本發(fā)明涉及全人源CTLA-4抗體片段在昆蟲細(xì)胞/桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

CTLA-4的全稱叫做細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)蛋白-4(Cytotoxic T lymphocyte associated protein-4)，它是T細(xì)胞表面表達(dá)的一類共刺激分子(co-stimulatory molecule)。與CD28的功能類似，在T細(xì)胞激活過程中，CTLA-4能夠與抗原呈遞細(xì)胞(Antigen presenting cell,APC)表面的CD80/CD86特異性結(jié)合來激活下游信號。研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞中主要表達(dá)CTLA-4的細(xì)胞為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)，是一類可以負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫的T細(xì)胞；在缺失CTLA-4受體時，小鼠表現(xiàn)出T細(xì)胞過度活化伴隨嚴(yán)重的自身免疫病。以上結(jié)果可以得出，Treg需要通過CTLA-4行使其功能。另外，CTLA-4也在conT細(xì)胞中有表達(dá)，其作用是抑制T細(xì)胞激活的信號傳遞。CTLA-4FAB片段是人單克隆抗體Ipilimumab(易普利姆瑪)的重鏈和輕鏈經(jīng)二硫鍵結(jié)合的二聚物，是屬于免疫治療癌癥的潛在重磅藥物之一。

Fab是IgG分子的抗原結(jié)合片段，是由Fd片段與輕鏈通過二硫鍵結(jié)合形成的異二聚合體，因其相對分子質(zhì)量小、有高度確定的完整性結(jié)構(gòu)和免疫原性低等優(yōu)點成為IgG類抗體生產(chǎn)和改造的首選。由于Fab片段沒有Fc段，不需要進(jìn)行復(fù)雜的糖基化和翻譯后修飾，所以不需要通過哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)來生產(chǎn)。而Bac-to-Bac昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)與其他真核表達(dá)系統(tǒng)相比有許多優(yōu)勢：能高水平表達(dá)外源基因；大多數(shù)表達(dá)的重組蛋白可溶；能進(jìn)行翻譯后的加工修飾：包括糖基化、磷酸化、?；⑿盘栯那谐?；較容易分離純化；昆蟲細(xì)胞懸浮生長易放大培養(yǎng)，有利于大規(guī)模表達(dá)重組蛋白。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種在昆蟲細(xì)胞/桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中分泌共表達(dá)獲得重組CTLA-4抗體Ipilimumab的Fab片段的制備方法。本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，通過利用昆蟲細(xì)胞作為宿主進(jìn)行表達(dá)，可獲得具有生物活性的重組CTLA-4抗體Fab蛋白。

在此，本發(fā)明提供一種全人源單克隆抗體CTLA-4單抗Fab片段的制備方法，包括：

(a)將N端分別帶有信號肽的Fab片段的重鏈(heavy chain，Hc)與輕鏈(light chain，Lc)的氨基酸序列的基因克隆于帶有雙啟動子的桿狀病毒表達(dá)載體(優(yōu)選為pFastBacT1)內(nèi)構(gòu)建重組表達(dá)載體；

(b)將所得的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)座至感受態(tài)細(xì)胞中，篩選重組菌斑，提取重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染至昆蟲細(xì)胞中，得到重組桿狀病毒后進(jìn)一步擴(kuò)增病毒，并使用病毒感染放大培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞以表達(dá)Fab蛋白，離心收集含F(xiàn)ab蛋白的上清產(chǎn)物；

(c)將所得昆蟲細(xì)胞表達(dá)上清首先使用膜包進(jìn)行超濾濃縮和置換緩沖溶液，然后色譜柱純化，即可得到全人源單克隆抗體CTLA-4單抗Fab片段。

本發(fā)明運用基因工程等技術(shù)手段，將帶有信號肽(例如Ac NPV gp64)的Fab片段的重鏈與輕鏈分別克隆至桿狀病毒載體(例如pFastBacT1)中，獲得重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)座到感受態(tài)細(xì)胞(例如DH10Bac)中獲得重組Bacmid DNA，轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞(例如Sf9)獲得重組桿狀病毒，利用病毒感染昆蟲細(xì)胞，分泌共表達(dá)目的蛋白，離心收集含目的蛋白的上清產(chǎn)物。再進(jìn)行色譜柱純化，得到有生物活性的CTLA-4蛋白。經(jīng)本發(fā)明方法獲得的全人源單克隆抗體CTLA-4片段經(jīng)分析顯示純度較高，且能特異性結(jié)合CTLA-4，其抑制效果與標(biāo)準(zhǔn)品Ipilimumab相似，說明本發(fā)明方法Fab片段保留了標(biāo)準(zhǔn)品Ipilimumab具備的抗原結(jié)合性和特異性；而該Fab片段分子量低易靶向作用于病灶，另外昆蟲細(xì)胞懸浮生長易放大培養(yǎng)，該Fab片段可以在昆蟲細(xì)胞中大規(guī)模表達(dá)生產(chǎn)，易于分離純化。

本發(fā)明中，選用昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)載體pFastBacT1共分泌表達(dá)，能容納大分子的插入片段，表達(dá)多種外源基因并可以高效并大量表達(dá)外源基因。通過添加外分泌信號肽可以分泌共表達(dá)Fab蛋白于昆蟲細(xì)胞上清中，利用胞外的氧化環(huán)境，能夠指導(dǎo)Fab重鏈和輕鏈間二硫鍵的形成。

較佳地，在步驟(a)中，所述重組表達(dá)載體為pFastBacT1，包括：兩個啟動子、復(fù)制子、多克隆酶切位點、和兩個終止子。

較佳地，在步驟(a)中，F(xiàn)ab片段的Lc與Hc的N端的信號肽為外分泌信號肽Ac NPV gp64。較佳地，F(xiàn)ab片段的重鏈和輕鏈的啟動子皆為多角體基因啟動子(polyhedrin(PH)promoter)。

較佳地，在步驟(b)中，所述感受態(tài)為DH10Bac。較佳地，轉(zhuǎn)座菌斑篩選方法為藍(lán)白斑篩選法。

較佳地，在步驟(b)中，所述昆蟲細(xì)胞為Sf9細(xì)胞。較佳地，轉(zhuǎn)染試劑可為脂質(zhì)體cellfection，另外，轉(zhuǎn)染步驟中所用培養(yǎng)基可為Sf-900^TMII SFM培養(yǎng)基。

較佳地，在步驟(b)中，所述重組桿狀病毒P0擴(kuò)增病毒P1，即將200μL重組桿狀病毒P0加入100mL細(xì)胞密度為2×10⁶cells/ml的Sf9昆蟲細(xì)胞中，37℃搖床培養(yǎng)96h后離心獲得病毒P1。

在步驟(b)中放大培養(yǎng)細(xì)胞并表達(dá)所用的培養(yǎng)基為ESF AF培養(yǎng)基。

在步驟(c)中，所述純化依次包括：使用膜包進(jìn)行超濾濃縮和置換緩沖溶液；以及親和層析和分子篩介質(zhì)層析。

在步驟(c)中，所述親和柱層析的親和層析介質(zhì)為Protein A。

在步驟(c)中，所述分子篩介質(zhì)層析的分子篩層析介質(zhì)為Superdex 75。

附圖說明

圖1為CTLA-4抗體片段重組表達(dá)載體圖譜；

圖2為Protein A親和純化后的Fab SDS-PAGE電泳圖；其中的圖A為在非還原條件下電泳所得結(jié)果，圖B為還原條件下電泳所得結(jié)果；Fab為IgG1抗原結(jié)合區(qū)Hc和Lc二聚體，還原條件下為23kD兩條電泳條帶，非還原條件下在47kD處有單一電泳條帶；

圖3為分子篩層析純化后的Fab SDS-PAGE電泳圖，其中的圖A為在非還原條件下電泳所得結(jié)果，圖B為還原條件下電泳所得結(jié)果；

圖4為分子篩層析純化并濃縮后的Fab SDS-PAGE電泳圖，表明獲得的Fab抗體片段具有較高純度。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖和下述實施方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，應(yīng)理解，附圖及下述實施方式僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。

本發(fā)明運用基因工程等手段，利用桿狀病毒作為表達(dá)載體，利用昆蟲細(xì)胞作為宿主，表達(dá)全人源單克隆抗體Ipilimumab的Fab片段(在本文中，亦簡稱重組CTLA-4抗體片段、CTLA-4抗體Fab片段、CTLA-4抗體片段、CTLA-4片段、CTLA-4蛋白、或Fab片段等)。在一個示例中，本發(fā)明的制備方法包括：將分別帶有Ac NPV gp64信號肽的Fab片段的重鏈和輕鏈克隆至桿狀病毒載體pFastBacT1中，構(gòu)建重組表達(dá)載體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)座到感受態(tài)細(xì)胞DH10Bac中獲得重組Bacmid DNA并轉(zhuǎn)染至Sf9昆蟲細(xì)胞中獲得重組桿狀病毒，利用病毒感染sf9昆蟲細(xì)胞，分泌共表達(dá)Fab目的蛋白，離心獲得含目的蛋白的上清產(chǎn)物；對所得的蛋白進(jìn)行色譜柱純化，得到CTLA-4蛋白。以下，示例性地說明本發(fā)明的制備方法。

(1)重組表達(dá)載體的構(gòu)建

分別合成帶有信號肽的Fab片段的重鏈與輕鏈的基因，克隆于帶有雙啟動子的pFastBacT1載體內(nèi)，構(gòu)建CTLA-4抗體片段重組表達(dá)載體(Fab in pFastBacT1)。

優(yōu)選地，在Hc和Lc的N端各加上一個外分泌信號肽Ac NPV gp64。

在一個示例中，Lc之前添加信號肽Ac NPV gp64形成AcNPV gp64+Lc in pFastBacT1。優(yōu)選地，利用5'BamHI和3'EcoRI插入于第一個啟動子之后。

在另一個示例中，在Hc之前添加信號肽Ac NPV gp64形成AcNPV gp64+Hc in pFastBacT1。優(yōu)選地，利用5'XhoI和3'HindIII插入于第二個啟動子之后。

所構(gòu)建的CTLA-4抗體片段重組表達(dá)載體圖譜如圖1所示。由圖1可知，該重組表達(dá)載體包括：兩個昆蟲細(xì)胞啟動子、復(fù)制子、多克隆酶切位點和兩個終止子。

(2)Fab片段在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)

重組質(zhì)粒的制備：將所構(gòu)建的CTLA-4抗體片段重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)座至感受態(tài)細(xì)胞(例如DH10Bac)中，篩選重組菌斑，提取重組質(zhì)粒(重組Bacmid)。其中，轉(zhuǎn)座菌斑篩選方法可為藍(lán)白斑篩選法。

重組Bacmid轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞，轉(zhuǎn)染試劑可為脂質(zhì)體cellfection，培養(yǎng)基可為Sf-900^TMII SFM培養(yǎng)基，得到Fab-P0代病毒。轉(zhuǎn)染得到的P0代病毒進(jìn)一步擴(kuò)增病毒得到P1。在一個示例中，擴(kuò)增方法為：將200μL重組桿狀病毒P0加入100mL細(xì)胞密度為2×10⁶cells/ml的Sf9昆蟲細(xì)胞中，37℃搖床培養(yǎng)96h后離心獲得病毒P1。使用P1感染昆蟲細(xì)胞表達(dá)Fab蛋白。

(3)Fab的純化

Fab蛋白的表達(dá)為可溶性外分泌表達(dá)，表達(dá)所用的培養(yǎng)基可為ESF AF培養(yǎng)基，病毒擴(kuò)增感染細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞有感染跡象且細(xì)胞百分?jǐn)?shù)80％左右時收集細(xì)胞懸液，離心機3000g 4℃下離心10min，收集上清溶液，使用Vivaflow 200切向流超濾膜包將上清進(jìn)行濃縮并置換緩沖液，方便后續(xù)的分離與純化。然后進(jìn)行色譜柱純化，獲得高純度的Fab片段。優(yōu)選地，依次通過親和柱層析和分子篩介質(zhì)層析進(jìn)行純化。在一個示例中，親和柱層析的親和層析介質(zhì)為Protein A。在另一個示例中，分子篩介質(zhì)層析的分子篩層析介質(zhì)為Superdex 75。在純化過中，可以使用SDS-PAGE電泳分析蛋白純度。可以使用30kD Milipore超濾管濃縮蛋白。

(分析與檢測)

可以使用SDS-PAGE電泳分析目的蛋白Fab片段。圖2、3分別示出經(jīng)親和柱層析、分子篩介質(zhì)層析所獲得的蛋白的SDS-PAGE電泳圖，用以表征蛋白的純度。該兩幅圖中的圖A均為非還原條件，圖B均為還原條件。由圖2可知，F(xiàn)ab為IgG1抗原結(jié)合區(qū)Hc和Lc的二聚體，還原條件下在23kD處有兩條電泳條帶，從上至下分別為Hc和Lc，非還原條件下在47kD處有單一電泳條帶為Fab片段。圖4示出分子篩層析純化并濃縮后的Fab蛋白的SDS-PAGE電泳圖，其中泳道1樣品為非還原條件下處理，泳道2為還原條件下處理，由圖4可知縮后的Fab抗體片段的純度大于98％。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的優(yōu)點：

(1)本發(fā)明所制備的Fab片段分子量小，因此在到達(dá)腫瘤靶部位的過程中穿透力大；

(2)本發(fā)明所制備的Fab片段保留了全抗體對CTLA-4的高特異性和高親和力，并且其半衰期較同類藥物長，可以減少藥物的使用次數(shù)；

(3)昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白具有完整的生物學(xué)功能，能正確折疊并形成Fab分子間重要的二硫鍵，表達(dá)產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)及功能上接近天然蛋白；

(4)能進(jìn)行翻譯后的加工修飾：包括糖基化、磷酸化、酰基化、信號肽切除等；

(5)與其他真核表達(dá)系統(tǒng)相比，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)可以高效表達(dá)外源基因，表達(dá)量高；

(6)能容納大分子的插入片段：桿狀病毒毒?？梢詳U(kuò)大，能包裝大的基因片段并可以在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)多種外源基因；

(7)純化過程中，使用親和層析-分子篩層析法純化獲得純度大于98％的抗體蛋白，是一種操作簡單方便，低成本，高產(chǎn)出的抗體片段純化制備方法；

(8)本發(fā)明提供了一種CTLA-4抗體片段的制備方法，為獲得高質(zhì)量的單克隆抗體Fab片段奠定了基礎(chǔ)。

下面進(jìn)一步例舉實施例以詳細(xì)說明本發(fā)明。同樣應(yīng)理解，以下實施例只用于對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容作出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。下述示例具體的工藝參數(shù)等也僅是合適范圍中的一個示例，即本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過本文的說明做合適的范圍內(nèi)選擇，而并非要限定于下文示例的具體數(shù)值。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。

(1)重組質(zhì)粒的構(gòu)建

首先擴(kuò)增基因Lc，添加信號肽AcNPV gp64(苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒)將基因AcNPV gp64+Lc克隆至載體pFastbacT1(Thermo Fisher Scientific)，構(gòu)建質(zhì)粒AcNPV gp64+Lc in pFastBacT1。然后從模板質(zhì)粒Fab in pETDuet1(Shanghai Medicilon Inc)中擴(kuò)增基因Hc，添加信號肽AcNPVgp64，3’終止密碼子TAA，將基因AcNPV gp64+Hc克隆至載體pFastbacT1，構(gòu)建質(zhì)粒AcNPVgp64+Hc in pFastBacT1。最終從模板質(zhì)粒Ac NPV gp64+Hc in pFastBacT1中擴(kuò)增基因PH promoter+Ac NPV gp64+Hc，使用重組的方法將基因PH promoter+Ac NPV gp64+Hc克隆至載體AcNPV gp64+Lc in pFastBacT1，構(gòu)建質(zhì)粒Ac NPV gp64+Lc and Ac NPV gp64+Hc in pFastBacT1。

(2)Fab在Sf9昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)

Sf9昆蟲細(xì)胞(Thermo Fisher Scientific)在27℃，90rpm的條件下?lián)u瓶培養(yǎng)。當(dāng)Sf9昆蟲細(xì)胞濃度達(dá)到2.0×10⁶cells/ml時，以感染復(fù)數(shù)(MOI)為1pfu/cell的比例加入P1代病毒(即每升細(xì)胞加入20ml的P1病毒)，于27℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行病毒感染，培養(yǎng)基為ESF AF培養(yǎng)基(Expression systems)。Fab蛋白的表達(dá)為可溶性外分泌表達(dá)，病毒擴(kuò)增感染細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞有感染跡象且細(xì)胞百分?jǐn)?shù)80％左右時收集細(xì)胞懸液，離心機3000g 4℃離心10min，收集細(xì)胞上清。

(3)Fab表達(dá)上清的濃縮與緩沖液置換

Fab蛋白的表達(dá)為可溶性外分泌表達(dá)，離心收集的上清溶液，使用Vivaflow 200切向流超濾膜包進(jìn)行濃縮并置換緩沖液(50mmol/L Tris-HCl pH7.2，150mmol/L NaCl，10％Glycerol)，方便后續(xù)的分離與純化。

(4)色譜柱純化

第一步Protein A親和層析

1)色譜柱：親和層析介質(zhì)：Protein A親和填料(GE)；

2)Protein A親和柱的制備

3)樣品處理：將完成濃縮和置換緩沖溶液的上清溶液離心取上清；

4)緩沖液配置：緩沖液A：50mmol/L Tris-HCl pH7.2，150mmol/L NaCl，10％Glycerol，緩沖液B：0.1mol/L Glycine,pH 2.5；

5)純化過程：用緩沖液A預(yù)先平衡填料，樣品上樣后以緩沖液A平衡柱子，再用緩沖液B洗脫，Ep管收集并中和洗脫下的Fab蛋白至pH 7.0左右；

6)結(jié)果：收集目標(biāo)蛋白峰，測蛋白濃度計算回收率，SDS-PAGE分析蛋白純度(圖2)。結(jié)果表明該蛋白純度為大于90％。

第二步分子篩層析

1)色譜柱：HiLoad 16/60Superdex 75prep grade，美國GE公司；

2)樣品處理：通過Protein A親和層析洗脫的目標(biāo)蛋白利用截留分子量為30KD的超濾濃縮管濃縮至2-4ml；

3)緩沖液配置：緩沖液為50mmol/L Tris-HCl pH7.0，150mmol/L NaCl，10％Glycerol；

4)純化過程：用緩沖液預(yù)先平衡分子篩，上樣，以1ml/min進(jìn)行洗脫；

5)結(jié)果：收集目標(biāo)蛋白峰，樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳(圖3)。結(jié)果表明該蛋白純度大于98％。最后，對純化產(chǎn)物使用Millipore超濾系統(tǒng)超濾濃縮，截留分子量為30KD的再生纖維素膜包對純化后的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行脫鹽和濃縮，整個純化組合合理，操作簡單，工藝穩(wěn)定。SDS-PAGE分析蛋白純度(圖4)。