本發(fā)明涉及一種環(huán)狀的合成多肽PV及其抗菌應(yīng)用，具體地說是一種合成的衍生自LBDv活性多肽的結(jié)構(gòu)改造環(huán)狀多肽及其抗菌應(yīng)用。

背景技術(shù)：

對(duì)蝦的養(yǎng)殖在我國的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位，近些年來，對(duì)蝦養(yǎng)殖過程中的病害問題已經(jīng)嚴(yán)重阻礙了其養(yǎng)殖生產(chǎn)的健康發(fā)展，抗生素的濫用與環(huán)境的惡化使海水養(yǎng)殖動(dòng)物的病害難以從根本上得到控制。

抗菌肽(蛋白)被認(rèn)為是魚、蝦、貝等防御細(xì)菌、病毒等外源病原感染的重要效應(yīng)分子，在動(dòng)物的先天免疫過程中發(fā)揮重要作用。目前從甲殼動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽種類繁多，抗脂多糖因子(anti-lipopolysaccharide factor，ALF)就是其中一種重要的抗菌肽。1982年，Tanaka等首次從中國鱟(Tachypleus tridentatus)和北美鱟(Limulus polyphemus)的血細(xì)胞中分離得到ALF，并發(fā)現(xiàn)其能抑制LPS介導(dǎo)的凝血反應(yīng)的激活。1985年，Morita等發(fā)現(xiàn)ALF還具有很強(qiáng)的抗革蘭氏陰性菌活性。之后，人們相繼在斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)、中國明對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)、日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeus japonicus)、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)、桃紅對(duì)蝦(Farfantepenaeus duorarum)等多種甲殼動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)ALF編碼基因的存在，并證實(shí)ALF基因的重組蛋白具有廣泛的抗革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌生長(zhǎng)的活性。另外，研究還發(fā)現(xiàn)對(duì)蝦白斑綜合征病毒(WSSV)預(yù)先與重組表達(dá)的ALF蛋白一起孵育后再注射入蝦體中，能明顯抑制注入蝦體中的WSSV的復(fù)制。

與傳統(tǒng)抗生素的作用機(jī)理不同，ALF能直接中和細(xì)菌細(xì)胞壁的脂多糖，溶解細(xì)菌，因此不易引起細(xì)菌的耐藥性。ALF抗病毒的作用機(jī)理目前尚不清楚。隨著抗生素的應(yīng)用，許多病原菌對(duì)現(xiàn)有抗生素逐步產(chǎn)生耐藥性，而新型抗生素的發(fā)現(xiàn)又極其困難，因此，ALF的研究為開發(fā)新型抗菌藥物提供了重要基礎(chǔ)。

研究發(fā)現(xiàn)，ALF氨基酸序列中的兩個(gè)保守半胱氨酸之間形成二硫鍵，這兩個(gè)半胱氨酸之間的氨基酸共同組成一段陰離子多肽，具有與LPS結(jié)合的能力，這段保守的結(jié)構(gòu)被命名為L(zhǎng)PS結(jié)合結(jié)構(gòu)域，被認(rèn)為是ALF降解革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁脂多糖的功能域。2011年，Sachin Sharma等研究了根據(jù)鋸緣青蟹(Scylla serrata)ALF的LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域合成的具24個(gè)氨基酸殘基的多肽在抗菌免疫過程中作用，發(fā)現(xiàn)合成多肽SsALF24具有結(jié)合LPS的活性并且對(duì)大腸桿菌都具有明顯的抑制作用，其最小抑制濃度為16.16～32.32uM(Sharma S，Yedery RD，Patgaonkar MS，Selvaakumar C，Reddy KV.Antibacterial activity of a synthetic peptide that mimics the LPS binding domain of Indian mud crab，Scylla serrata anti-lipopolysaccharide factor(SsALF)also involved in the modulation of vaginal immune functions through NF-kB signaling.Microbial pathogenesis 2011；50∶179-191.)。

前期研究發(fā)現(xiàn)，中國明對(duì)蝦中ALF的LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有不同的抗菌抗病毒作用，通過中國明對(duì)蝦ALF的LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域改造獲得的LBDv多肽分子表現(xiàn)出顯著的抗菌抗病毒作用(Yang H，Li SH，Li FH，Xiang JH.Structure and bioactivity of a modified peptide derived from the LPS-binding domain of an anti-lipopolysaccharide factor(alf)of shrimp.Mar.Drugs 2016，14，96；doi：10.3390/md14050096.)?；诎l(fā)表的活性多肽LBDv的氨基酸序列，本發(fā)明對(duì)其序列進(jìn)行氨基酸替換、序列縮短等進(jìn)一步改造，利用化學(xué)合成的方法獲得了改造后的環(huán)形多肽PV，它們顯示出顯著的抗菌生物學(xué)活性，具有重要的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種經(jīng)過結(jié)構(gòu)改造的環(huán)狀合成多肽PV，它們具有明顯的抗菌活性。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

利用化學(xué)合成的方法獲得了環(huán)狀的合成多肽PV，具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，其序列特征為：

SEQ ID No.1：Ac-c(CKPKFKRWKLKFKKWC)-NH₂

所述的環(huán)狀的合成多肽PV序列具有二硫鍵結(jié)構(gòu)。其結(jié)構(gòu)特征在于：合成多肽PV的氨基端第一個(gè)半胱氨酸(C)和羧基端第一個(gè)半胱氨酸(C)之間具有二硫鍵結(jié)構(gòu)；多肽的氨基端C的氨基被乙?；?Ac-)，羧基端C的羧基被酰胺化(-NH₂)。

所述的環(huán)狀合成多肽PV衍生自活性多肽LBDv的結(jié)構(gòu)改造。LBDv的特征在于：具有序列列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

所述的環(huán)狀的合成多肽PV具有明顯的抗菌活性。具體為：對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)或增殖均具有很強(qiáng)的抑制作用。

所述環(huán)狀的合成多肽PV可作為抗菌的活性成份，可用于制備抗菌的藥物或制劑中。

本發(fā)明有如下優(yōu)點(diǎn)

1、本發(fā)明確定了一種衍生自活性多肽LBDv結(jié)構(gòu)改造的抗菌多肽PV及其結(jié)構(gòu)特征。

2、通過本發(fā)明可開發(fā)有效的細(xì)菌類疾病的防治藥物。

附圖說明

圖1合成多肽PV的空間結(jié)構(gòu)圖；

圖2合成多肽PV的HPLC純度檢測(cè)圖；

圖3合成多肽PV的MS質(zhì)譜鑒定圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

一種化學(xué)合成的具有明顯抗菌活性的對(duì)蝦環(huán)狀多肽PV，它們的序列及來源序列信息如下：

(1)SEQ ID No.1的信息

(a)序列特征

*長(zhǎng)度：16氨基酸

*類型：氨基酸

*鏈型：?jiǎn)捂?/p>

*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：環(huán)形，兩個(gè)半胱氨酸之間形成二硫鍵

*空間結(jié)構(gòu)：兩個(gè)半胱氨酸之間通過二硫鍵相連接，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，具有圖1所示空間結(jié)構(gòu)：多肽序列形成兩個(gè)相連的β折疊結(jié)構(gòu)。

(b)分子類型：蛋白

序列描述：

SEQ ID No.1

Ac-c(CKPKFKRWKLKFKKWC)-NH₂

其中括號(hào)內(nèi)的氨基酸為成環(huán)的氨基酸，括號(hào)外左側(cè)的小寫c表示括號(hào)內(nèi)的氨基酸為形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)氨基酸；Ac-表示氨基酸C的氨基被乙?；?；-NH₂表示氨基酸C的羧基被酰胺化。

(2)SEQ ID No.2的信息

(a)序列特征

*長(zhǎng)度：24氨基酸

*類型：氨基酸

*鏈型：?jiǎn)捂?/p>

*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：環(huán)形，兩個(gè)半胱氨酸之間形成二硫鍵

(b)分子類型：蛋白

序列描述：SEQ ID No.2

Ac-Yc(CKFRVKPKFKRWRLRFKGRMWC)P-NH₂

所述抗菌多肽PV的合成、環(huán)化、純化、鑒定及生物活性分析：

通過人工化學(xué)合成途徑，利用固相合成方法獲得粗品多肽，經(jīng)固相環(huán)化、質(zhì)譜鑒定和液相色譜純化獲得含有二硫鍵的合成多肽PV。具體為：

1)多肽合成

采用9-芴甲氧羰基(Fmoc)合成策略，從C端向N端方向合成。用10mg Rink-Amide-Resin樹脂(AAPPTec，貨號(hào)RRZ001)作為載體，依靠載體本身的活性基團(tuán)與5mg被Fmoc進(jìn)行氨基保護(hù)的第一個(gè)氨基酸(Fmoc-Pro-NH₂)的羧基相連(詳細(xì)方法參考文獻(xiàn)：Panagiotis Stathopoulos，Serafim Papas，Vassilios Tsikaris.C-terminal N-alkylated peptide amides resulting from the linker decomposition of the Rink amide resin.A new cleavage mixture prevents their formation.Journal of Peptide Science 2006；12：227-232.)。

用N-甲基毗咯皖酣(NMP)沖洗樹脂除去多余保護(hù)氨基酸，向反應(yīng)器(固相合成器)中加入20％哌啶/NMP溶液(體積分?jǐn)?shù))脫除Fmoc基團(tuán)，反應(yīng)20min，排空反應(yīng)器，用5mL NMP振蕩沖洗樹脂，重復(fù)3次，脫除第一個(gè)氨基酸殘基的Fmoc保護(hù)；裸露出的活性氨基基團(tuán)與下一個(gè)被Fmoc進(jìn)行氨基保護(hù)的氨基酸(5mg)的羧基相連，形成第一個(gè)肽鍵(Cys-Trp)。此段的以上步驟循環(huán)進(jìn)行(不同之處在于：只是每次需采用對(duì)應(yīng)的被Fmoc進(jìn)行氨基保護(hù)的氨基酸)直至多肽序列Ac-CKPKFKRWKLKFKKWC-NH₂合成完畢，得約20mg線性多肽。

2)多肽環(huán)化

20mg線性多肽偶聯(lián)完最后一個(gè)氨基酸后，配置0.1mol/L的I₂溶液(I₂溶于體積比1∶1的甲醇∶DMF混合溶液中)，加入10mL至固相合成器中，氮?dú)獯捣鞣磻?yīng)，約6小時(shí)。

3)多肽純化和鑒定

用50mL切肽試劑三氟乙酸∶苯甲硫醚∶苯酚∶乙二硫醇∶雙蒸水(體積比82.5∶5∶5∶2.5∶5)將20mg環(huán)化后的多肽從載體樹脂上裂解下來，2小時(shí)后，加入4℃預(yù)冷的乙醚100ml使多肽沉淀，離心收集沉淀物，并用乙醚洗滌3遍，真空抽干，得到的多肽粗品經(jīng)反向液相色譜純化，純化后的多肽凍干后進(jìn)行HPLC純度檢測(cè)(圖2)和質(zhì)譜鑒定(圖3)。檢測(cè)HPLC色譜柱為250*4.6mm，Kromasil-C18-5μm；流動(dòng)相A：0.1％TFA/乙腈，流動(dòng)相B：0.1％TFA/H₂O；線性洗脫梯度：15％A-100％A；流速為1ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm；一次進(jìn)樣量為10μl。HPLC和MS檢測(cè)結(jié)果顯示，合成多肽PV的純度為96.05％，分子量為2193.82，與預(yù)測(cè)分子量(2193.82)一致。

4)抑菌試驗(yàn)

合成多肽PV分別用50mmol/LpH7.4的PBS溶解至濃度為640μmol/L的溶液，同時(shí)以50mmol/L pH7.4的PBS為陰性對(duì)照。采用最低抑菌濃度(MIC)方法檢測(cè)合成多肽PV對(duì)革蘭氏陰性菌包括哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、大腸桿菌(Escherichia coli)、美人魚發(fā)光桿菌(Photobacterium damselae subsp.piscicida)和革蘭氏陽性菌包括表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)等細(xì)菌的抑菌活性。即：將待測(cè)大腸桿菌、表皮葡萄球菌分別在37℃，200r/min培養(yǎng)條件下于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至1×10⁸cells/mL，哈維氏弧菌、美人魚發(fā)光桿菌分別在30℃，200r/min培養(yǎng)條件下于TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至1×10⁸cells/mL；培養(yǎng)的細(xì)菌分別加入到48孔培養(yǎng)板中，用新鮮的LB或TSB培養(yǎng)基將待測(cè)菌液稀釋至終濃度1×10⁶cells/mL；向48孔培養(yǎng)板中分別加入梯度稀釋的多肽PV溶液至終體積為200μl，多肽H終濃度依次為64μmol/L、32μmol/L、16μmol/L、8μmol/L、4μmol/L、2μmol/L和1μmol/L；用PBS作為陰性對(duì)照，終濃度58μmol/L的氨芐青霉素(大腸桿菌、表皮葡萄球菌)或88μmol/L的卡那霉素(哈維氏弧菌、美人魚發(fā)光桿菌)分別作為陽性對(duì)照；在37℃或28℃條件下培養(yǎng)3h后，分別加入300μl新鮮LB或TSB培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)18h，測(cè)定每孔中細(xì)菌的OD600吸光值，計(jì)算細(xì)菌濃度。

結(jié)果表明，1-2μmol/L的合成多肽PV能夠有效抑制哈維氏弧菌和美人魚發(fā)光桿菌的生長(zhǎng)，2-4μmol/L的合成多肽PV能夠有效抑制大腸桿菌和表皮葡萄球菌的生長(zhǎng)。結(jié)果說明合成多肽PV具有顯著的抗革蘭氏陽性菌和陰性菌的活性。

合成多肽PV的發(fā)現(xiàn)及生物活性鑒定，在新型抗菌藥物的開發(fā)上具有重要的應(yīng)用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國科學(xué)院海洋研究所

<120> 一種改造環(huán)狀多肽PV及其應(yīng)用和抗菌制劑

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<221> PRT

<222> (1)..(16)

<223> 1和16位氨基酸C的氨基被乙?；?、羧基被酰胺化

<400> 1

Cys Lys Pro Lys Phe Lys Arg Trp Lys Leu Lys Phe Lys Lys Trp Cys

1 5 10 15

<210> 2

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<221> PRT

<222> (1)..(24)

<223> 2和23位氨基酸C的氨基被乙酰化、羧基被酰胺化

<400> 2

Tyr Cys Lys Phe Arg Val Lys Pro Lys Phe Lys Arg Trp Arg Leu Arg

1 5 10 15

Phe Lys Gly Arg Met Trp Cys Pro

20