本發(fā)明涉及微生物篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種快速降解玉米秸稈的復合菌系及其制備方法以及利用該復合菌系進行快速降解秸稈的預處理方法。
背景技術(shù)：
：我國是農(nóng)業(yè)大國，各類農(nóng)作物秸稈資源十分豐富，而農(nóng)作物秸稈主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三大部分組成，自然狀態(tài)下難以被微生物分解，所以秸稈直接還田后在土壤中被微生物分解轉(zhuǎn)化的周期長，難以作為當季作物的肥源。以前，在農(nóng)村能源短缺、薪材缺乏的情況下，大部分秸稈被農(nóng)民用來作為燃料燃燒掉。但隨著農(nóng)村經(jīng)濟的發(fā)展和農(nóng)村能源問題的解決，秸稈不再作為燃料，農(nóng)作物在收割季節(jié)秸稈被集中焚燒的現(xiàn)象日益突出，不僅污染環(huán)境、危害人們的身體健康，而且煙霧彌漫，影響陸路交通和飛行安全。目前，秸稈的主要利用方式有秸稈還田、飼料化利用、秸稈氣化、固化及炭化、作生產(chǎn)食用菌的培養(yǎng)基料、工業(yè)應用等。秸稈還田包括就地還田、快速漚肥和堆肥等。其中，秸稈就地還田可增加土壤有機質(zhì)含量、培肥土壤，對農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展有重要意義，但還有諸多問題尚未解決。首先，秸稈的碳氮比（C/N）高，不僅不利于土壤微生物降解，而且還可能導致作物缺氮而生長不良；其次，秸稈還可能傳播部分病害，導致作物減產(chǎn)等。而快速漚肥和堆肥則存在纖維素難以降解問題。飼料化利用技術(shù)主要包括青貯氨化、發(fā)酵法以及生產(chǎn)單細胞蛋白。在我國可用作飼料的農(nóng)作物秸稈有多種，但具有共同的營養(yǎng)特點：蛋白質(zhì)、可溶性碳水化合物、礦物質(zhì)和胡蘿卜素含量低，而粗纖維含量高，因此消化率低，適口性差。要改善適口性，提高消化率，存在纖維素的降解問題。工業(yè)應用包括造紙，生物降解生產(chǎn)淀粉、酒精、醋酸等，易造成嚴重的環(huán)境污染，而且同樣存在纖維素的降解問題。現(xiàn)階段，對其生物質(zhì)能源轉(zhuǎn)化的研究很多，其中秸稈厭氧發(fā)酵制沼氣是目前的研究熱點之一。一般而言，在玉米秸稈成分中，木質(zhì)素的含量為17.5%、纖維素的含量為37.3%、半纖維素的含量為20.6%、灰分含量為6.1%、有機酸鹽含量為2.0%、其他物質(zhì)含量為18.5%。其中纖維素和半纖維素是可發(fā)酵糖的來源，但由于木質(zhì)素的存在使得玉米秸稈水解過程緩慢，水解程度低，進而影響了后續(xù)的酸化和產(chǎn)氣過程。因此，研究合適的預處理方法對玉米秸稈進行預處理，從而破壞秸稈的微觀結(jié)構(gòu)，加速水解進程，對提高以玉米秸稈為原料制取沼氣的產(chǎn)氣性能等資源化利用方面具有重要的意義，成為本領(lǐng)域亟待解決的技術(shù)問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可快速、高效降解玉米秸稈的復合菌系及其降解方法，使降解玉米秸稈的效率和穩(wěn)定性得以顯著提高。為達到前述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案包括：一種快速降解玉米秸稈的復合菌系，包括真菌、細菌和放線菌，其中真菌包括密粘褶菌、黃孢原毛平革菌、雜色云芝、綠色木霉和黑曲霉，細菌包括環(huán)狀芽孢桿菌、銅綠假單胞菌，放線菌包括栗褐鏈霉菌。一種所述復合菌系的制備方法，包括如下步驟：配制液體培養(yǎng)基：其中，液體培養(yǎng)基包括營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基以及酵母粉、淀粉培養(yǎng)基；單一菌種擴大培養(yǎng)：對制備好的各液體培養(yǎng)基進行高溫滅菌，冷卻至室溫后，用接種環(huán)取少量各菌種進行菌種培養(yǎng)；生成復合菌系：將斜面保藏的各菌種分別通過固態(tài)培養(yǎng)進行活化，把活化后的不同單一菌種分別接種到不同液體培養(yǎng)基，并將其放在恒溫震蕩培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；然后將不同菌種的菌液混合均勻。優(yōu)選地，配制營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基：取蛋白胨5克，牛肉膏30克，氯化鈉5克，蒸餾水1000毫升，在121℃滅菌30分鐘，用于環(huán)狀芽孢桿菌的培養(yǎng)；配制LB培養(yǎng)基：取酵母提取物5克，蛋白胨10克，氯化鈉10克，蒸餾水1000毫升，在121℃滅菌30分鐘，用于銅綠假單胞菌的培養(yǎng)；配制酵母粉、淀粉培養(yǎng)基：取酵母提取物2克，可溶性淀粉10克，蒸餾水1000毫升，在121℃滅菌30分鐘，用于栗褐鏈霉菌的培養(yǎng)；配制PDA培養(yǎng)基：取馬鈴薯提取液1000毫升，葡萄糖20克，在115℃滅菌30分鐘，用于黃孢原毛平革菌、雜色云芝、綠色木霉、黑曲霉、密粘褶菌的培養(yǎng)。優(yōu)選地，單一菌種擴大培養(yǎng)是指將制備好的培養(yǎng)基，在高溫下滅菌30分鐘，冷卻至室溫后，用接種環(huán)取菌種1～2環(huán)于三角瓶內(nèi)，并將其放在恒溫震蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，30℃恒溫條件下120r/min連續(xù)培養(yǎng)2天。優(yōu)選地，生成復合菌系是指將斜面保藏的各菌種分別通過固態(tài)培養(yǎng)進行活化，把活化后的不同單一菌種分別接種到不同液體培養(yǎng)基，并將其放在恒溫震蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，30℃恒溫條件下120r／min連續(xù)培養(yǎng)2天，然后將不同菌種的菌液混合均勻。一種利用所述復合菌系快速降解玉米秸稈的預處理方法，取秸稈30克，置于250毫升三角瓶中，按照固液質(zhì)量比1：5加入菌液，混合均勻后用封口膜封好，以維持三角瓶中基質(zhì)的含水率；30℃恒溫條件下培養(yǎng)14天，濕度控制在80%以上。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點是：（1）本發(fā)明提供的降解玉米秸稈的微生物復合菌系為真菌、細菌與放線菌的優(yōu)化組合,能通過分泌降解酶對表面包裹層產(chǎn)生破壞性作用，經(jīng)復合菌預處理后秸稈表面粗糙、膨松，粗糙結(jié)構(gòu)的表面存在大量突起和孔洞，木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，增加了纖維素的暴露面積，有利于微生物菌絲能直接進入秸稈內(nèi)部，通過分泌降解酶對內(nèi)部木質(zhì)纖維素進行降解。結(jié)果表明，復合菌預處理秸稈過程中，顯著提高了木質(zhì)纖維素的可及性，進一步顯著提高木質(zhì)纖維素的利用效率。（2）本發(fā)明創(chuàng)造性地制備出復合菌系，研究表明，通過本發(fā)明的復合菌系對玉米秸稈進行預處理，從而破壞秸稈的微觀結(jié)構(gòu)，加速水解進程，使其降解效率比單一菌種或其他菌群顯著提高。（3）通過優(yōu)化特定參數(shù)配制復合菌系，實現(xiàn)了快速、高效的預處理，進一步顯著提高了以玉米秸稈為原料制取沼氣的產(chǎn)氣性能。附圖說明圖1為玉米秸稈預處理過程中微生物生長曲線。圖2為玉米秸稈預處理過程中pH值的變化。圖3為玉米秸稈預處理過程中COD值的變化。圖4為預處理前玉米秸稈掃描電鏡圖像。圖5為自然堆積預處理后玉米秸稈掃描電鏡圖像。圖6為復合菌預處理后玉米秸稈掃描電鏡圖像。具體實施方式為讓本發(fā)明的上述及其他目的、特征及優(yōu)點能更明顯易懂，下文以本發(fā)明的較佳實施例為例，做詳細說明如下。本發(fā)明根據(jù)如表1所示的玉米秸稈主要成分，利用不同菌種的特性，創(chuàng)造性地制備出一種快速降解玉米秸稈的復合菌系，該復合菌系包括真菌、細菌和放線菌，其中真菌包括密粘褶菌、黃孢原毛平革菌、雜色云芝、綠色木霉和黑曲霉，細菌包括環(huán)狀芽孢桿菌、銅綠假單胞菌，放線菌包括栗褐鏈霉菌。表1玉米秸稈的主要成分原料C/%N/%C/N纖維素/%半纖維素/%木質(zhì)素/%總固體TS/%揮發(fā)性固體VS/%秸稈49.41±1.871.48±0.1433.3936.53±1.2727.93±1.6215.38±0.9290.92±0.7387.49±0.31玉米秸稈主要由纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素這些成分組成。對于這些物質(zhì)的降解需要多種微生物的協(xié)同作用。本實施例中的白腐菌（復合菌中的黃孢原毛平革菌和雜色云芝）對木質(zhì)素具有良好的降解能力，能使包裹在纖維素外的木質(zhì)素降解，有利于纖維素裸露，從而增強其他微生物對纖維素的降解效率。同時，本實施例中的黑曲霉和綠色木霉對玉米秸稈中的纖維素和半纖維素具有較好的降解能力。另外本實施中的放線菌和細菌能從結(jié)構(gòu)上改變木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)，提高纖維素的可及性。本發(fā)明優(yōu)選地提供了一種復合菌系快速降解玉米秸稈的方法，包括以下步驟：液體培養(yǎng)基的配制方法如下：營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基：蛋白胨5g，牛肉膏30g，氯化鈉（NaCl）5g，蒸餾水1000ml，121℃滅菌30min用于環(huán)狀芽孢桿菌的培養(yǎng)；LB培養(yǎng)基：酵母提取物5g，蛋白胨10g，氯化鈉（NaCl）10g，蒸餾水1000ml，121℃滅菌30min，用于銅綠假單胞菌的培養(yǎng)；酵母粉、淀粉培養(yǎng)基：酵母提取物2g，可溶性淀粉10g，蒸餾水1000ml，121℃滅菌30min，用于栗褐鏈霉菌的培養(yǎng)；PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯提取液1000ml，葡萄糖20g，115℃滅菌30min，用于黃孢原毛平革菌、雜色云芝、綠色木霉、黑曲霉、密粘褶菌的培養(yǎng)。單一菌種擴大培養(yǎng)：將制備好的各液體培養(yǎng)基，在高溫下滅菌30min，冷卻至室溫后置于三角瓶內(nèi)，用接種環(huán)取各菌種1～2環(huán)于三角瓶內(nèi)，并將其放在恒溫震蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，30℃、120r/min連續(xù)培養(yǎng)2d，將擴大培養(yǎng)后的各菌種進行斜面保藏。復合菌預處理：將斜面保藏的經(jīng)擴大培養(yǎng)后得到的各菌種分別通過固態(tài)培養(yǎng)進行活化，把活化后的不同單一菌種分別接種到不同液體培養(yǎng)基，并將其放在恒溫震蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，30℃恒溫條件下120r／min連續(xù)培養(yǎng)2d。然后將不同菌種的菌液混合均勻，取備用秸稈30g，置于250mL三角瓶中，按照固液質(zhì)量比1:5加入菌液，混合均勻后用封口膜封好，以維持三角瓶中基質(zhì)的含水率。30℃恒溫培養(yǎng)14d，濕度控制在80%以上。其中，單一菌種擴大培養(yǎng)中所述的高溫為121℃以上。采用對照試驗的方法研究利用上述預處理方法對玉米秸稈的降解效率的影響。試驗過程中以玉米秸稈自然堆積預處理作為對照組。每隔2d取樣測定不同預處理過程中物料中的微生物生長量、pH值以及COD值，對預處理前后秸稈中木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的含量進行測定，并用掃描電鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)變化，對比分析物料特性變化原因。其中，木質(zhì)纖維素測定方法：采用范式水洗法對秸稈中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量進行測定。微生物生長量的測定：采用HP8453型（上海安捷倫科技有限公司生產(chǎn)）分光光度計在600nm處測定樣品的OD值，作為微生物細胞濃度。pH值的測定：采用PHS-3C型（南京科環(huán)分析儀器有限公司）pH計進行測定。COD值的測定：取發(fā)酵液靜置后的上清液，采用KHCN-200A型COD氨氮測定儀（南京科環(huán)分析儀有限公司生產(chǎn)）進行測定。掃描電鏡分析：取少量預處理前后的秸稈樣品，用S-3400NII型掃描電鏡（日本HITACHI生產(chǎn)）進行觀察，放大倍數(shù)為1500倍。試驗例：以下通過試驗例來具體說明用本發(fā)明所述的方法構(gòu)建的復合菌系所具有的有益效果，本試驗例中將復合菌系接入所述的培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)。以自然堆積預處理作為對照，分別測定微生物生長量、pH值、COD值、掃描電鏡圖像和木質(zhì)纖維素含量。試驗例1：預處理過程中微生物生長曲線的變化秸稈預處理過程中OD600值的變化如圖1所示，其中，圖1中橫軸代表時間（d），縱軸代表OD600值，曲線中圓點代表自然堆積預處理，方塊點代表復合菌預處理。復合菌預處理過程中0~2d為延滯期，菌體增長緩慢；2~6d是對數(shù)增長期；6~10d為穩(wěn)定期，物料OD600值始終處在較高水平，在第8d達到最大值1.521；10d后進入衰亡期，物料OD600值緩慢降低。秸稈預處理過程中OD600值都呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，復合菌預處理過程中微生物延滯期較短，說明自然堆積過程中微生物的繁殖較慢，而復合菌可以較快的適應生長環(huán)境，使秸稈能在較短時間內(nèi)就開始降解；預處理過程中復合菌OD600值始終高于自然堆積預處理，說明復合菌預處理秸稈過程中的菌體濃度比較大，菌體生長代謝比較旺盛。試驗例2：預處理過程中pH值的變化秸稈預處理過程中pH值的變化如圖2所示，其中，圖2中橫軸代表時間（d），縱軸代表pH值，曲線中圓點代表自然堆積預處理，方塊點代表復合菌預處理。復合菌預處理在發(fā)酵開始后快速進入酸化期，pH值在第2d達到最小值5.18；在2~6d內(nèi)pH值快速回升到6.81；6d后物料的pH值一直呈現(xiàn)緩慢升高的趨勢。復合菌預處理后秸稈的pH值始終高于自然堆積預處理，且秸稈在自然堆積預處理過程中經(jīng)歷較長的酸化期，不利于微生物的生長；經(jīng)復合菌預處理后的物料在6d后基本能恢復到中性水平。一般非產(chǎn)甲烷微生物對酸堿度的適應范圍較廣，而產(chǎn)甲烷菌對環(huán)境變化極為敏感，只有在pH6.8~7.5的環(huán)境中才能正常生長代謝。復合菌在秸稈降解過程中具有較強的pH調(diào)控能力，從pH值的角度分析，經(jīng)過復合菌預處理后的秸稈更適合后續(xù)的厭氧發(fā)酵。試驗例3：預處理過程中COD的變化秸稈預處理過程中COD值的變化如圖3所示，其中，圖3中橫軸代表時間（d），縱軸代表COD（mg·L-1），曲線中圓點代表自然堆積預處理，方塊點代表復合菌預處理。秸稈復合菌預處理過程中的COD值在0~8d呈現(xiàn)增高趨勢，在第8d達到最大值12865mg·L-1；經(jīng)歷高峰期后，物料的COD值開始緩慢降低，最后趨于穩(wěn)定狀態(tài)。通過數(shù)據(jù)對比發(fā)現(xiàn)，隨著預處理過程的進行，經(jīng)復合菌預處理后的物料中有機質(zhì)含量升高，說明復合菌對秸稈的降解逐步進行，積累了大量有機質(zhì)；隨后又減少，說明微生物在秸稈預處理的過程中同時消耗了部分有機質(zhì)；秸稈自然堆積預處理過程中的有機質(zhì)含量變化趨勢，說明秸稈在水解過程中降解速率較慢，降解不夠完全。在預處理過程中，時間短則秸稈降解不完全，時間過長有機物會被消耗，而秸稈降解后產(chǎn)生的有機物是后續(xù)厭氧發(fā)酵過程中的碳源，從利用有機物的目的分析，經(jīng)復合菌預處理8d后，可溶性有機物含量達到最高值，比較適合厭氧發(fā)酵。試驗例4：秸稈結(jié)構(gòu)變化分析預處理前后秸稈掃描電鏡圖像如圖4-6所示，預處理前的秸稈表面平整光滑，結(jié)構(gòu)致密有規(guī)則。自然堆積預處理后的秸稈結(jié)構(gòu)成塊狀，部分結(jié)構(gòu)表面出現(xiàn)脫落層，說明自然堆積預處理能改變部分木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)，但降解效率還有待提高；結(jié)構(gòu)表面的碎屑殘渣減少，并出現(xiàn)少許縫隙和孔洞，說明預處理過程中小粒徑秸稈較先降解，對秸稈結(jié)構(gòu)的破壞作用較小。經(jīng)復合菌預處理后秸稈表面粗糙、膨松，粗糙結(jié)構(gòu)的表面存在大量突起和孔洞，說明復合菌能通過分泌降解酶對表面包裹層產(chǎn)生破壞性作用；木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，增加了纖維素的暴露面積，有利于微生物菌絲直接進入秸稈內(nèi)部，通過分泌降解酶對內(nèi)部木質(zhì)纖維素進行降解。結(jié)果表明，復合菌預處理秸稈過程中，提高了木質(zhì)纖維素的可及性，有利于提高木質(zhì)纖維素的利用效率。試驗例5：預處理前后木質(zhì)纖維素含量的變化預處理前后木質(zhì)纖維素含量的變化如表2所示，秸稈預處理過程中顯著降低了秸稈中中性洗滌纖維、纖維素以及半纖維素的含量（P<0.05），說明玉米秸稈中中性洗滌纖維、纖維素以及半纖維素比較容易降解；與自然堆積預處理比較，復合菌預處理過程中玉米秸稈的酸性洗滌纖維和木質(zhì)素含量顯著降低（P<0.05），說明復合菌對酸性洗滌纖維和木質(zhì)素具有較強的降解能力。表2預處理前后玉米秸稈的化學成分玉米秸稈中性洗滌纖維/%酸性洗滌纖維/%纖維素/%半纖維素/%木質(zhì)素/%未處理73.76±0.39a45.83±0.14a36.53±1.27a27.93±1.62a15.38±0.92a自然堆積預處理65.38±1.12b43.02±0.54a31.17±1.52b22.36±0.58b13.46±1.35a復合菌預處理54.13±2.08c38.61±1.05b23.78±0.63c15.52±0.76c9.35±1.21b注：表中同行數(shù)字不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明作任何形式上和實質(zhì)上的限制，凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)，當可利用以上所揭示的技術(shù)內(nèi)容，而做出的些許改動、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實施例；同時，凡依據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)技術(shù)對以上實施例所做的任何等同變化的更動、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。當前第1頁1 2 3