒魚(yú)的鰓、肝和腸組織進(jìn)行研磨作為待測(cè)樣品，并提取基因組DNA，按實(shí)施例2步驟二的2中的(2)的方法進(jìn)行SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，并通過(guò)待測(cè)樣品的擴(kuò)增曲線圖及Ct值進(jìn)行結(jié)果判斷。

結(jié)果顯示，待測(cè)樣品均產(chǎn)生擴(kuò)增曲線，且Ct值均為0-38范圍內(nèi)，均呈陽(yáng)性反應(yīng)。不同待測(cè)樣品的PCR對(duì)應(yīng)的Ct值見(jiàn)表3。將Ct值代入實(shí)施例3中已建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝-4.2552x+39.644(其中，x為lg^{fstA基因拷貝數(shù)}，y為Ct值)，計(jì)算出對(duì)應(yīng)fstA基因的拷貝數(shù)。計(jì)算結(jié)果如表4所示。

表3待檢樣品實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的Ct值

表4待檢樣品Ct值所對(duì)應(yīng)基因的拷貝數(shù)

因此可以通過(guò)如下方法檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中殺鮭氣單胞菌fstA基因的拷貝數(shù)：用AsF-F/AsF-R引物對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Ct值；然后將Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝-4.2552x+39.644(其中，x為lg^{fstA基因拷貝數(shù)}，y為Ct值)，計(jì)算待測(cè)樣品中殺鮭氣單胞菌fstA基因的拷貝數(shù)。

序列表

<110> 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所

<120> 殺鮭氣單胞菌的SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法及其應(yīng)用

<160> 2

<210> 1

<211> 19bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

ttgtcggcga accttgtag 19

<210> 2

<211> 19bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

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