本發(fā)明涉及基因檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種基于高通量測(cè)序檢測(cè)人循環(huán)腫瘤DNAKRAS基因的捕獲的探針及試劑盒。
背景技術(shù)：
：在血液中存在著游離的小片段DNA(cell-freeDNA，cfDNA)，它們來自死亡的細(xì)胞。通常死亡的細(xì)胞會(huì)被清除掉，因此cfDNA的含量是非常低的，通常一個(gè)健康人的1mL血漿中含25ngcfDNA。而癌癥患者的cfDNA的含量高出正常幾倍，其中一部分是ctDNA(circulatingtumorDNA)。ctDNA的相對(duì)含量與腫瘤的負(fù)荷和對(duì)治療的反應(yīng)是相關(guān)的，可用于鑒定驅(qū)動(dòng)基因、指導(dǎo)臨床治療、監(jiān)測(cè)臨床治療效果及癌癥復(fù)發(fā)、揭示治療抗性以及檢測(cè)疾病進(jìn)展。在有些方面ctDNA方法的靈敏度甚至高傳統(tǒng)的手段。例如，與傳統(tǒng)的影像學(xué)檢測(cè)相比，追蹤早期乳腺癌患者術(shù)后血液中的腫瘤DNA，可以提前7.9個(gè)月發(fā)現(xiàn)乳腺癌復(fù)發(fā)。在肺癌、腸癌中檢測(cè)cfDNA的KRAS突變對(duì)肺癌也有著重要的診斷價(jià)值。ctDNA在癌癥早期就可以被檢測(cè)到。因?yàn)閏fDNA容易收集，在肺癌中已顯示與組織中的變異高度一致，因此ctDNA的液體活檢越來越受到關(guān)注。血液中ctDNA含量，在癌癥早期占cfDNA的比例是非常低，通常小于0.1％。ctDNA檢測(cè)方法很多，如用數(shù)字化PCR(DigitalPCR)，或下一代測(cè)序(NextGenerationSequencing,NGS)等。通過NGS優(yōu)化ctDNA的深度測(cè)序(CAPP-seq)使突變檢測(cè)的敏感度達(dá)到0.02％，特異性為100％。此方法結(jié)合降低背景噪聲的iDES(integratedDigitalErrorSuppression)分析方法后，使檢測(cè)頻率的閾值進(jìn)一步下降到0.004％。從而大大提高了分析CtDNA的檢出率。KRAS突變?cè)诜伟┖徒Y(jié)直腸癌中均很常見，其與腫瘤細(xì)胞的生存、增殖、遷移、擴(kuò)散和血管生成均有密切關(guān)系。同時(shí)KRAS突變是所有腫瘤中突變頻率最高的基因，因此成為研究的焦點(diǎn)。KRAS基因是EGFR的下游因子，若KRAS基因發(fā)生突變，則患者不能從酪氨酸激酶抑制劑中獲益，且對(duì)EGFR一TKIS耐藥。因此KRAS的突變檢測(cè)成為靶向治療的關(guān)鍵。通過對(duì)人循環(huán)腫瘤DNAKRAS基因的檢測(cè)可篩檢出肺癌、腸癌及其他相關(guān)惡性腫瘤的高危人群，利于該類疾病的早期診斷治療。耗資30億美元?dú)v時(shí)10余年完成的人類基因組計(jì)劃(HumanGenomeProject,HGP)給基因組學(xué)研究帶來了天翻地覆的變化，通過測(cè)定人類基因組DNA的序列，探尋基因在染色體上的位置，明確基因的結(jié)構(gòu)和功能，解讀人類的全部遺傳信息，人類第一次在分子水平上全面認(rèn)識(shí)自我。在這期間，建立了兩項(xiàng)非常重要的高通量技術(shù)：基因芯片和第二代測(cè)序技術(shù)。這兩種技術(shù)進(jìn)一步結(jié)合，就產(chǎn)生了一種新的解決方案：目標(biāo)序列捕獲測(cè)序技術(shù)。目標(biāo)序列捕獲是指通過某種方法有選擇性的分離或者富集基因組的特定區(qū)域。一種重要的方法是根據(jù)核酸分子堿基互補(bǔ)雜交原理設(shè)計(jì)與目的區(qū)域互補(bǔ)的探針序列，而根據(jù)雜交時(shí)狀態(tài)不同，目標(biāo)序列捕獲可以分為固相雜交法和液相雜交法。液相雜交是通過在溶液中，目標(biāo)DNA片段和已帶有生物素標(biāo)記探針直接雜交，然后通過生物素親和素反應(yīng)使目標(biāo)DNA片段錨定在帶有親和素的微珠上。洗去非目標(biāo)DNA，洗脫后，富集的DNA用于測(cè)序。相較于固相雜交，液相雜交具有操作簡(jiǎn)便、易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。常規(guī)的探針設(shè)計(jì)方式為探針間首尾相連，且不存在重疊部分，這樣做的缺點(diǎn)是在基因文庫中KRAS基因多數(shù)片段只能被單一探針捕獲，且探針交界處的捕獲效果差，造成捕獲效率偏低。同時(shí)，常規(guī)探針設(shè)計(jì)方式對(duì)探針長(zhǎng)度和Tm值無特殊要求，這就導(dǎo)致探針間差異較大，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下絕大多數(shù)探針不能同時(shí)達(dá)到最佳的捕獲效果。本發(fā)明基于CAPP-seq和數(shù)字信號(hào)技術(shù)，設(shè)計(jì)KRAS探針檢測(cè)血液cfDNA中KRAS的變異。當(dāng)測(cè)序深度達(dá)到10000×?xí)r，有效深度可達(dá)5000×，檢測(cè)突變的敏感性達(dá)到0.02％。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種基于高通量測(cè)序檢測(cè)人循環(huán)腫瘤DNAKRAS基因的捕獲探針及試劑盒。本發(fā)明的人循環(huán)腫瘤DNAKRAS捕獲探針是多條探針的混合物，所述多條探針分別能夠捕獲人KRAS基因上不同的目標(biāo)區(qū)域。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多條探針的集合能夠捕獲人循環(huán)腫瘤DNAKRAS基因全部編碼外顯子區(qū)域及外顯子內(nèi)含子交界區(qū)域，減少非特異性捕獲，同時(shí)雜交溫度相近。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供用于人循環(huán)腫瘤DNAKRAS基因變異的高通量測(cè)序檢測(cè)的捕獲探針，所述捕獲探針為多條探針的混合物；所述多條探針能覆蓋全部目標(biāo)區(qū)域；所述多條探針之間存在重疊區(qū)，使得所有目標(biāo)區(qū)域均被兩條以上探針覆蓋；所述多條探針的長(zhǎng)度均為90-130bp；所述多條探針的Tm值在65-75℃之間。本發(fā)明中，目標(biāo)區(qū)域是指包含人KRAS基因上的任何一個(gè)或多個(gè)變異的區(qū)域。本發(fā)明中，全部目標(biāo)區(qū)域優(yōu)選為人KRAS基因全部編碼外顯子區(qū)域及外顯子內(nèi)含子交界區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供用于人循環(huán)腫瘤DNAKRAS基因變異的高通量測(cè)序檢測(cè)的捕獲探針混合物，所述捕獲探針混合物至少包括具有SEQIDNO:1-22所示序列的22條探針。在一些實(shí)施方案中，所述捕獲探針混合物由具有SEQIDNO:1-31所示序列的31條探針組成。在另一些實(shí)施方案中，所述捕獲探針混合物還進(jìn)一步包括一條或更多條具有選自SEQIDNO:23-37的序列的探針。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述捕獲探針混合物為SEQIDNO:1-37所示的37條探針的混合物。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，捕獲探針混合物中包含的探針按相同質(zhì)量比例混合在一起。優(yōu)選地，本發(fā)明的捕獲探針混合物中每條探針均具有標(biāo)記，優(yōu)選為生物素標(biāo)記。本發(fā)明的捕獲探針混合物的工作濃度是0.1PM～6PM，優(yōu)選1.5PM；其中PM＝皮摩爾/升。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供人循環(huán)腫瘤DNAKRAS基因變異檢測(cè)試劑盒，其中包含上述探針混合物。本發(fā)明的人循環(huán)腫瘤DNAKRAS基因變異檢測(cè)試劑盒還可以包含用于人KRAS基因變異的高通量測(cè)序檢測(cè)的任何其它組分。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述人循環(huán)腫瘤DNAKRAS基因變異檢測(cè)試劑盒進(jìn)一步包含選自末端修復(fù)酶混合物、末端修復(fù)反應(yīng)緩沖液、DNA連接酶、連接反應(yīng)緩沖液、含分子標(biāo)簽的接頭、文庫擴(kuò)增引物、PCR預(yù)混液、接頭封閉劑、DNA封閉劑、雜交緩沖液、雜交增強(qiáng)劑、磁珠洗液、雜交洗液、捕獲文庫PCR引物、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照、核酸純化磁珠和鏈霉親合素磁珠的一種或多種試劑。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述人循環(huán)腫瘤DNAKRAS基因變異檢測(cè)試劑盒包含上述全部試劑。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供上述用于人循環(huán)腫瘤DNAKRAS基因變異的高通量測(cè)序檢測(cè)的捕獲探針在制備用于人循環(huán)腫瘤DNAKRAS基因變異的高通量測(cè)序檢測(cè)的試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明針對(duì)當(dāng)前新一代測(cè)序過程中捕獲探針存在的缺陷，采用特殊的設(shè)計(jì)方式在KRAS基因外顯子區(qū)域進(jìn)行探針設(shè)計(jì)，解決了循環(huán)腫瘤DNAKRAS基因外顯子測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較差的問題。本發(fā)明通過增加探針間的重疊區(qū)間，使文庫中KRAS基因每個(gè)區(qū)域存在被兩個(gè)或兩個(gè)以上的捕獲探針捕獲的可能，提高了對(duì)目的片段的捕獲能力。通過限制探針的長(zhǎng)度和Tm值，降低了探針之間的差異性，使絕大多數(shù)探針在特定實(shí)驗(yàn)條件下均處于解鏈和二級(jí)結(jié)構(gòu)充分打開的狀態(tài)，可與目的區(qū)域充分結(jié)合，提高了對(duì)目的區(qū)域捕獲的均一性。本發(fā)明的捕獲探針具有雜交效果好，捕獲效率高，目的區(qū)域測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量好等優(yōu)點(diǎn)。具體實(shí)施方式本文所述的“變異”是指一個(gè)或更多個(gè)核苷酸的插入、取代或缺失。本文所述的“雜交捕獲”是通過互補(bǔ)DNA序列與靶向DNA進(jìn)行雜交，對(duì)待測(cè)核酸進(jìn)行靶向富集的方法。本文所述的“Tm值”是指DNA熔解溫度，指把DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)熱變性過程中紫外吸收值達(dá)到最大值的1/2時(shí)的溫度。本文所述的“新一代測(cè)序技術(shù)”又稱大規(guī)模平行測(cè)序massivelyparallelsequencing(MPS)，是指采用“邊合成邊測(cè)序”的原理、對(duì)于幾十萬到幾百萬DNA分子同時(shí)進(jìn)行平行的測(cè)序反應(yīng)，然后通過生物信息學(xué)分析所得到的原始圖像數(shù)據(jù)或電化學(xué)信號(hào)、最終得到待測(cè)樣品的核酸序列或拷貝數(shù)等信息的測(cè)序技術(shù)，又稱為高通量測(cè)序、深度測(cè)序、二代測(cè)序等。高通量測(cè)序的基本程序是將待測(cè)DNA隨機(jī)打斷成小片段，經(jīng)末端修復(fù)、連接接頭序列、PCR擴(kuò)增等步驟進(jìn)行文庫構(gòu)建，最后使用Illumina，IonTorrent等測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所使用的材料和試劑，如無特殊說明，均可以從商業(yè)途徑獲得。實(shí)施例1：人循環(huán)腫瘤DNAKRAS基因變異檢測(cè)質(zhì)控品的制備1.1.從ATCC購(gòu)買獲得七株常用的可穩(wěn)定傳代人腫瘤細(xì)胞系HOP-62、HCT-15、AGS、NCI-H1573、COR-L23、NCI-H1355及SW1417。用Sanger法對(duì)每個(gè)細(xì)胞系的基因組DNA進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)Sanger法確認(rèn)的雜合和純合變異位點(diǎn)作為陽性對(duì)照位點(diǎn)。經(jīng)驗(yàn)證共含有6個(gè)陽性變異位點(diǎn)。1.2.采用專用培養(yǎng)基培養(yǎng)這七株人腫瘤細(xì)胞系，培養(yǎng)條件：37℃恒溫，5％CO2，濕度50％。培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)培養(yǎng)皿面積80-90％時(shí)傳代，在細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期收集，1500g的速度4℃離心5min取沉淀?xiàng)壣锨濉?.3.使用預(yù)冷PBS溶液重懸，5000rpm速度4℃離心5min，吸棄上清。重復(fù)本步驟一次。1.4.吸棄上清，使用0.1％TritonX-100重懸沉淀，冰上孵育10min，5000rpm速度4℃離心10min。吸棄上清，加入1XMNaseBuffer，重懸沉淀。1.5.吸棄上清，加入1×MNaseBuffer，重懸沉淀。加入1×BSA及MNase，37℃孵育5min。加入EDTA中止酶反應(yīng)。2000g離心1min后取上清使用LifeTechMagMax試劑盒提取，最終將提取的七株人腫瘤細(xì)胞系核酸稀釋至15±1ng/μL，并等比例混合，-20℃保存。實(shí)施例2：人循環(huán)腫瘤DNAKRAS基因變異檢測(cè)試劑盒的制備2.1.設(shè)計(jì)并合成針對(duì)人循環(huán)腫瘤DNAKRAS基因上不同目標(biāo)區(qū)域的多個(gè)捕獲探針，所有捕獲探針的集合能夠覆蓋人KRAS基因全部編碼外顯子區(qū)域及外顯子內(nèi)含子交界區(qū)域；捕獲探針上具有生物素標(biāo)記；所述捕獲探針的序列如序列表中SEQIDNO:1-37所示。2.2.將序列表中SEQIDNO:1-37所示的全部捕獲探針按相同比例混合在一起，并將混合物稀釋為工作濃度1.5PM(PM＝皮摩爾/升)，-20℃保存。2.3.將捕獲探針混合物和實(shí)施例1中獲得的質(zhì)控品分別分裝。2.4.準(zhǔn)備說明書、外包裝，組裝封口。2.5.其中捕獲探針混合物的用量為6μL/3反應(yīng)，12μL/6反應(yīng)，24μL/12反應(yīng)，48μL/24反應(yīng)；質(zhì)控品的用量為5μL/3反應(yīng)，10μL/6反應(yīng)，20μL/12反應(yīng)，40μL/24反應(yīng)。實(shí)施例3：人循環(huán)腫瘤DNAKRAS基因變異的測(cè)序檢測(cè)本實(shí)施例中測(cè)序所使用的儀器為基因序列自動(dòng)分析儀NextSeqCN500。質(zhì)控品的制備方法同實(shí)施例1。3.1.從10例陽性血漿樣本中提取人cfDNA，質(zhì)控品直接使用，無需提取。3.2.文庫構(gòu)建3.2.1.末端修復(fù)0.2mlPCR反應(yīng)管，加入30ng提取后的cfDNA樣本或質(zhì)控品，用LowEDTATE補(bǔ)齊至50μL，震蕩混勻，短暫離心。分別加入1μL末端修復(fù)酶混合物和6μL末端修復(fù)反應(yīng)緩沖液，震蕩混勻短暫離心后在37℃保溫5min，隨后在65℃保溫30min，37℃保溫5min，進(jìn)行末端修復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后取出PCR反應(yīng)管，將產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)移至新的1.5mL離心管中；在每個(gè)離心管中加入108μL核酸純化磁珠，充分混勻后室溫孵育5min。將離心管轉(zhuǎn)移至磁力架上，室溫靜置2min后，小心吸棄上清。加入200μL80％乙醇，室溫靜置30s后，小心吸棄上清，重復(fù)操作一次，確保無液體殘留。將離心管保持在磁力架上，室溫干燥5min。在每個(gè)離心管中分別加入30μLLowEDTATE、18μL緩沖液、1μL修復(fù)酶G3、1μL修復(fù)酶G4，充分混勻后，于20℃孵育20min。取出離心管，分別加入50μLPEGNaCl，吹打混勻后室溫孵育5min。將離心管轉(zhuǎn)移至磁力架上，室溫靜置2min后，小心吸棄上清。加入200μL80％乙醇，室溫靜置30s后，小心吸棄上清。重復(fù)操作一次，確保無液體殘留。將離心管保持在磁力架上，室溫干燥5min。3.2.2.接頭連接向干燥后的離心管中分別單獨(dú)加入5μL接頭，并做好標(biāo)記；分別加入20μLLowEDTATE、3μL接頭緩沖液、2μL連接酶，充分混勻并重懸磁珠后，25℃恒溫孵育15min。加入49.5μLPEGNaCl，充分混勻后室溫孵育5min。將離心管轉(zhuǎn)移至磁力架上靜置2min，小心吸棄上清。加入200μL80％乙醇，室溫靜置30s后，小心吸棄上清，重復(fù)操作一次，確保無液體殘留。將離心管保持在磁力架上，室溫干燥5min。分別加入2μL接頭、30μLLowEDTATE、16μL緩沖液、3μL連接酶，充分混勻并重懸磁珠后，40℃恒溫孵育10min。加入82.5μLPEGNaCl，充分混勻后室溫孵育5min。將離心管轉(zhuǎn)移至磁力架上靜置2min，小心吸棄上清。加入200μL80％乙醇，室溫靜置30s后，小心吸棄上清，重復(fù)操作一次，確保無液體殘留，室溫干燥5min(不可使磁珠過度干燥)。加入20μLLowEDTATE，室溫孵育3min。將離心管轉(zhuǎn)移至磁力架上，靜置2min，小心吸取上清至新的1.5mL離心管中。3.2.3文庫擴(kuò)增與純化分別加入25μLPCR擴(kuò)增酶混合物、5μL引物混合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。向反應(yīng)完成的離心管中，加入1.65倍的PEGNaCl溶液，并吹打混合均勻，室溫孵育。孵育完成后，將離心管置于磁力架上靜置2-3min，待溶液澄清后，吸棄溶液，期間切忌接觸磁珠。在離心管中加入新鮮的80％乙醇200μL，靜置30s后，吸棄乙醇，切勿接觸磁珠，重復(fù)操作一次。吸棄乙醇后，將磁珠晾干至表明呈磨砂狀，切勿使磁珠過干，出現(xiàn)許多裂縫，磁珠晾干后，加入LowEDTATEbuffer20μL，并室溫孵育。孵育完成后，置于磁力架上，靜置2-3min，待溶液澄清后，吸取溶液，轉(zhuǎn)移至新的1.5mLLoBind離心管中。3.3.文庫捕獲3.3.1.雜交幾個(gè)文庫混合在一個(gè)樣品池中進(jìn)行雜交捕獲，將文庫按量混合于1.5mLLoBind離心管中成為一個(gè)樣品池，樣本用量不低于125ng，樣品池總量不超過1μg。向樣品池中加入2μL接頭封閉劑和5μLDNA封閉劑，震蕩混勻，短暫離心后冷凍真空抽干。加入8.5μL雜交緩沖液(2×)、2.7μL雜交增強(qiáng)劑和3.8μLPCR-gradewater，震蕩混勻，短暫離心后，室溫靜置5min重溶。將重溶后的液體全部轉(zhuǎn)移至新的0.2mLPCR反應(yīng)管中，95℃保溫10min。取出PCR反應(yīng)管，短暫離心后加入2μL實(shí)施例2獲得的捕獲探針混合物，震蕩混勻3-5s，短暫離心后在68℃保溫4h以上，熱蓋溫度為78℃。3.3.2.富集取鏈霉親合素磁珠洗滌后加入1倍體積磁珠洗液，振蕩重懸后按每管100μL分裝到不同的0.2mLPCR反應(yīng)管中。將步驟3.3.1中的PCR反應(yīng)管取出，短暫離心后將全部雜交產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至含有鏈霉親和素磁珠的PCR反應(yīng)管中，充分懸浮后于PCR儀上65℃孵育45min，期間每隔12min吸打混勻一次。孵育結(jié)束后，每管加入100μL65℃預(yù)熱的1×洗液Ⅰ，將全部懸液轉(zhuǎn)移至1.5mLLoBind離心管中，震蕩混勻，短暫離心后轉(zhuǎn)移至磁力架上靜置20s，吸棄上清。加入200μL65℃預(yù)熱的1×雜交洗液，震蕩混勻，短暫離心后65℃孵育5min，轉(zhuǎn)移至磁力架上靜置20s，吸棄上清。重復(fù)本步驟一次。再用磁珠洗液充分洗脫后加入18μLNuclease-freewater，震蕩重懸后全部轉(zhuǎn)移至0.2mLPCR反應(yīng)管中備用。3.3.3.捕獲文庫擴(kuò)增與純化向上述PCR反應(yīng)管中分別加入25μL2×PCR預(yù)混液和捕獲文庫PCR引物各2.5μL，充分混勻短暫離心后按下述程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95℃3min；10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為98℃20s，60℃30s，72℃30s；72℃1min；4℃保存?zhèn)溆?。將PCR反應(yīng)管短暫離心后，將產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中。加入75μL核酸純化磁珠，震蕩混勻，室溫靜置10min后短暫離心，轉(zhuǎn)移至磁力架上靜置1min，吸棄上清。加入200μL80％乙醇，靜置30s后，吸棄上清。重復(fù)洗滌一次，開蓋晾干至無液滴殘留。加入21.6μLNuclease-freewater震蕩重懸磁珠，室溫靜置5min，轉(zhuǎn)移至磁力架上靜置1min，取20μL上清至新的1.5mLLoBind離心管中備用。取2μL捕獲文庫或捕獲的質(zhì)控品DNA進(jìn)行定量(使用Qubit熒光定量?jī)x)。3.4.測(cè)序及數(shù)據(jù)分析3.4.1.測(cè)序按照測(cè)序儀器及配套試劑使用說明進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。平均有效覆蓋深度≥5000×。3.4.2.數(shù)據(jù)分析獲得原始測(cè)序數(shù)據(jù)后，與參比數(shù)據(jù)庫比對(duì)，進(jìn)行變異分析和解讀。檢測(cè)結(jié)果如下：臨床樣本的突變位點(diǎn)及檢測(cè)結(jié)果如表1所示。臨床樣本檢測(cè)符合率：10/10＝100％。所有臨床樣本經(jīng)數(shù)字PCR法驗(yàn)證無誤。表1臨床樣本突變位點(diǎn)及檢測(cè)結(jié)果質(zhì)控品的變異位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果如表2所示，其中參考突變頻率為根據(jù)混合比例以及經(jīng)數(shù)字PCR法測(cè)定的變異頻率計(jì)算獲得的理論檢測(cè)值為高通量測(cè)序?qū)嶒?yàn)檢測(cè)結(jié)果。表2質(zhì)控品變異位點(diǎn)及檢測(cè)結(jié)果No.基因cDNA變異信息蛋白變異信息參考頻率檢測(cè)結(jié)果1KRASc.34G>Tp.G12S1.00％0.98％2KRASc.35G>Ap.G12D1.00％0.99％3KRASc.35G>Cp.G12A1.00％0.99％4KRASc.35G>Tp.G12V1.00％1.03％5KRASc.37G>Tp.G13C1.00％1.01％6KRASc.38G>Ap.G13D1.00％0.98％由表2的結(jié)果可見，質(zhì)控品中變異位點(diǎn)檢測(cè)符合率為100％。實(shí)施例4：可重復(fù)性實(shí)驗(yàn)按照實(shí)施例1的制備方法制備質(zhì)控品K-P2，與實(shí)施例1的不同之處在于七株細(xì)胞系DNA等比例混合制備而成。使用質(zhì)控品K-P2按照實(shí)施例2的制備方法生產(chǎn)三批試劑盒，批號(hào)分別為20160314，20160315，20160316。按照實(shí)施例3的檢測(cè)方法進(jìn)行高通量測(cè)序檢測(cè)。同一批次試劑盒20160316，檢測(cè)K-P2三次，檢測(cè)結(jié)果見表3。不同批次試劑盒20160314，20160315，20160316，檢測(cè)K-P2各三次，檢測(cè)結(jié)果見表4。表3批內(nèi)差異批號(hào)樣本名稱陽性變異符合率20160316K-P2100％(6/6)20160316K-P2100％(6/6)20160316K-P2100％(6/6)表4批間差異批號(hào)樣本名稱陽性變異符合率20160314K-P2100％(6/6)20160315K-P2100％(6/6)20160316K-P2100％(6/6)檢測(cè)結(jié)果：試劑盒可重復(fù)性滿足要求。實(shí)施例5：探針對(duì)比測(cè)試的性能分析指標(biāo)分別使用常規(guī)捕獲探針和實(shí)施例2的捕獲探針，按照與實(shí)施例3相同的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作。其中常規(guī)捕獲探針為18條探針的混合物，其中所包含的18條探針首尾相接覆蓋KRAS的全部目標(biāo)區(qū)域，每條探針長(zhǎng)度隨機(jī)，Tm值無限制，所有探針均具有生物素標(biāo)記。經(jīng)過測(cè)序和數(shù)據(jù)分析，兩種探針的性能指標(biāo)比較如表5和表6所示。表5常規(guī)捕獲探針性能指標(biāo)驗(yàn)證分析樣本重復(fù)率(％)目標(biāo)區(qū)占比(％)目標(biāo)區(qū)邊緣占比(％)非目標(biāo)區(qū)占比(％)10.1839.284.0956.6320.1442.284.6453.0830.158.921.2189.8740.1740.675.1254.2150.148.401.1790.4360.1648.835.2345.9370.1245.555.7748.6880.2442.925.9051.1790.2139.415.8354.77100.2143.026.3450.65均值0.1735.934.5359.54表6實(shí)施例2探針性能指標(biāo)驗(yàn)證分析樣本重復(fù)率(％)目標(biāo)區(qū)占比(％)目標(biāo)區(qū)邊緣占比(％)非目標(biāo)區(qū)占比(％)10.1368.9719.9011.1320.1279.198.4712.3430.1468.319.4322.2640.2378.4911.859.6750.1974.5012.0113.4860.0976.4012.1811.4170.1169.8817.2712.8580.1071.6217.4210.9690.1469.0817.5613.36100.1969.3419.3311.32均值0.1472.5814.5412.88其中重復(fù)率：測(cè)序重復(fù)的數(shù)據(jù)量與測(cè)序得到的總數(shù)據(jù)量之比；目標(biāo)區(qū)占比：目標(biāo)區(qū)域測(cè)序測(cè)得的數(shù)據(jù)量與測(cè)序得到的總數(shù)據(jù)量之比；目標(biāo)區(qū)邊緣占比：目標(biāo)區(qū)邊緣區(qū)域測(cè)得的數(shù)據(jù)量與測(cè)序得到的總數(shù)據(jù)量之比；非目標(biāo)區(qū)占比：非目標(biāo)區(qū)域測(cè)得的數(shù)據(jù)量與測(cè)序得到的總數(shù)據(jù)量之比。實(shí)施例6：利用22條探針組合對(duì)人循環(huán)腫瘤DNAKRAS基因變異進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)將序列表中SEQIDNO:1-22所示的捕獲探針按相同比例混合在一起，并將混合物稀釋為工作濃度1.5PM(PM＝皮摩爾/升)，-20℃保存。上述22條捕獲探針混合物的用量為6μL/3反應(yīng)，12μL/6反應(yīng)，24μL/12反應(yīng)，48μL/24反應(yīng)。對(duì)人循環(huán)腫瘤DNAKRAS基因變異進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)，步驟與實(shí)施例3相同，除了在文庫捕獲步驟中使用上述制備的22條捕獲探針混合物。檢測(cè)結(jié)果如下：臨床樣本的突變位點(diǎn)及檢測(cè)結(jié)果如表7所示。臨床樣本檢測(cè)符合率：10/10＝100％。所有臨床樣本經(jīng)數(shù)字PCR法驗(yàn)證無誤。表722條探針組合臨床樣本檢測(cè)結(jié)果樣本編號(hào)基因名稱轉(zhuǎn)錄本外顯子或內(nèi)含子cDNA變異信息蛋白質(zhì)變異信息檢測(cè)結(jié)果1KRASNM_00498518c.35G>Ap.G12D3.14％，陽性2KRASNM_00498519c.35G>Cp.G12A1.78％，陽性3KRASNM_00498519c.35G>Tp.G12V5.3‰，陽性4KRASNM_00498519c.34G>Ap.G12S2.7‰，陽性5KRASNM_00498519c.34G>Cp.G12R1.62％，陽性6KRASNM_00498519c.34G>Tp.G12C1.19％，陽性7KRASNM_00498519c.38G>Ap.G13D3.9‰，陽性8KRASNM_00498519c.183A>Tp.Q61H3.27％，陽性9KRASNM_00498519c.182A>Cp.Q61A1.9‰，陽性10KRASNM_00498519c.182A>Tp.Q61L6.08％，陽性利用實(shí)施例5中所述的常規(guī)捕獲探針與本實(shí)施例的22條探針在65℃雜交條件下進(jìn)行捕獲，對(duì)比捕獲后核酸得率如下表8所示：表8捕獲核酸得率比較樣本編號(hào)常規(guī)捕獲探針本實(shí)施例的22條探針10.09％1.78％20.12％1.93％30.97‰1.36％40.82％2.28％50.23％1.43％60.06‰1.02％70.38％2.59％80.41‰1.77％91.72％3.01％100.68％2.36％注：樣本捕獲總量1μg；理想得率在1％-4％之間。實(shí)施例7：利用31條探針組合對(duì)人循環(huán)腫瘤DNAKRAS基因變異進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)將序列表中SEQIDNO:1-31所示的捕獲探針按相同比例混合在一起，并將混合物稀釋為工作濃度1.5PM(PM＝皮摩爾/升)，-20℃保存。上述31條捕獲探針混合物的用量為6μL/3反應(yīng)，12μL/6反應(yīng)，24μL/12反應(yīng)，48μL/24反應(yīng)。對(duì)人循環(huán)腫瘤DNAKRAS基因變異進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)，步驟與實(shí)施例3相同，除了在文庫捕獲步驟中使用上述制備的31條捕獲探針混合物。檢測(cè)結(jié)果如下：臨床樣本的突變位點(diǎn)及檢測(cè)結(jié)果如表9所示。臨床樣本檢測(cè)符合率：10/10＝100％。所有臨床樣本經(jīng)數(shù)字PCR法驗(yàn)證無誤。表931條探針組合臨床樣本檢測(cè)結(jié)果樣本編號(hào)基因名稱轉(zhuǎn)錄本外顯子或內(nèi)含子cDNA變異信息蛋白質(zhì)變異信息檢測(cè)結(jié)果1KRASNM_00498518c.35G>Ap.G12D3.79％，陽性2KRASNM_00498519c.35G>Cp.G12A1.92％，陽性3KRASNM_00498519c.35G>Tp.G12V5.6‰，陽性4KRASNM_00498519c.34G>Ap.G12S2.9‰，陽性5KRASNM_00498519c.34G>Cp.G12R2.12％，陽性6KRASNM_00498519c.34G>Tp.G12C1.16％，陽性7KRASNM_00498519c.38G>Ap.G13D5.8‰，陽性8KRASNM_00498519c.183A>Tp.Q61H4.57％，陽性9KRASNM_00498519c.182A>Cp.Q61A3.8‰，陽性10KRASNM_00498519c.182A>Tp.Q61L6.84％，陽性利用實(shí)施例5中所述的常規(guī)捕獲探針與本實(shí)施例的31條探針在65℃雜交條件下進(jìn)行捕獲，對(duì)比捕獲后核酸得率如下表10所示：表10捕獲核酸得率比較樣本編號(hào)常規(guī)捕獲探針本實(shí)施例的31條探針10.39％1.81％20.18％2.43％30.72‰1.28％40.91％2.57％50.34％1.25％60.06‰1.20％70.29％2.03％84.58‰2.66％91.69％3.13％101.07％2.94％注：樣本捕獲總量1μg；理想得率在1％-4％之間。<110>埃提斯生物技術(shù)（上海）有限公司<120>高通量測(cè)序檢測(cè)人循環(huán)腫瘤DNAKRAS基因的捕獲探針及試劑盒<130>2016<160>37<170>PatentInversion3.5<210>1<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>1aacagtctgcatggagcaggaaaaaaattaggtaatgctaaaacaaatgctaataattta60gtgtaatgtacaaaaattaccacttgtactagtatgccttaagaaaaaagtacaaattgt120<210>2<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>2gtgtaatgtacaaaaattaccacttgtactagtatgccttaagaaaaaagtacaaattgt60atttacataattacacactttgtctttgacttctttttcttctttttaccatctttgctc120<210>3<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>3atttacataattacacactttgtctttgacttctttttcttctttttaccatctttgctc60atcttttctttatgttttcgaatttctcgaactaatgtatagaaggcatcatcaacaccc120<210>4<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>4atcttttctttatgttttcgaatttctcgaactaatgtatagaaggcatcatcaacaccc60tgaaatacataaaaagtattaaaatgtgaatatatacgatggcttcatgtgtacaggtaa120<210>5<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>5tgaaatacataaaaagtattaaaatgtgaatatatacgatggcttcatgtgtacaggtaa60caaatttcattaatggaaaaaatattaagaaaggattctttatgtttctcttcaggcaac120<210>6<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>6ttttaatacttcaagttagaatactacacctaagtagttctaaagtggttgccaccttgt60tacctttaaaagacatctgctttctgccaaaattaatgtgctgaacttaaacttaccaga120<210>7<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>7tacctttaaaagacatctgctttctgccaaaattaatgtgctgaacttaaacttaccaga60ttacattataatgcattttttaattttcacacagccaggagtcttttcttctttgctgat120<210>8<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>8ttacattataatgcattttttaattttcacacagccaggagtcttttcttctttgctgat60ttttttcaatctgtattgtcggatctccctcaccaatgtataaaaagcatcctccactct120<210>9<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>9ttttttcaatctgtattgtcggatctccctcaccaatgtataaaaagcatcctccactct60ctgcattgtaaaacacaacttctttaaagtctgttgcattggtaagagtaatttactggg120<210>10<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>10ctgcattgtaaaacacaacttctttaaagtctgttgcattggtaagagtaatttactggg60aaagccatgtgcaagaagtttgagattatgagcttgagatttttttttttttaaacagac120<210>11<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>11acaaaaacatttactaaatattgttttatttcctagtatagcataattgagagaaaaact60gatatattaaatgacataacagttatgattttgcagaaaacagatctgtatttatttcag120<210>12<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>12gatatattaaatgacataacagttatgattttgcagaaaacagatctgtatttatttcag60tgttacttacctgtcttgtctttgctgatgtttcaataaaaggaattccataacttcttg120<210>13<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>13tgttacttacctgtcttgtctttgctgatgtttcaataaaaggaattccataacttcttg60ctaagtcctgagcctgttttgtgtctactgttctagaaggcaaatcacatttatttccta120<210>14<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>14ctaagtcctgagcctgttttgtgtctactgttctagaaggcaaatcacatttatttccta60ctaggaccataggtacatcttcagagtccttaactcttttaatttgttctctgggaaaga120<210>15<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>15ctaggaccataggtacatcttcagagtccttaactcttttaatttgttctctgggaaaga60aaaaaaagttatagcacagtcattagtaacacaaatatctttcaaaacctgtccacaact120<210>16<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>16aaaaaaagttatagcacagtcattagtaacacaaatatctttcaaaacctgtccacaact60tttgtcataaaatttggctgaaagaaaacaatgtaattcctagtttccactacaccaaat120<210>17<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>17tatgcatggcattagcaaagactcaaaaaataaaaactataattactccttaatgtcagc60ttattatattcaatttaaacccacctataatggtgaatatcttcaaatgatttagtatta120<210>18<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>18gcttattatattcaatttaaacccacctataatggtgaatatcttcaaatgatttagtat60tatttatggcaaatacacaaagaaagccctccccagtcctcatgtactggtccctcattg120<210>19<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>19attatttatggcaaatacacaaagaaagccctccccagtcctcatgtactggtccctcat60tgcactgtactcctcttgacctgctgtgtcgagaatatccaagagacaggtttctccatc120<210>20<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>20attgcactgtactcctcttgacctgctgtgtcgagaatatccaagagacaggtttctcca60tcaattactacttgcttcctgtaggaatcctgagaagggagaaacacagtctggattatt120<210>21<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>21catcaattactacttgcttcctgtaggaatcctgagaagggagaaacacagtctggatta60ttacagtgcaccttttacttcaaaaaaggtgttatatacaactcaacaacaaaaaatt118<210>22<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>22cagataacttaactttcagcataattatcttgtaataagtactcatgaaaatggtcagag60aaacctttatctgtatcaaagaatggtcctgcaccagtaatatgcatattaaaacaagat120<210>23<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>23aaacctttatctgtatcaaagaatggtcctgcaccagtaatatgcatattaaaacaagat60ttacctctattgttggatcatattcgtccacaaaatgattctgaattagctgtatcgtca120<210>24<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>24ttacctctattgttggatcatattcgtccacaaaatgattctgaattagctgtatcgtca60aggcactcttgcctacgccaccagctccaactaccacaagtttatattcagtcattttca120<210>25<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>25aggcactcttgcctacgccaccagctccaactaccacaagtttatattcagtcattttca60gcaggccttataataaaaataatgaaaatgtgactatattagaacatgtcacacataagg120<210>26<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>26gcaggccttataataaaaataatgaaaatgtgactatattagaacatgtcacacataagg60ttaatacactatcaaatactccaccagtaccttttaatacaaactcacctttatatgaaa120<210>27<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>27agtaacattttaaatttatcaaaaggattgtttttatttttattttaaagcattattaaa60tatggatcagacttgaaaagtgtttatgcaatgttaatttaaccagtgttaagagaacta120<210>28<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>28gccaaacctagagattgtaaaactttttcacttcattgtttaaaaaaaaaattaatgtct60tggcacaccaccaccccaaaatctcaacttttgagttaatatttaaaagtaatttttaaa120<210>29<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>29aaagagtttgttttcttaagaaacaaaagcaatgctcttgatttgtcagcaggaccacca60cagagtgagattgtatcttgttgagctatccaaactgccctagtccctccccattttgac120<210>30<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>30taaccaatgcatgacaacactggatgaccgtggggacacagtccatgctgtgaaactctc60tatgaaagctcaaaggttcacacagggcctggccttgcaaccttggtctcttcaacacct120<210>31<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>31aataagctataactggcccaaataatcttttaatgtcacaagcagaattaaaactatctt60caaagactcaagttgaagaaaagatttaaagttatactatgaaagagcagtctgacacag120<210>32<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>32ggagactacatttaattcctatgagaattttttatacttgttaaaatcttttcaattatt60ataaaaatttagtagcatgtaaatatagccccaaaatggttgctataataatccccattt120<210>33<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>33ctcacaaacatatattctcatgactacttgcatggaccagcccttccaccactccagaaa60cacacactaattggtgttatgttttagcagcactggggataccaccatcacagaatttgc120<210>34<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>34ctttttatagaaaaaatataatattttggggagagtgaccatgactaatagcagtggaaa60ggagacaaaacctttgtgaacagtgtaactttacattcatcagggatgacaaactatagg120<210>35<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>35acatgatgcctagaagaatcatcatcaggaagcccataaatttgtgttccctcaatgttt60cagtaaaaaccaattagaaggtctcaactgaaattagtaattaatccatttatgtgacta120<210>36<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>36gataaaacacagaatagggatgattcaaaagcttcattaatttgtttcacaccaacattc60acaattggtaagaaaaataagaagtaatcaactgcatgcaccaaaagccccaagacagaa120<210>37<211>120<212>DNA<213>人工序列<400>37atcttaggtattcagtttctttttcacaggcattgctagttcaaaaaccaaaactctggg60aatactggcacttagaggaaaaaaaaacttccactgtcattttaaaataagcatttaagg120當(dāng)前第1頁1 2 3