本發(fā)明屬于高分子材料領(lǐng)域，具體來說，涉及一種殼聚糖-海藻酸鹽多孔凝膠及其制備和應(yīng)用方法。

背景技術(shù)：

水凝膠是在水中溶脹并保持大量的水分而又不溶解的聚合物。高分子水凝膠是由高分子骨架、水、交聯(lián)劑組成的三維體系，具有復(fù)雜空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有著廣泛的應(yīng)用。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域：用作藥物釋放的載體，水凝膠兼?zhèn)鋬Υ嫠幬?、控制釋放速度、?qū)動釋放三種功能，既能調(diào)節(jié)制劑的強(qiáng)度和硬度，又能起到促進(jìn)分解、賦形的作用，還能遮蔽醫(yī)藥品的苦味和氣味，可用于口服、鼻腔、口腔、直腸、眼部、注射等給藥途徑。用作傷口敷料，水凝膠材料直接用于與人體組織接觸，可防止體外微生物的感染，抑制體液的損失，傳輸氧到傷口可加速上皮細(xì)胞生長，加速新微血管增生，隔絕細(xì)菌侵犯，抑制細(xì)菌繁殖，促進(jìn)傷口的愈合。水凝膠因具有生物相容性、生物降解性、高含水量和細(xì)胞膜粘附性而應(yīng)用于組織工程。

近年來，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，對于由外傷、意外或者癌癥所帶來的器官或組織的損傷的修復(fù)技術(shù)得到了極大的提高，然而，器官或組織的移植仍然是被病人廣泛接受的治療方法。由于自體移植會給患者帶來二次傷害和痛苦，異體移植有很多諸如排異、器官來源受限等問題，運用組織工程(Tissue engineering)的方法來減少病痛和排異給治療帶來了很大的希望。組織工程的方法主要是用可降解的三維(3-D)人工材料的結(jié)構(gòu)來誘導(dǎo)病人自體細(xì)胞的生長，達(dá)到器官或組織再生的目的。當(dāng)新的器官和組織完成再生后，人工材料也隨著時間降解完畢。

雖然對于不同的器官或組織需要不同形態(tài)特點的材料，但是這些3-D誘導(dǎo)材料卻有一些共同的要求：(1)3-D材料要與被替代的組織具有相似性；(2)這些材料需要具備開孔的結(jié)構(gòu)并且孔的尺寸要合適；(3)材料要有合適的機(jī)械性能使之可以維持預(yù)先設(shè)計的組織結(jié)構(gòu)并且可以承受應(yīng)用于原始組織的裝載物；(4)材料需要時可降解的并且要具有合適的降解速率；(5)材料需要不會引起發(fā)炎癥狀或者可以減輕發(fā)炎癥狀。綜上，具有可降解性、良好生物相容性和良好的機(jī)械性能的多孔水凝膠就是一種十分優(yōu)良的組織工程3-D誘導(dǎo)材料。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

技術(shù)問題：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：提供一種殼聚糖-海藻酸鹽多孔凝膠及其制備和應(yīng)用方法，該水凝膠具有多重網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)，具有良好的機(jī)械性能、溶脹性能和降解性能，使得其在組織工程支架中具有很好的應(yīng)用。

技術(shù)方案：為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

第一方面，本發(fā)明實施例提供一種殼聚糖-海藻酸鹽多孔凝膠，該多孔凝膠按照質(zhì)量份數(shù)，包括以下組分：

殼聚糖：1～3份，

海藻酸鹽：1～3份，

一價金屬鹽溶液：94～98份，

殼聚糖的天然交聯(lián)劑、海藻酸鹽的離子交聯(lián)劑、發(fā)泡劑，以及表面活性劑；

一價金屬鹽溶液的質(zhì)量濃度為0.01～0.5％；

所述殼聚糖的天然交聯(lián)劑的質(zhì)量是所述殼聚糖質(zhì)量的0.5～5％；

所述海藻酸鹽的離子交聯(lián)劑為二價金屬鹽，所述二價金屬鹽質(zhì)量是所述海藻酸鹽質(zhì)量的2～30％；

所述發(fā)泡劑的質(zhì)量是多孔凝膠總質(zhì)量的0.1～15％；

所述表面活性劑的質(zhì)量是多孔凝膠總質(zhì)量的0.1～15％。

結(jié)合第一方面，作為第一種可能實施方案，所述的殼聚糖的天然交聯(lián)劑為京尼平。

結(jié)合第一方面，作為第二種可能實施方案，所述的二價金屬鹽為鈣鹽、鍶鹽或者鋇鹽，且金屬鹽具有可溶性或者微溶性。

結(jié)合第一方面，作為第三種可能實施方案，所述的發(fā)泡劑是碳酸鹽或者酸式碳酸鹽。

結(jié)合第一方面，作為第四種可能實施方案，所述的表面活性劑為陽離子型表面活性劑、陰離子型表面活性劑或者非離子表面活性劑。

結(jié)合第一方面，作為第五種可能實施方案，所述的一價金屬鹽溶液為氯化鈉溶液或者氯化鉀溶液。

結(jié)合第一方面，作為第六種可能實施方案，所述的多孔凝膠中形成三重網(wǎng)絡(luò)，分別為殼聚糖和殼聚糖的天然交聯(lián)劑形成的共價交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，海藻酸鹽和海藻酸鹽的離子交聯(lián)劑之間形成的離子交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，以及殼聚糖上的-NH₂和海藻酸鈉上的-COOH之間的相互作用形成的第三重網(wǎng)路。

第二方面，本發(fā)明實施例提供一種殼聚糖-海藻酸鹽多孔凝膠的制備方法，該制備方法包括以下步驟：

步驟10)將質(zhì)量份數(shù)為1～3份的殼聚糖加入47～49份的一價金屬鹽的乙酸溶液中，攪拌均勻，使殼聚糖完全溶解，形成殼聚糖溶液；

將質(zhì)量份數(shù)為1～3份的海藻酸鹽加入47～49份的一價金屬鹽溶液中，攪拌均勻，使海藻酸鹽完全溶解，形成海藻酸鹽液溶；

步驟20)攪拌海藻酸鹽溶液，向海藻酸鹽溶液中加入殼聚糖的天然交聯(lián)劑，表面活性劑，然后加入發(fā)泡劑、殼聚糖溶液，最后加入海藻酸鈉的離子交聯(lián)劑，攪拌1～15min，加冰袋冷卻超聲1～60min，隨后用封口膜封裝，形成均勻的發(fā)泡體系；

步驟30)將步驟20)形成的發(fā)泡體系于15～60℃水浴培養(yǎng)4～48h，得到殼聚糖-海藻酸鈉多孔凝膠。

結(jié)合第二方面，作為第一種可能實施方案，所述一價金屬鹽溶液的質(zhì)量濃度為0.01～0.5％；

所述殼聚糖的天然交聯(lián)劑的質(zhì)量是所述殼聚糖質(zhì)量的0.5～5％；

所述海藻酸鹽的離子交聯(lián)劑為二價金屬鹽，所述二價金屬鹽質(zhì)量是所述海藻酸鹽質(zhì)量的2～30％；

所述發(fā)泡劑的質(zhì)量是多孔凝膠總質(zhì)量的0.1～15％；

所述表面活性劑的質(zhì)量是多孔凝膠總質(zhì)量的0.1～15％。

第三方面，本發(fā)明實施例提供一種所述的殼聚糖-海藻酸鹽多孔凝膠作為生物醫(yī)用材料的應(yīng)用。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所制備出的殼聚糖海藻酸鈉的多孔凝膠，具有良好的機(jī)械性能。與單一的海藻酸鹽的水凝膠或者單獨的殼聚糖水凝膠相比，本發(fā)明所制備出的多孔凝膠在機(jī)械性能上有很大的提高。本發(fā)明制備的殼聚糖海藻酸鈉多孔凝膠，具有強(qiáng)于殼聚糖水凝膠、海藻酸鈉水凝膠的強(qiáng)度，同時又具有多孔結(jié)構(gòu)，此外還具有良好的溶脹和降解性能。因此，本發(fā)明的多孔凝膠可以在組織工程支架方面將具有良好的應(yīng)用。

附圖說明

圖1是本發(fā)明中所制備的多孔凝膠中形成的三重互穿網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)圖示意圖；

圖2是本發(fā)明實施例1-6所制備的凝膠的多孔結(jié)構(gòu)顯微鏡圖；

圖3是本發(fā)明實施例1-6所制備的凝膠進(jìn)行機(jī)械性能測試的線條圖；

圖4是本發(fā)明實施例1以及對比例所制備的多孔凝膠在不同pH下的溶脹性能圖；

圖5是本發(fā)明實施例1以及對比例所制備的多孔凝膠在pH7.4下的降解性能圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，以便本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但以下實施例并不以任何形式限制本發(fā)明。

本發(fā)明實施例的殼聚糖-海藻酸鹽多孔凝膠，按照質(zhì)量份數(shù)，包括以下組分：

殼聚糖：1～3份，

海藻酸鹽：1～3份，

一價金屬鹽溶液：94～98份，

殼聚糖的天然交聯(lián)劑、海藻酸鹽的離子交聯(lián)劑、發(fā)泡劑，以及表面活性劑；

一價金屬鹽溶液的質(zhì)量濃度為0.01～0.5％；

所述殼聚糖的天然交聯(lián)劑的質(zhì)量是所述殼聚糖質(zhì)量的0.5～5％；

所述海藻酸鹽的離子交聯(lián)劑為二價金屬鹽，所述二價金屬鹽質(zhì)量是所述海藻酸鹽質(zhì)量的2～30％；

所述發(fā)泡劑的質(zhì)量是多孔凝膠總質(zhì)量的0.1～15％；

所述表面活性劑的質(zhì)量是多孔凝膠總質(zhì)量的0.1～15％。

上述實施例中，作為優(yōu)選，所述的殼聚糖的天然交聯(lián)劑為京尼平(genipin)。所述的二價金屬鹽為鈣鹽、鍶鹽或者鋇鹽，且金屬鹽具有可溶性或者微溶性。可溶性的鈣鹽、鍶鹽、鋇鹽，通過離子交聯(lián)海藻酸鈉結(jié)構(gòu)中的G段或MG段形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)；微溶性的鈣鹽、鍶鹽、鋇鹽，由于已溶解出的部分離子與海藻酸鈉發(fā)生交聯(lián)，從而促進(jìn)微溶性鹽在水中的溶解和電離，最終使微溶性鹽中的二價離子全部釋放出來，參與海藻酸鈉的交聯(lián)過程。所述的發(fā)泡劑是碳酸鹽或者酸式碳酸鹽。所述的表面活性劑為陽離子型表面活性劑、陰離子型表面活性劑或者非離子表面活性劑。所述的一價金屬鹽溶液為氯化鈉溶液或者氯化鉀溶液。

上述殼聚糖-海藻酸鹽多孔凝膠中形成三重網(wǎng)絡(luò)，分別為殼聚糖和殼聚糖的天然交聯(lián)劑形成的共價交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，海藻酸鹽和海藻酸鹽的離子交聯(lián)劑之間形成的離子交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，以及殼聚糖上的-NH₂和海藻酸鈉上的-COOH之間的相互作用形成的第三重網(wǎng)路。

上述殼聚糖-海藻酸鹽多孔凝膠的制備方法，該制備方法包括以下步驟：

步驟10)將質(zhì)量份數(shù)為1～3份的殼聚糖加入47～49份的一價金屬鹽的乙酸溶液中，攪拌均勻，使殼聚糖完全溶解，形成殼聚糖溶液；將質(zhì)量份數(shù)為1～3份的海藻酸鹽加入47～49份的一價金屬鹽溶液中，攪拌均勻，使海藻酸鹽完全溶解，形成海藻酸鹽液溶。

步驟20)攪拌海藻酸鹽溶液，向海藻酸鹽溶液中加入殼聚糖的天然交聯(lián)劑，表面活性劑，然后加入發(fā)泡劑、殼聚糖溶液，最后加入海藻酸鈉的離子交聯(lián)劑，攪拌1～15min，加冰袋冷卻超聲1～60min，隨后用封口膜封裝，形成均勻的發(fā)泡體系。

步驟30)將步驟20)形成的發(fā)泡體系于15～60℃水浴培養(yǎng)4～48h，得到殼聚糖-海藻酸鈉多孔凝膠。

上述的殼聚糖-海藻酸鹽多孔凝膠可作為生物醫(yī)用材料。

如圖1所示，以Ca²⁺作為離子交聯(lián)劑、NaCl作為金屬鹽為例，按照上述制備方法制備的多孔凝膠內(nèi)部形成了三重網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，包括殼聚糖和京尼平形成的共價交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，海藻酸鈉和離子交聯(lián)劑之間形成的離子交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)以及殼聚糖上的-NH₂和海藻酸鈉上的-COOH之間的相互作用形成的第三重網(wǎng)絡(luò)。

在制備過程中，殼聚糖的天然交聯(lián)劑可以與殼聚糖發(fā)生化學(xué)交聯(lián)，形成第一重交聯(lián)網(wǎng)路，二價金屬離子可以與海藻酸鹽結(jié)構(gòu)中的G段和MG段交聯(lián)形成第二重交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。同時當(dāng)將殼聚糖和海藻酸鹽混合后，由于二者因靜電相互作用在相界面形成聚電解質(zhì)，而不能使二者形成均勻的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。在該體系中，一價金屬鹽的加入，減弱了殼聚糖和海藻酸鹽的相互作用，使得通過攪拌海藻酸鹽和殼聚糖被混合均勻，同時海藻酸鹽和殼聚糖之間仍存在離子的相互作用，形成第三重的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。因為三重網(wǎng)絡(luò)的形成，使得多孔凝膠能夠具有優(yōu)良的多孔結(jié)構(gòu)、溶脹性能和降解性能的同時，也能具有良好的機(jī)械性能。

下面通過試驗，來具體驗證本發(fā)明凝膠具有良好的多孔結(jié)構(gòu)、溶脹性能、降解性能以及機(jī)械性能。

試驗提供六個實施例和三個對比例。六個實施例都是按照本發(fā)明的制備方法制備凝膠(CA porous)。各實施例中各物質(zhì)的用量，單位：mg，如表1所示；各物質(zhì)采用的具體種類如表2所示。三個對比例分別為對比例1：殼聚糖凝膠(chitosan)；對比例2：海藻酸鈉凝膠(alginate)；對比例3：殼聚糖海藻酸鈉復(fù)合凝膠(CA)。

表1

表2

對上述6個實施例的多孔凝膠進(jìn)行顯微鏡拍攝，如圖2所示。在圖2中，圖A對應(yīng)實施例1的顯微鏡圖，圖B對應(yīng)實施例2的顯微鏡圖，圖C對應(yīng)實施例3的顯微鏡圖，圖D對應(yīng)實施例4的顯微鏡圖，圖E對應(yīng)實施例5的顯微鏡圖,圖F對應(yīng)實施例6的顯微鏡圖。從圖2可以看出：隨發(fā)泡劑和表面活性劑量的增加，殼聚糖-海藻酸鈉多孔水凝膠中的氣泡和孔不斷的增加。實施例6中，水凝膠體系中的孔最多，孔大小也最均勻。

對上述實施例和對比例，分別進(jìn)行機(jī)械性能、溶脹性能和降解性能測試。

其中，機(jī)械性能測試用旋轉(zhuǎn)流變儀，30mm的夾具，在25℃，1Hz的頻率下，在0.1rad s^-1-110rad s^-1下分別測試了所制備的chitosan-genipin的水凝膠、海藻酸鈉-Ca²⁺的水凝膠、chitosan-海藻酸鈉復(fù)合水凝膠和不同發(fā)泡劑用量的多孔凝膠的機(jī)械性能。用儲存模量(G’)和損耗模量(G”)來表示。結(jié)果如圖3所示。從圖3中的儲存模量(G’)曲線中可以明顯的看出，實施例1的機(jī)械性能最優(yōu)。

溶脹性能測試按照如下方法進(jìn)行：將溶脹平衡的所制備水凝膠用刀片切成樣品塊，每種水凝膠切出12份，冷凍干燥，稱重后，分別放入pH1.2的HCl溶液、pH5.6的乙酸-乙酸鈉的緩沖溶液、pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液和pH9.3的硼酸鹽緩沖溶液中，每種溶液中放3個平行樣。溶脹24h后，用濾紙吸去表面的水分，稱重獲得水凝膠溶脹后的濕重，每隔2h再稱重，直至質(zhì)量不再增加為止，獲得水凝膠的干重。通過式(1)計算水凝膠在不同pH條件下的溶脹性能。

其中：Swellingratio表示水凝膠的溶脹性能；w_d表示水凝膠的干重；w_s表示水凝膠溶脹后的濕重；

通過式(1)計算每種溶液中的3個平行樣的平均溶脹性能作為該水凝膠在該溶液中的溶脹性能。

圖4示出了殼聚糖凝膠(chitosan)、海藻酸鈉凝膠(algiante)、殼聚糖海藻酸鈉復(fù)合凝膠(CA)以及本發(fā)明實施例1所制備出的多孔凝膠(CA porous)在不同pH值下的溶脹性能。從圖4可以看出，本發(fā)明實施例提供的多孔凝膠的在不同pH環(huán)境下，具有良好的溶脹性能。

降解性能測試按照如下方法進(jìn)行：將溶脹平衡的水凝膠切出的樣品塊，每種水凝膠取3份，分別放入到每個孔盛有5mL的1.5ug/mL的溶菌酶溶液的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每天更換新的溶菌酶溶液，確保酶的活性。定時取出水凝膠樣品，用濾紙吸取表面的水分后，稱量重量，體外降解率用凝膠失重率(Weightloss％)來表示，如式(2)所示。

其中：w₀表示水凝膠的原始質(zhì)量，w_t表示降解時間為t后，水凝膠的質(zhì)量。

圖5提供了殼聚糖凝膠(chitosan)、海藻酸鈉凝膠(algiante)、殼聚糖海藻酸鈉復(fù)合凝膠(CA)以及本發(fā)明實施例1所制備出的多孔凝膠(CA porous)在pH7.4的PBS緩沖溶液中的降解性能示意圖。從圖5可以看出，本發(fā)明實施例制備的多孔凝膠既能在前期保持一定的穩(wěn)定性，又在后期表現(xiàn)出較高的降解性能。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述具體實施例的限制，上述具體實施例和說明書中的描述只是為了進(jìn)一步說明本發(fā)明的原理及其效果，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)的范圍由權(quán)利要求書及其等效物界定。