本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及利用間斷藍光誘導(dǎo)調(diào)控綠藻連續(xù)光合放氫的基因開關(guān)系統(tǒng)及其在綠藻制氫轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

氫氣作為世界上最清潔的能源，是唯一能真正做到“零排放”的可再生能源。目前氫能的制備主要有三個來源：一是以煤炭、石油、天然氣等碳氫化合物為原料制氫；二是利用電解水制備氫能；三是利用生物來制備氫能。由于煤炭、石油、天然氣等資源逐漸枯竭，而電解水制氫需要消耗大量能源，因此生物制氫技術(shù)成為最具發(fā)展前景的制氫途徑[Tumer J A.Sustainable hydrogen production.Science,2004,305:972-974.]。生物制氫研究始于十九世紀，最早在細菌和藍藻中發(fā)現(xiàn)生物產(chǎn)氫的現(xiàn)象[Stephenson M，Stickland L H.Hydrogenase：a bacterial enzyme activating molecular hydrogen.Biochemistry Journal,1931,25:205-214.]。在1939年，Gafforn及其合作者首次發(fā)現(xiàn)柵藻利用其可逆氫酶能在光照條件下通過光合作用分解水產(chǎn)生的電子和氫離子合成氫氣[Gaffron H.Reduction of carbon dioxide with molecular hydrogen in green algae.Nature,1939,143:204-205]。隨后在許多綠藻(如萊茵衣藻、小球藻等)均發(fā)現(xiàn)光合放氫現(xiàn)象。由于這些綠藻能通過光合作用從自然界最豐富的資源(光和水)中獲得氫能，而且綠藻中氫酶的活性高達藍藻和光合細菌氫酶活性的100倍以上，綠藻產(chǎn)氫效率可以達到利用化石燃料等傳統(tǒng)制氫技術(shù)的四倍以上，國際能源組織(IEA)在1998年的評估報告中，將綠藻光合制氫稱為最具有應(yīng)用前景的生物制氫技術(shù)[Carolyn CE.Annual Report of IEA,1998:15-31.]。

盡管綠藻光合制氫具有非常遠大的應(yīng)用前景，以美國能源部ASP項目(Aquatic Species Program)為代表的眾多國際科研計劃對藻類產(chǎn)氫進行了大量研究，但最后發(fā)現(xiàn)：綠藻光合放氫的機制主要是由綠藻氫酶介導(dǎo),而綠藻氫酶活性受到光合放氧的抑制,只有將綠藻細胞氧氣含量降低或者將產(chǎn)氧與產(chǎn)氫兩個過程從空間或時間隔離，才能達到使綠藻細胞持續(xù)進行光合產(chǎn)氫的目標。這嚴重制約了綠藻光合制氫產(chǎn)業(yè)的發(fā)展前景。如何讓綠藻細胞能夠持續(xù)光合放氫？這是長期以來一直制約綠藻光合制氫技術(shù)發(fā)展的理論瓶頸問題。

美國國家可再生能源實驗室(NREL)和加州大學(xué)伯克利分校的Melis小組于2000年在缺硫條件下培養(yǎng)萊茵衣藻時，發(fā)現(xiàn)光合放氧速率發(fā)生可逆下降現(xiàn)象，但線粒體的呼吸耗氧卻不受影響，使封閉的萊茵衣藻生物反應(yīng)器中的藻細胞處于厭氧環(huán)境，解除了衣藻光合放氧對氫酶的抑制作用，從而使持續(xù)放氫時間達到70小時以上，萊茵衣藻的放氫效率大大提高【Melis A,Zhang L,Forestier M et al.Sustained photobiological hydrogen gas production upon reversible inactivation of oxygen evolution in the green algal Chlamydomonas reinhardtii.Plant Physiol.2000(22):127-135.】。進一步研究表明：當(dāng)萊茵衣藻在缺硫條件下培養(yǎng)時，其藻細胞光合系統(tǒng)II(PSII)的活性受到抑制，進一步誘導(dǎo)呼吸耗氧，從而解除氧對綠藻氫酶的抑制，實現(xiàn)綠藻持續(xù)放氫過程?；诰G藻能在缺硫環(huán)境下持續(xù)放氫的理論，目前國際上設(shè)計出的綠藻光合制氫生物反應(yīng)器均是使用兩步交替法制氫，即在有硫培養(yǎng)基中生長，在去硫培養(yǎng)基中放氫，這樣交替更換培養(yǎng)基來達到持續(xù)產(chǎn)氫的目的。然而，由于藻與培養(yǎng)基分離困難，將藻固定化后其生長和放氫能力又會大大下降，所以這種制氫途徑?jīng)]有產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。

能否在不改變培養(yǎng)基的條件下讓綠藻持續(xù)產(chǎn)氫？本專利發(fā)明人通過熱激誘導(dǎo)人工microRNA調(diào)控PSII蛋白OEE2基因表達的途徑，獲得了能持續(xù)產(chǎn)氫的藻株[Hui Li,Li Zhang,Longfei Shu,Xiaoshan Zhuang,Yanmei Liu,Jun Chen,Zhangli Hu*.Sustainable photosynthetic H2-production mediated by artificial miRNA silencing of OEE2gene in green alga Chlamydomonas reinhardtii，International Journal of Hydrogen Energy 40(2015):5609-5616.]。但熱激對藻細胞有損害作用，嚴重制約了綠藻的產(chǎn)氫效率。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明是針對綠藻持續(xù)放氫的理論問題，發(fā)明一種利用間斷藍光誘導(dǎo)調(diào)控綠藻連續(xù)光合放氫的基因開關(guān)系統(tǒng),并利用該系統(tǒng)構(gòu)建能夠連續(xù)光合制氫的綠藻轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器。

本發(fā)明的目的在于：(1)發(fā)明一種藍光誘導(dǎo)綠藻持續(xù)放氫的光控基因開關(guān)系統(tǒng),并將該系統(tǒng)應(yīng)用于綠藻連續(xù)光合制氫轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器的構(gòu)建。本發(fā)明提供了光控基因開關(guān)各組件的基因序列與結(jié)構(gòu)、各組件轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)基因藻的方法、綠藻光控基因開關(guān)系統(tǒng)的工作途徑與具體應(yīng)用。具體包括以下內(nèi)容：

(1)一種誘導(dǎo)綠藻持續(xù)放氫的光控基因開關(guān)系統(tǒng)，該系統(tǒng)的元件包括光受體隱花色素CRY2基因及其相互作用蛋白CIB1基因、GAL4轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和具有轉(zhuǎn)錄激活活性單純皰疹病毒的激活域VP16、UAS轉(zhuǎn)錄激活序列、特異性靶向PSII復(fù)合體基因的miRNAs，其中CRY2與BD、CIB1與VP16及核定位序列NLS、UAS與miRNAs基因序列分別融合，并通過遺傳轉(zhuǎn)化整合到綠藻基因組。

(2)轉(zhuǎn)基因綠藻持續(xù)放氫的光控基因開關(guān)系統(tǒng)的工作途徑：正常光照下，藻細胞表達的CRY2-BD融合蛋白通過BD結(jié)構(gòu)域與轉(zhuǎn)基因藻核基因組DNA的UAS序列結(jié)合(CRY2-BD-UAS-miRNAs)，而表達的CIB1-VP16融合蛋白則游離于核質(zhì)中。由于綠藻氫酶受光合放氧抑制，正常情況綠藻只能持續(xù)幾十秒放氫時間；當(dāng)藍光照射時，CRY2與CIB1發(fā)生相互作用，使游離于核質(zhì)中的CIB1-VP16也結(jié)合在UAS上(CIB1-VP16-CRY2-BD-UAS-miRNAs),從而使具有轉(zhuǎn)錄激活活性單純皰疹病毒的激活域VP16與UAS啟動子序列發(fā)生相互作用，誘導(dǎo)其下游的miRNAs過表達，靶向抑制PSII核心蛋白基因表達，使綠藻PSII活性下調(diào)，藻細胞氧分壓下降而使藻細胞放氫；持續(xù)一段時間后，為了保證藻細胞的生長和[H⁺]與電子的供應(yīng),停止藍光照射，藻細胞miRNAs表達停止，使綠藻PSII恢復(fù)活性，藻細胞恢復(fù)正常生理活動。通過連續(xù)間斷藍光誘導(dǎo)，始終控制藻細胞內(nèi)氧分壓而保持氫酶活性，從而達到藻細胞能夠連續(xù)放氫。

(3)本發(fā)明的誘導(dǎo)綠藻持續(xù)放氫的光控基因開關(guān)系統(tǒng)中miRNA的序列，可以是1個或多個，從而達到控制PSII復(fù)合體1個或多個靶向蛋白活性的目的。所述miRNAs包括靶向目標基因的人工miRNA或內(nèi)源miRNA。

(4)一種誘導(dǎo)綠藻持續(xù)放氫的光控基因開關(guān)系統(tǒng)，誘導(dǎo)調(diào)控的方式包括藍光與紅光、白光與紅光、藍光與黑暗等交替照射或通過自動設(shè)置的連續(xù)間斷藍光照射途徑，其藍光、紅光、白光照射及黑暗時間可根據(jù)藻細胞放氫特性及放氫效率進行設(shè)置。

(5)一種誘導(dǎo)綠藻持續(xù)放氫的光控基因開關(guān)系統(tǒng)，其綠藻為以萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)為代表的真核綠藻，該系統(tǒng)可以在生物制氫技術(shù)開發(fā)與裝置研制中的應(yīng)用。

本發(fā)明專利的有益效果包括：

(1)目前使用“兩步法”綠藻連續(xù)光合制氫技術(shù)，需要間斷更換藻細胞的正常培養(yǎng)基和缺硫培養(yǎng)基。由于藻液分離困難，嚴重制約該技術(shù)發(fā)展。本專利在不更換培養(yǎng)基的前提下，只需要間斷藍光照射，就可以達到綠藻連續(xù)放氫的目標。操作方便，適宜規(guī)?；G藻光合制氫。

(2)本發(fā)明專利使用miRNA調(diào)控途徑，可以同時對影響綠藻光合制氫的多個基因進行同時調(diào)控，調(diào)控效率高；同時由于miRNA對藍光誘導(dǎo)反應(yīng)時間短，可逆反應(yīng)時間只需幾分鐘，可以實現(xiàn)綠藻細胞連續(xù)高效光合放氫。

(3)藍光誘導(dǎo)連續(xù)光合放氫解決了熱激或強光等誘導(dǎo)因素本身對綠藻細胞的傷害，延長了藻細胞光合放氫的周期，具有明顯的優(yōu)勢。

附圖說明

圖1為萊茵衣藻持續(xù)放氫光控基因開關(guān)系統(tǒng)的表達載體結(jié)構(gòu)示意圖；ble和Hyg分別代表博來霉素zeocin和潮霉素Hygromycin的抗性篩選標記基因。

圖2為具有持續(xù)放氫光控基因開關(guān)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因藻株的篩選示意圖；用amiRNA前體引物進行PCR驗證，條帶大小正確的切膠后測序驗證。

圖3為amiRNA-D1影響產(chǎn)氫的效率分析示意圖；縱坐標為產(chǎn)氫效率，單位為微升氫氣每毫克葉綠素。雙星號表示兩藻株產(chǎn)氫效率有極顯著差異。

圖4為轉(zhuǎn)基因藻株產(chǎn)氫效率分析示意圖；利用氣象色譜法檢測藻液的產(chǎn)氫量。上一組為表達了靶向D1蛋白編碼基因的人工miRNA的轉(zhuǎn)化子，下一組為對照組的CC-849。轉(zhuǎn)化子amiR-D1和對照組CC-849都做了三個獨立的重復(fù)?？v坐標為藍光處理時間。虛線為產(chǎn)氫量平均值曲線。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體的實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步介紹：

實施例1基于人工mcroRNA調(diào)控萊茵衣藻D1蛋白的持續(xù)放氫光控基因開關(guān)系統(tǒng)的主要元件

設(shè)計靶向萊茵衣藻PSII復(fù)合體的核心蛋白D1的人工mcroRNA，通過藍光誘導(dǎo)調(diào)控這些人工mcroRNA的表達，調(diào)節(jié)D1蛋白的生物學(xué)活性，進而調(diào)控光解水反應(yīng)進程，控制藻細胞內(nèi)氧分壓在較低的水平，從而使萊茵衣藻氫酶維持較高的活性而持續(xù)光合放氫。

該系統(tǒng)的主要組件包括：GAL4DNA binding domain(GAL4 BD)，VP16，upstream activating sequence(UAS)，CRY2，CIB1，5’PsaD，3’PsaD和amiRNA。amiRNA是指靶向D1蛋白設(shè)計的人工mcroRNA序列，將該序列替換掉高豐度表達的天然miRNA1162前體中的成熟RNA序列，可獲得用于構(gòu)建載體及轉(zhuǎn)化的人工miRNA前體序列。GAL4 DNA binding domain是酵母轉(zhuǎn)錄激活蛋白GAL4的DNA結(jié)合域，VP16是具有轉(zhuǎn)錄激活活性單純皰疹病毒的激活域，UAS是能與GAL4 DNA binding domain結(jié)合的上游激活DNA序列，CRY2是擬南芥的藍光受體蛋白隱花色素(cryptochrome)，CIB1是擬南芥的藍光受體互作蛋白。5’PsaD是PsaD基因編碼區(qū)之前的5’序列，是用于組成型啟動GAL4DNA binding domain-CIB1和VP16-CRY2兩個融合蛋白表達的啟動子序列。3’PsaD是PsaD對應(yīng)的3’區(qū)序列，對于外源序列的組成型高表達有重要作用。

GAL4 DNA binding domain序列是以酵母單雜交所使用的質(zhì)粒pGBKT7的DNA為模板，使用高保真酶經(jīng)由PCR擴增獲得。VP16序列和UAS序列是通過基因全序列合成獲得。CIB1和CRY2序列是以擬南芥的基因組DNA為模板，使用高保真酶經(jīng)由PCR擴增獲得。5’PsaD和3’PsaD序列是以萊茵衣藻的基因組DNA為模板，使用高保真酶經(jīng)由PCR擴增獲得。人工miRNA前體序列是通過基因全序列合成獲得。

實施例2構(gòu)建萊茵衣藻持續(xù)放氫光控基因開關(guān)系統(tǒng)的表達載體利用pBluescript SK載體的基礎(chǔ)上，將萊茵衣藻持續(xù)放氫光控基因開關(guān)系統(tǒng)的主要元件組裝到兩個表達載體pBD-CIB1-Ble和pVP16-CRY2-UAS-amiRNA-Hyg。具體構(gòu)建示意圖如圖1所示。

實施例3遺傳轉(zhuǎn)化及藍光誘導(dǎo)持續(xù)光合產(chǎn)氫轉(zhuǎn)基因藻的篩選

本實施例所選用的轉(zhuǎn)基因受體為萊茵衣藻CC-849(購自美國Duke大學(xué)衣藻遺傳中心，Durham，NC27708USA)。該藻株為細胞壁缺陷型品系。

本次轉(zhuǎn)化選用了“珠磨法”。將萊茵衣藻在連續(xù)光照和TAP培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對數(shù)期，細胞數(shù)約為1～2×10⁶細胞/ml。5000轉(zhuǎn)/分鐘室溫離心5分鐘，收集藻細胞；用無菌的新鮮TAP培養(yǎng)液重懸藻細胞沉淀，調(diào)整細胞濃度至2×10⁸細胞/ml；吸取300μl藻細胞懸浮液到1.5ml離心管里(內(nèi)含無菌的0.3mm直徑玻璃珠)，分別加入1μg酶切成線狀的載體DNA；把衣藻細胞/玻璃珠/外源DNA混合物在振蕩器上以最高速振蕩25秒；把混合液轉(zhuǎn)移到含有10ml新鮮TAP培養(yǎng)基的離心管中，在100轉(zhuǎn)/分鐘搖床弱光下22℃培養(yǎng)20小時；3000轉(zhuǎn)/分鐘室溫離心5分鐘，收集細胞，棄上清；用500μl新鮮TAP培養(yǎng)液輕柔重懸細胞，加入3.5ml，40℃，0.5％瓊脂的TAP培養(yǎng)基，混勻后均勻鋪在含有10μg/ml的抗性固體平板上。置于22℃光照培養(yǎng)箱里倒置培養(yǎng)，直至長出綠色的單克隆。

首先，通過“珠磨法”將pBD-CIB1-Ble載體轉(zhuǎn)入萊茵衣藻CC-849，通過zeocin抗性篩選得到綠色克隆后，通過轉(zhuǎn)化子基因組DNA的PCR鑒定和PCR產(chǎn)物的測序得到真正的陽性克隆。以轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板的PCR分別擴增了GAL4BD和CIB1的全長序列，并對產(chǎn)物條帶進行了測序比對。

然后，在pBD-CIB1-Ble陽性藻株中再次通過“珠磨法”轉(zhuǎn)入pVP16-CRY2-UAS-amiRNA-Hyg載體，通過Hygromycin B抗性篩選得到綠色克隆，再次通過轉(zhuǎn)化子基因組DNA的PCR鑒定和PCR產(chǎn)物的測序得到同時含有BD-CIB1和VP16-CRY2-UAS-miRNA的陽性克隆。以轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板的PCR分別擴增了VP16，CRY2和miRNA前體的全長序列，并對產(chǎn)物條帶進行了測序比對。該zeocin和Hygromycin B雙抗性藻株即為具有持續(xù)放氫光控基因開關(guān)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因藻株。

實施例4具有持續(xù)放氫光控基因開關(guān)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因藻株產(chǎn)氫效率

利用氣象色譜法(GC)測定轉(zhuǎn)基因藻產(chǎn)氫效率。首先將CC-849和轉(zhuǎn)基因藻株都置于持續(xù)的白光下培養(yǎng)，由于全光譜的白光含有藍光，因此對于轉(zhuǎn)基因藻具有持續(xù)誘導(dǎo)的效果。在藍光持續(xù)誘導(dǎo)amiRNA-D1表達的情況下，轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)氫效率有極顯著的增高，結(jié)果見圖3，這表明amiRNA-D1起到了調(diào)控產(chǎn)氫的作用。

為了驗證光誘導(dǎo)的效率，將轉(zhuǎn)基因藻置于缺乏藍光的光照條件下生長(紅光LED植物培養(yǎng)燈，峰值波長：660納米，半寬度：17.9納米，主波長：642.4納米，色純度：0.989)，生長到對數(shù)生長期時，利用藍光(波長約為450nm)誘導(dǎo)相關(guān)miRNA的表達，引起產(chǎn)氫量的增加。首先藍光誘導(dǎo)4小時和8小時，測定產(chǎn)氫量后在紅光恢復(fù)培養(yǎng)16小時，然后再藍光重復(fù)誘導(dǎo)4小時，8小時和12小時，再次測定產(chǎn)氫量。實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化子藍光誘導(dǎo)后產(chǎn)氫增加，經(jīng)紅光恢復(fù)培養(yǎng)后，再次藍光誘導(dǎo)，產(chǎn)氫量再次上升。該結(jié)果證明本光控系統(tǒng)在綠藻體系中對產(chǎn)氫的誘導(dǎo)是有效的，并且可以反復(fù)誘導(dǎo)，以達到持續(xù)產(chǎn)氫的目的。

序列表

<110> 深圳大學(xué)

<120> 一種誘導(dǎo)綠藻持續(xù)放氫的光控基因開關(guān)系統(tǒng)

<160> 7

<210> 1

<211> 261

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(261)

<223>

<400> 1

>VP16 AD

ATGGGCCCTA AAAAGAAGCG TAAAGTCGCC CCCCCGACCG ATGTCAGCCT GGGGGACGAG CTCCACTTAG ACGGCGAGGA CGTGGCGATG GCGCATGCCG ACGCGCTAGA CGATTTCGAT CTGGACATGT TGGGGGACGG GGATTCCCCG GGTCCGGGAT TTACCCCCCA CGACTCCGCC CCCTACGGCG CTCTGGATAT GGCCGACTTC GAGTTTGAGC AGATGTTTAC CGATGCCCTT GGAATTGACG AGTACGGTGG G

<210> 2

<211> 672

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

>GAL4 BD

AAGCTTGAAG CAAGCCTCCT GAAAGATGAA GCTACTGTCT TCTATCGAAC AAGCATGCGA TATTTGCCGA CTTAAAAAGC TCAAGTGCTC CAAAGAAAAA CCGAAGTGCG CCAAGTGTCT GAAGAACAAC TGGGAGTGTC GCTACTCTCC CAAAACCAAA AGGTCTCCGC TGACTAGGGC ACATCTGACA GAAGTGGAAT CAAGGCTAGA AAGACTGGAA CAGCTATTTC TACTGATTTT TCCTCGAGAA GACCTTGACA TGATTTTGAA AATGGATTCT TTACAGGATA TAAAAGCATT GTTAACAGGA TTATTTGTAC AAGATAATGT GAATAAAGAT GCCGTCACAG ATAGATTGGC TTCAGTGGAG ACTGATATGC CTCTAACATT GAGACAGCAT AGAATAAGTG CGACATCATC ATCGGAAGAG AGTAGTAACA AAGGTCAAAG ACAGTTGACT GTATCGCCGG AATTTGTAAT ACGACTCACT ATAGGGCGAG CCGCCATCAT GGAGGAGCAG AAGCTGATCT CAGAGGAGGA CCTGCATATG GCCATGGAGG CCGAATTCCC GGGGATCCGT CGACCTGCAG CGGCCGCATA ACTAGCATAA CCCCTTGGGG CCTCTAAACG GGTCTTGAGG GGTTTTTTGC GCGCTTGCAG CCAAGCTAAT TC

<210> 3

<211> 1839

<212> DNA

<213> 擬南芥種（Arabidopsis thaliana）

<400> 3

>CRY2（AT1G04400）

ATGAAGATGG ACAAAAAGAC TATAGTTTGG TTTAGAAGAG ACCTAAGGAT TGAGGATAAT CCTGCATTAG CAGCAGCTGC TCACGAAGGA TCTGTTTTTC CTGTCTTCAT TTGGTGTCCT GAAGAAGAAG GACAGTTTTA TCCTGGAAGA GCTTCAAGAT GGTGGATGAA ACAATCACTT GCTCACTTAT CTCAATCCTT GAAGGCTCTT GGATCTGACC TCACTTTAAT CAAAACCCAC AACACGATTT CAGCGATCTT GGATTGTATC CGCGTTACCG GTGCTACAAA AGTCGTCTTT AACCACCTCT ATGATCCTGT TTCGTTAGTT CGGGACCATA CCGTAAAGGA GAAGCTGGTG GAACGTGGGA TCTCTGTGCA AAGCTACAAT GGAGATCTAT TGTATGAACC GTGGGAGATA TACTGCGAAA AGGGCAAACC TTTTACGAGT TTCAATTCTT ACTGGAAGAA ATGCTTAGAT ATGTCGATTG AATCCGTTAT GCTTCCTCCT CCTTGGCGGT TGATGCCAAT AACTGCAGCG GCTGAAGCGA TTTGGGCGTG TTCGATTGAA GAACTAGGGC TGGAGAATGA GGCCGAGAAA CCGAGCAATG CGTTGTTAAC TAGAGCTTGG TCTCCAGGAT GGAGCAATGC TGATAAGTTA CTAAATGAGT TCATCGAGAA GCAGTTGATA GATTATGCAA AGAACAGCAA GAAAGTTGTT GGGAATTCTA CTTCACTACT TTCTCCGTAT CTCCATTTCG GGGAAATAAG CGTCAGACAC GTTTTCCAGT GTGCCCGGAT GAAACAAATT ATATGGGCAA GAGATAAGAA CAGTGAAGGA GAAGAAAGTG CAGATCTTTT TCTTAGGGGA ATCGGTTTAA GAGAGTATTC TCGGTATATA TGTTTCAACT TCCCGTTTAC TCACGAGCAA TCGTTGTTGA GTCATCTTCG GTTTTTCCCT TGGGATGCTG ATGTTGATAA GTTCAAGGCC TGGAGACAAG GCAGGACCGG TTATCCGTTG GTGGATGCCG GAATGAGAGA GCTTTGGGCT ACCGGATGGA TGCATAACAG AATAAGAGTG ATTGTTTCAA GCTTTGCTGT GAAGTTTCTT CTCCTTCCAT GGAAATGGGG AATGAAGTAT TTCTGGGATA CACTTTTGGA TGCTGATTTG GAATGTGACA TCCTTGGCTG GCAGTATATC TCTGGGAGTA TCCCCGATGG CCACGAGCTT GATCGCTTGG ACAATCCCGC GTTACAAGGC GCCAAATATG ACCCAGAAGG TGAGTACATA AGGCAATGGC TTCCCGAGCT TGCGAGATTG CCAACTGAAT GGATCCATCA TCCATGGGAC GCTCCTTTAA CCGTACTCAA AGCTTCTGGT GTGGAACTCG GAACAAACTA TGCGAAACCC ATTGTAGACA TCGACACAGC TCGTGAGCTA CTAGCTAAAG CTATTTCAAG AACCCGTGAA GCACAGATCA TGATCGGAGC AGCACCTGAT GAGATTGTAG CAGATAGCTT CGAGGCCTTA GGGGCTAATA CCATTAAAGA ACCTGGTCTT TGCCCATCTG TGTCTTCTAA TGACCAACAA GTACCTTCGG CTGTTCGTTA CAACGGGTCA AAGAGAGTGA AACCTGAGGA AGAAGAAGAG AGAGACATGA AGAAATCTAG GGGATTCGAT GAAAGGGAGT TGTTTTCGAC TGCTGAATCT TCTTCTTCTT CGAGTGTGTT TTTCGTTTCG CAGTCTTGCT CGTTGGCATC AGAAGGGAAG AATCTGGAAG GTATTCAAGA TTCATCTGAT CAGATTACTA CAAGTTTGGG AAAAAATGGT TGCAAATGA

<210> 4

<211> 1008

<212> DNA

<213> 擬南芥種（Arabidopsis thaliana）

<400> 4

>CIB1（AT4G34530）

ATGAATGGAG CTATAGGAGG TGACCTTTTG CTCAATTTTC CTGACATGTC GGTCCTAGAG CGCCAAAGGG CTCACCTCAA GTACCTCAAT CCCACCTTTG ATTCTCCTCT CGCCGGCTTC TTTGCCGATT CTTCAATGAT TACCGGCGGC GAGATGGACA GCTATCTTTC GACTGCCGGT TTGAATCTTC CGATGATGTA CGGTGAGACG ACGGTGGAAG GTGATTCAAG ACTCTCAATT TCGCCGGAAA CGACGCTTGG GACTGGAAAT TTCAAGAAAC GGAAGTTTGA TACAGAGACT AAGGATTGTA ATGAGAAGAA GAAGAAGATG ACGATGAACA GAGATGACCT AGTAGAAGAA GGAGAAGAAG AGAAGTCGAA AATAACAGAG CAAAACAATG GGAGCACAAA AAGCATCAAG AAGATGAAAC ACAAAGCCAA GAAAGAAGAG AACAATTTCT CTAATGATTC ATCTAAAGTG ACGAAGGAAT TGGAGAAAAC GGATTATATT CATGTTCGTG CACGACGAGG CCAAGCCACT GATAGTCACA GCATAGCAGA ACGAGTTAGA AGAGAAAAGA TCAGTGAGAG AATGAAGTTT CTACAAGATT TGGTTCCTGG ATGCGACAAG ATCACAGGCA AAGCAGGGAT GCTTGATGAA ATCATTAACT ATGTTCAGTC TCTTCAGAGA CAAATCGAGT TCTTATCGAT GAAACTAGCA ATTGTGAATC CAAGGCCGGA TTTTGATATG GATGACATTT TTGCCAAAGA GGTTGCCTCA ACTCCAATGA CTGTGGTGCC ATCTCCTGAA ATGGTTCTTT CCGGTTATTC TCATGAGATG GTTCACTCTG GTTATTCTAG TGAGATGGTT AACTCCGGTT ACCTTCATGT CAATCCAATG CAGCAAGTGA ATACCAGTTC TGATCCATTG TCATGCTTCA ACAATGGCGA AGCTCCTTCG ATGTGGGACT CTCATGTGCA GAATCTCTAT GGCAATTTAG GAGTTTGA

<210> 5

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

> Pre-amiRNA-D1

GCGGGGCCCT GACACCACTG CGGCCGCACC ACTAATCGGT ATTTGACGCC GCGCCTGGAC CCGAGGGAGG ACCCCTCGGG ACCCGGTACG TCGTCAAATA CCGATTACCG GCCTGGTCGC GGTGGGGTCA GGTCCTTCCG C