本發(fā)明涉及一種用于木糖轉(zhuǎn)化PHA人工雙菌體系初步優(yōu)化的方法。

背景技術(shù)：

聚羥基烷酸酯(PHA)是一種環(huán)境友好型高分子生物塑料，能完美代替?zhèn)鹘y(tǒng)的石油化工產(chǎn)品，由于其具有良好的生物可降解性和生物相容性，PHA被廣泛的應(yīng)用于醫(yī)藥包裝、塑料制造以及高分子材料等領(lǐng)域。從2011年至2020年，全球?qū)HA的需求量將從3萬噸增長至12萬噸以上[1,2]。不過限于成本因素和技術(shù)問題，現(xiàn)階段PHA難以實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)塑料那樣級別的大面積工業(yè)化生產(chǎn)。據(jù)清華大學(xué)調(diào)研，底物消耗占PHA成本的50％，能源消耗占30％。為降低底物成本，人們將目光從葡萄糖等昂貴底物轉(zhuǎn)向了非糧原料，如占自然界木質(zhì)纖維素含量18-30％的木糖。從1990年代起，人們已廣泛開展利用木糖產(chǎn)PHA菌種篩選和過程優(yōu)化等研究，但始終未能取得重大突破，其原因在于目前PHA主要采用傳統(tǒng)的微生物單一菌種發(fā)酵生產(chǎn)，但木糖轉(zhuǎn)化效率、PHA產(chǎn)量等均低于以葡萄糖為底物。微生物單菌代謝能力的限制是木糖高效轉(zhuǎn)化PHA的瓶頸。

自然界中，在相互依存中發(fā)揮作用的混菌體系可以很好地解決代謝負(fù)擔(dān)等問題[3]。與單菌相比，微生物混菌體系具有三大優(yōu)勢[4]，結(jié)合木糖產(chǎn)PHA體系分析：將木糖利用與PHA合成等任務(wù)分配到不同菌株中執(zhí)行，可避免單菌代謝負(fù)荷過重的問題；PHA的胞內(nèi)積累是在環(huán)境惡劣條件下形成的，混菌體系可在環(huán)境波動(dòng)情況下通過不同菌株間的代謝物質(zhì)交流、能量水平平衡等形式維持整個(gè)體系的相對穩(wěn)定；單菌利用木糖產(chǎn)PHA受其本身基因組大小限制可改造空間較小，而混菌體系中存在多種細(xì)胞，加入新菌或?qū)胄禄蚩梢酝卣贵w系功能。利用微生物混菌體系實(shí)現(xiàn)木糖高效轉(zhuǎn)化為PHA，可望打破木糖產(chǎn)PHA的技術(shù)瓶頸。但是，天然混菌體系的形成往往以生存為目的，難以按照人類的預(yù)期實(shí)現(xiàn)特定的生產(chǎn)目標(biāo)。另外，隨著體系中細(xì)胞種類的增加，也會(huì)給細(xì)胞間的交流帶來障礙，影響體系的效率。而不同種細(xì)胞生長速度、代謝能力等的不匹配，也給混菌發(fā)酵帶來了困難。因此，對混菌體系設(shè)計(jì)與構(gòu)建原理的闡述以及混菌體系的優(yōu)化就很具有意義。

[1]Lara D,Michael C,Achim R,et al.Market developments of and opportunities for biobased products and chemicals.Nova-Institute for Ecology and Innovation Reprot,2013,52202

[2]Sudesh K,Bhubalan K,Chuah J A,et al.Synthesis ofpolyhydroxyalkanoate from palm oil and some new applications.Applied Microbiology and Biotechnology,2011,89(5):1373-1386[4]S.Y.Lee.Poly(3-Hydroxybutyrate)Production from Xylose by Recombinant Escherichia Coli.bioprocess engineering,1998,18(5):397-399

[3]Hao Song,Mingzhu Ding,Xiaoqiang Jia,et al.Synthetic microbial consortia:from systematic analysis to construction and applications.Chemical Society Reviews,2014,43(20):6954-6981

[4]Brenner K,Lingchong You,Frances H.Arnold,Engineering microbial consortia:a new frontier in synthetic biology.Trends in Biotechnology,2008,26(9):483-489

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于上述，本發(fā)明提出一種用于木糖轉(zhuǎn)化PHA人工雙菌體系初步優(yōu)化的方法，具體技術(shù)如下：

一種用于木糖轉(zhuǎn)化PHA人工雙菌體系初步優(yōu)化的方法，即針對假單胞菌和釀酒酵母的人工雙菌體系，通過接種優(yōu)化法和培養(yǎng)優(yōu)化法，以實(shí)現(xiàn)利用廉價(jià)碳源木糖產(chǎn)PHA，釀酒酵母為天津大學(xué)元英進(jìn)教授惠贈(zèng)，其出發(fā)菌株為Saccharomyces cerevisiae L2612；積累PHA的假單胞菌Pseudomonas aeruginosa SA1/TJU-J-05，于2016年2月18日保藏于中國微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種用于木糖轉(zhuǎn)化PHA人工雙菌體系初步優(yōu)化的方法，即針對假單胞菌和釀酒酵母的人工雙菌體系，通過接種優(yōu)化法和培養(yǎng)優(yōu)化法，以實(shí)現(xiàn)利用廉價(jià)碳源木糖產(chǎn)PHA。具體步驟如下：

1)對釀酒酵母在培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，測定釀酒酵母生長曲線，確定對數(shù)生長期；

2)雙菌合適接種時(shí)間的確定；

3)雙菌合適接種比例的確定。

所用培養(yǎng)基為：YPD培養(yǎng)基和木糖培養(yǎng)基。

最終確定最優(yōu)接種條件為，釀酒酵母：假單胞菌接種比1:2，假單胞菌在釀酒酵母單獨(dú)培養(yǎng)12h后接種。

優(yōu)選在pH值為7，糖濃度為15g/L，無機(jī)鹽成分充足的條件下PHA的產(chǎn)量達(dá)到最大值。

具體說明如下：

上述接種優(yōu)化法主要包括對接種時(shí)間和接種比例進(jìn)行優(yōu)化選擇，即對釀酒酵母進(jìn)行培養(yǎng)，測定釀酒酵母的生長曲線，然后通過理性設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行雙菌共培養(yǎng)，獲取最優(yōu)接種條件以實(shí)現(xiàn)接種優(yōu)化，所用培養(yǎng)基為：

YPD培養(yǎng)基：用于酵母菌的活化，其組分如下：蛋白胨20，葡萄糖20，酵母提取物10。此培養(yǎng)基采用蒸餾水配置，并在滅菌鍋中115℃滅菌30分鐘。其中葡萄糖單獨(dú)滅菌，所有組分完成滅菌之后，再在無菌環(huán)境下混合均勻。固體培養(yǎng)基中，則加入2％的瓊脂，其余條件相同。

木糖培養(yǎng)基：用于酵母菌以及假單胞菌共培養(yǎng)，以及PHA積累。其中的碳源為1g木糖，不含葡萄糖，加入無機(jī)鹽成分，其硫酸鹽，磷酸鹽，微量元素的具體組成如下：

硫酸鹽(200ml)：10g硫酸銨，2g無水硫酸鎂，用蒸餾水定容至200mL，121℃滅菌20min；

磷酸鹽(200ml)：96.5g十二水磷酸氫二鈉，15g磷酸氫二鉀，用蒸餾水定容至200ml，121℃滅菌20min；

微量元素(200ml)：10ml 50g/L檸檬酸鐵銨溶液，10ml 29.8g/L六水氯化鈣，4.17mL 12mol/L濃鹽酸，1mg七水硫酸鋅，0.3mg四水氯化錳，3mg硼酸，2mg六水氯化鈷，0.064mg硫酸銅，0.2mg氯化鎳，0.3mg二水鉬酸鈉，用蒸餾水定容至200ml，121℃滅菌20min。

具體方法為：

無菌條件下，按初始OD₆₀₀約為0.1的接種比例接種酵母種子液于100mL木糖培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖床培養(yǎng)，每6h取樣一次，將樣品菌液存于2mL離心管中，并利用紫外分光光度儀測定600nm下菌液的OD600值。每次取樣均做三個(gè)平行,根據(jù)得到結(jié)果繪制釀酒酵母的生長曲線。

根據(jù)之前測定的酵母菌(以下簡稱S菌)在木糖培養(yǎng)基下的生長曲線，確定此條件下酵母菌進(jìn)入對數(shù)期的時(shí)間。為了確定酵母菌與假單胞菌(以下簡稱P菌)在木糖培養(yǎng)基的環(huán)境下，是否具有共生作用，并且有無PHA積累，故設(shè)計(jì)多組混菌組合以期達(dá)到混菌利用木糖產(chǎn)PHA的目的，具體設(shè)計(jì)方案如表1所示：

表1混菌組合方式

培養(yǎng)結(jié)束后，取六組實(shí)驗(yàn)的菌液測量其OD₆₀₀值，進(jìn)行比較分析，此外，取菌液提取干燥菌體后酯化處理，并用氣相色譜檢測PHA含量，并比較六組實(shí)驗(yàn)結(jié)果。PHA含量測定方法采用內(nèi)標(biāo)法測定，先將樣品和內(nèi)標(biāo)甲酯化后，用氣相色譜檢測其含量，具體操作步驟如下：

取1mL搖瓶菌液于干凈離心管中，測量其最終OD值。取40mL菌液于50mL離心管中，9000rpm冷凍離心10min，棄置上清液后加入蒸餾水洗滌菌體，震蕩重懸后再離心，反復(fù)兩次后，放入冷凍干燥機(jī)中于-40℃條件下冷凍干燥24h，凍干后將剩余的菌體稱重并記錄。

按照0.5g苯甲酸，15mL濃硫酸，485mL甲醇的比例配制500mL酯化液，在酯化管中，加入約50mg凍干后的菌體樣品，以及氯仿和酯化液各2mL，加蓋密閉，在100℃下水浴加熱，反應(yīng)4h。待樣品冷卻至室溫，加入適量蒸餾水并震蕩，靜置片刻等待其分層，然后取下層有機(jī)相于氣相色譜中進(jìn)行分析。同時(shí)，稱取20mg PHB標(biāo)品，按照同樣的方法進(jìn)行酯化反應(yīng)并檢測。

氣相色譜程序如下：柱溫80℃，進(jìn)樣器溫度240℃，檢測器溫度250℃，分流比1：10。升溫條件：80℃保持90s，并以30℃/min的速度升至140℃，再以40℃/min升溫至250℃，并在250℃保持2min。樣品進(jìn)樣量為2μL。

樣品中的PHA含量根據(jù)標(biāo)品與內(nèi)標(biāo)在色譜圖的峰面積之比計(jì)算得出。

最后，通過對不同實(shí)驗(yàn)組菌體生長和PHA產(chǎn)量的測定結(jié)果的比較分析，可以確定體系的最優(yōu)接種條件。

所述培養(yǎng)優(yōu)化法主要是通過對假單胞菌產(chǎn)PHA實(shí)驗(yàn)的理性設(shè)計(jì)，獲取最優(yōu)培養(yǎng)條件以及限制性因素，具體方法為：

以糖濃度，pH，以及無機(jī)鹽成分為影響因素設(shè)計(jì)不同的實(shí)驗(yàn)組，測試假單胞菌在不同條件下的PHA積累量。其中，pH的變量為6，7，8，糖濃度的變量為10g/L，15g/L，20g/L，無機(jī)鹽成分變量為缺失硫酸鹽組分(為銨鹽和鎂離子表2中簡稱為成分1)，缺失磷酸鹽組分(表2中成分2主要為磷源)，以及全部添加，表2中微量金屬離子簡稱為成分3，詳細(xì)組成參見發(fā)明內(nèi)容。具體實(shí)驗(yàn)方案如表2所示：

表2不同的發(fā)酵條件優(yōu)化

其中，每三組實(shí)驗(yàn)里，均有三組不同糖濃度的變量，同時(shí)無機(jī)鹽組分不同的組合，則是為了測試限氮限磷的作用。

搖瓶發(fā)酵結(jié)束后，取菌液1mL，測量9組菌液的OD600值，并取40mL發(fā)酵液置于50mL離心管中離心，離心后棄上清，置于冷凍離心機(jī)中干燥24h，并稱量菌體干重。應(yīng)用氣相色譜確定PHA積累量。

最后通過比較各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞干重和PHA產(chǎn)量的數(shù)據(jù)可以獲取最優(yōu)培養(yǎng)條件。

附圖說明

圖1：酵母菌生長曲線圖；

木糖培養(yǎng)基中，酵母菌大致在接種12h后進(jìn)入對數(shù)期，大約在60h左右，菌體量沒有了明顯的增長，最終OD600最高值達(dá)到7.5左右。

圖2：6組樣品的PHA產(chǎn)量；

混菌共培養(yǎng)結(jié)束后，取菌液提取干燥菌體后酯化處理，并用氣相色譜檢測其PHA含量。

具體實(shí)施方式

下面以對假單胞菌Pseudomonas aeruginosa SA1/TJU-J-05和釀酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae L2612構(gòu)成的雙菌體系的優(yōu)化為例對本發(fā)明進(jìn)行說明，具體步驟如下：

1.條件優(yōu)化法

以糖濃度，pH，以及無機(jī)鹽成分為影響因素設(shè)計(jì)不同的實(shí)驗(yàn)組，測試假單胞菌在不同條件下的PHA積累量。其中，pH的變量為6，7，8，糖濃度的變量為10g/L，15g/L，20g/L，無機(jī)鹽成分變量為缺失硫酸鹽組分(為銨鹽和鎂離子表3中簡稱為成分1)，缺失磷酸鹽組分(表3中成分2主要為磷源)，以及全部添加，表3中微量金屬離子簡稱為成分3，詳細(xì)組成參見發(fā)明內(nèi)容。具體實(shí)驗(yàn)方案如表3所示：

表3不同的發(fā)酵條件優(yōu)化

其中，每三組實(shí)驗(yàn)里，均有三組不同糖濃度的變量，同時(shí)無機(jī)鹽組分不同的組合，則是為了測試限氮限磷的作用。

搖瓶發(fā)酵結(jié)束后，取菌液1mL，測量12組菌液的OD600值，并取40mL發(fā)酵液置于50mL離心管中離心，離心后棄上清，置于冷凍離心機(jī)中干燥24h，并稱量菌體干重。應(yīng)用氣相色譜確定PHA積累量。

本實(shí)驗(yàn)中PHA含量測定方法采用內(nèi)標(biāo)法測定，先將樣品和內(nèi)標(biāo)甲酯化后，用氣相色譜檢測其含量，具體操作步驟如下：

取1mL搖瓶菌液于干凈離心管中，測量其最終OD值。取40mL菌液于50mL離心管中，9000rpm冷凍離心10min，棄置上清液后加入蒸餾水洗滌菌體，震蕩重懸后再離心，反復(fù)兩次后，放入冷凍干燥機(jī)中于-40℃條件下冷凍干燥24h，凍干后將剩余的菌體稱重并記錄。

按照0.5g苯甲酸，15mL濃硫酸，485mL甲醇的比例配制500mL酯化液，在酯化管中，加入約50mg凍干后的菌體樣品，以及氯仿和酯化液各2mL，加蓋密閉，在100℃下水浴加熱，反應(yīng)4h。待樣品冷卻至室溫，加入適量蒸餾水并震蕩，靜置片刻等待其分層，然后取下層有機(jī)相于氣相色譜中進(jìn)行分析。同時(shí)，稱取20mg PHB標(biāo)品，按照同樣的方法進(jìn)行酯化反應(yīng)并檢測。

氣相色譜程序如下：柱溫80℃，進(jìn)樣器溫度240℃，檢測器溫度250℃，分流比1：10。升溫條件：80℃保持90s，并以30℃/min的速度升至140℃，再以40℃/min升溫至250℃，并在250℃保持2min。樣品進(jìn)樣量為2μL。

樣品中的PHA含量根據(jù)標(biāo)品與內(nèi)標(biāo)在色譜圖的峰面積之比計(jì)算得出。

最終，確定在在PH值為7，糖濃度為15g/L，無機(jī)鹽成分充足的條件下PHA的產(chǎn)量達(dá)到最大值。

2.接種優(yōu)化法

(1)釀酒酵母菌生長曲線測定

無菌條件下，按初始OD600約為0.1的接種比例接種酵母種子液于100mL木糖培養(yǎng)基中，每6h取樣一次，將樣品菌液存于2mL離心管中，并利用紫外分光光度儀測定600nm下菌液的OD600值。每次取樣均做三個(gè)平行。

(2)假單胞菌與釀酒酵母混菌共培養(yǎng)

根據(jù)之前測定的酵母菌(以下簡稱S菌)在木糖培養(yǎng)基下的生長曲線(如圖1所示)，確定此條件下酵母菌進(jìn)入對數(shù)期的大致時(shí)間。為了確定最優(yōu)接種時(shí)間和接種比例，故設(shè)計(jì)多組混菌組合以期達(dá)到混菌利用木糖產(chǎn)PHA的目的，具體設(shè)計(jì)方案如表2所示：

表4混菌組合方式

大致操作流程如下：無菌條件下，取處于對數(shù)期的酵母菌種子液接種于木糖培養(yǎng)基中，再同時(shí)或待酵母菌進(jìn)入對數(shù)期后加入假單胞菌菌液?；炀谋壤闯跏糘D₆₀₀確定，并保持所有實(shí)驗(yàn)組總的初始OD₆₀₀約為0.1。

通過比較PHA的產(chǎn)量(如圖2所示)，最終確定最優(yōu)接種條件為：釀酒酵母：假單胞菌接種接種比1:2(S：P)，假單胞菌12h后接種。

(3)混菌共培養(yǎng)產(chǎn)PHA實(shí)驗(yàn)

混菌共培養(yǎng)結(jié)束后，取其菌液提取干燥菌體后酯化處理，并用氣相色譜檢測其PHA含量，詳細(xì)操作步驟同上文所述的PHA含量測定方法。

通過接種優(yōu)化和條件優(yōu)化法實(shí)現(xiàn)了對酵母菌和假單胞菌體系的初步優(yōu)化，使得兩菌能夠在木糖培養(yǎng)基下很好的共生，并實(shí)現(xiàn)混菌利用木糖產(chǎn)PHA，為體系的進(jìn)一步優(yōu)化提供了參考與基礎(chǔ)。