本發(fā)明屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種彎曲乳桿菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：高尿酸血癥是由于人體內(nèi)嘌呤代謝紊亂，尿酸生成過多或尿酸排泄減少，造成血液中的尿酸濃度過度超出正常范圍的一種機(jī)體狀態(tài)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，高尿酸血癥與痛風(fēng)、高血壓、高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、肥胖、胰島素抵抗等的發(fā)生密切相關(guān)。雖然高尿酸血癥與基因、環(huán)境、性別、年齡及生活飲食習(xí)慣等因素都有關(guān)，發(fā)病原因較為復(fù)雜，但是隨著人們物質(zhì)生活的豐富和飲食結(jié)構(gòu)的變化，高尿酸血癥及其相關(guān)病癥發(fā)病率在我國快速增加，已成為現(xiàn)代人的高發(fā)疾病之一。目前高尿酸血癥的治療主要是服用藥物和飲食限制。主要是服用降尿酸藥物，如別嘌呤醇、丙磺舒、苯溴馬隆等通過抑制尿酸生成或促進(jìn)尿酸排泄以達(dá)到降血尿酸水平的目的，同時(shí)輔以飲食理療，限制攝入高嘌呤食物。藥物治療存在過敏以及個(gè)體差異限制等問題。而食物中嘌呤高的種類眾多，如紅肉、肝腎胰等內(nèi)臟、魚類、禽類、啤酒等。另外，鮮味劑中的雞精、蠔油、魚露等的主要成分為5’-呈味核苷二鈉的嘌呤類。飲食限制也就意味著改變生活方式，患者的生活質(zhì)量將受到嚴(yán)重的影響。人體吸收嘌呤的主要形式是嘌呤核苷酸，通過口服具有高效分解嘌呤核苷的微生態(tài)菌劑，讓其在腸道內(nèi)分解攝入食物中的嘌呤核苷，可以降低腸道對(duì)嘌呤核苷的吸收量，從而達(dá)到降低血尿酸水平的目的。因此，用乳酸菌對(duì)高尿酸血癥進(jìn)行輔助治療和預(yù)防可以避免或減輕嚴(yán)格飲食限制對(duì)患者正常生活的影響。開發(fā)輔助治療高尿酸血癥的微生態(tài)菌劑的關(guān)鍵就是獲得具有高效降解嘌呤核苷的食品安全級(jí)微生物。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一株具有高效降解嘌呤核苷的乳酸菌。一種彎曲乳桿菌，分類命名為彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)5-1，保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)的中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2016年8月22日，保藏號(hào)為CGMCCNo.12891。該菌株形態(tài)學(xué)特征：在MRS固體培養(yǎng)基菌落為圓形，且邊緣整齊，乳白色，不透明，表面濕潤光滑，不產(chǎn)色素。該菌株生理及生化特性：菌株的O-F反應(yīng)結(jié)果為發(fā)酵型，能同化麥芽糖、蔗糖和菊糖；不能同化甘露醇、山梨醇、棉子糖、乳糖、纖維二糖和水楊苷；對(duì)七葉苷的反應(yīng)結(jié)果為可疑，1％尿酸鈉的反應(yīng)結(jié)果是陰性。該菌株具有高效降解嘌呤核苷的能力，該菌株可以在腸道內(nèi)分解攝入食物中的嘌呤核苷，從而減少小腸對(duì)嘌呤核苷的吸收量。該菌株可以耐受人體通常胃部酸性環(huán)境(pH3.0)。該菌株可以耐受人體小腸正常膽鹽濃度，在小腸膽汁的濃度范圍(0.03％～0.3％)內(nèi)具有良好的耐受性。本發(fā)明又提供了一種包含所述彎曲乳桿菌的菌劑。優(yōu)選的，所述彎曲乳桿菌的濃度不小于106cfu/mL。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述彎曲乳桿菌的濃度不小于107cfu/mL。本發(fā)明還提供了所述的彎曲乳桿菌在制備預(yù)防高尿酸血癥的飲用水添加物、食品添加物或飲料添加物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了所述的彎曲乳桿菌在制備治療和預(yù)防高尿酸血癥的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明篩選獲得了一株彎曲乳桿菌，命名為彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)5-1，該菌株具有高效降解嘌呤核苷的能力，同時(shí)可以耐受人體正常條件下的酸性環(huán)境和膽鹽濃度，可以在腸道內(nèi)分解攝入食物中的嘌呤核苷，從而減少小腸對(duì)嘌呤核苷的吸收。因此彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)5-1是開發(fā)輔助治療高尿酸血癥的微生態(tài)菌劑的良好菌株。附圖說明圖1為彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)5-1菌株在MRS培養(yǎng)基中的生長曲線圖；圖2為彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)5-1菌株耐酸性檢測(cè)結(jié)果圖；圖3為彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)5-1菌株耐膽鹽能力檢測(cè)結(jié)果圖，其中不同百分比為膽鹽添加的量；圖4為彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)5-1菌株對(duì)人工胃腸液耐受能力檢測(cè)結(jié)果圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)5-1菌種的分離篩選及純化鑒定。1、乳酸菌的分離將從浙江省寧波市的超市購買的泡菜充分混勻后，吸取泡菜汁，用0.9％NaCl無菌水溶液稀釋合適的倍數(shù)后，涂布在MRS固體平板上，30℃靜置培養(yǎng)48h，獲得單菌落。2、乳酸菌菌株的篩選從平板上挑取單菌落，接種于MRS培養(yǎng)基(蛋白胨10g，酵母提取物5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，乙酸鈉5g，檸檬酸二銨2g，吐溫801mL，硫酸鎂0.58g，硫酸錳0.05g，磷酸氫二鉀2g，瓊脂15～17g，加水至1000mL，調(diào)pH至6.2，121攝氏度滅菌20分鐘。)中，于30℃靜置培養(yǎng)24h。以1％的接種量傳代2次活化菌種，作為種子培養(yǎng)基。將種子培養(yǎng)基以1％的接種量接種到MRS培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)48h后，取2mL培養(yǎng)液，于4℃、4000r/min離心10min收集菌體。用無菌的0.9％NaCl溶液清洗菌體2次。向清洗后的菌體中加入750mL的反應(yīng)液(含有12.6mM肌苷和12.6mM鳥苷的0.1M、pH7.0K3PO4溶液)，重懸菌體后置于恒溫混勻儀中(37℃，800r/min)反應(yīng)1h。反應(yīng)后迅速將反應(yīng)液置于沸水浴中5min，終止反應(yīng)。10000r/min離心2min，除去菌體，收集上清液。用HPLC法測(cè)定上清液中肌苷和鳥苷的含量。按如下公式計(jì)算肌苷和鳥苷的降解率：降解率＝(C0－C1)÷C0×100％，其中C0為母液中的濃度，C1為殘留的濃度(濃度單位均為g/L)。肌苷和鳥苷測(cè)定條件：反相色譜柱為HypersilODS2C18(4.6mm×250mm)；流動(dòng)相為0.01MKH2PO4溶液∶甲醇＝5∶95(V/V)；流速為1mL/min；柱溫為30℃；測(cè)定波長為260nm。通過上述分離和篩選獲得的乳酸菌，其中一株對(duì)肌苷和鳥苷的降解率最高，分別達(dá)到89.37％和93.20％。將其編號(hào)為菌株5-1，形態(tài)學(xué)特征：在MRS固體培養(yǎng)基菌落為圓形，且邊緣整齊，乳白色，不透明，表面濕潤光滑，不產(chǎn)色素。3、菌株鑒定3.1、菌株5-1的O-F反應(yīng)和糖類利用特性O(shè)/F(氧化/發(fā)酵)反應(yīng)即葡萄糖代謝類型鑒別實(shí)驗(yàn)，觀察細(xì)菌對(duì)葡萄糖分解過程中是利用分子氧(氧化型)，還是無氧降解(發(fā)酵型)或者不分解葡萄糖(產(chǎn)堿型)。菌株5-1的O-F反應(yīng)結(jié)果為發(fā)酵型，能同化麥芽糖、蔗糖和菊糖；不能同化甘露醇、山梨醇、棉子糖、乳糖、纖維二糖和水楊苷；對(duì)七葉苷的反應(yīng)結(jié)果為可疑，1％尿酸鈉的反應(yīng)結(jié)果是陰性。3.2、菌株5-1的16SrDNA測(cè)序用TaKaRaMiniBESTBacteriaGenomicDNAExtractionKit試劑盒提取菌株5-1的基因組，并用PCR擴(kuò)增其16SrDNA的基因片段。擴(kuò)增引物序列為，16sF：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；16sR：GGCTACCTTGTTACGACTT。將擴(kuò)增產(chǎn)物委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。16SrDNA序列測(cè)定結(jié)果如SEQIDNo.1所示。根據(jù)糖類利用特性在《伯杰氏細(xì)菌手冊(cè)(第八版)》中對(duì)比的結(jié)果和16SrDNA測(cè)序結(jié)果在Genebank中進(jìn)行BLAST分析的結(jié)果，菌株5-1鑒定為彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)，所以將菌株5-1命名為彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)5-1。將彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)5-1保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)的中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNo.12891。實(shí)施例2彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)5-1在MRS培養(yǎng)基中的生長曲線。將活化好的彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)5-1菌株，以1％的接種量接種到MRS培養(yǎng)基中30℃靜置培養(yǎng)。測(cè)定不同生長時(shí)間的菌體OD600值和培養(yǎng)液的pH值。測(cè)定結(jié)果如圖1所示。彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)5-1在5～18h處于對(duì)數(shù)生長期，這時(shí)期菌體生長速度最快，乳酸大量生成(發(fā)酵液pH迅速降低)。18h后，菌體生長進(jìn)入平臺(tái)期，此時(shí)菌體生長速度減緩，趨于穩(wěn)定，發(fā)酵液pH維持在4左右，說明菌株產(chǎn)酸能力在進(jìn)入平臺(tái)期后受到了抑制。此外，在74h以內(nèi)發(fā)酵液OD600值都能維持比較穩(wěn)定的狀態(tài)。實(shí)施例3彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)5-1的藥敏譜。采用抗菌藥物藥敏紙片(杭州微生物試劑有限公司)測(cè)定彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)5-1的藥敏譜。將200μL菌體培養(yǎng)液均勻涂布到MRS固體平板上，在每個(gè)平板上放置3片藥物敏感紙片，30℃培養(yǎng)48h后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。表1顯示彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)5-1對(duì)不同類抗生素的敏感性結(jié)果?？梢钥闯?，彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)5-1對(duì)不同的抗生素表現(xiàn)出了不同的敏感性，對(duì)苯唑西林、頭孢氨芐、四環(huán)素類(米諾環(huán)素除外)、氨基糖苷類、碳青霉烯類、喹諾酮類、糖肽類、單環(huán)內(nèi)酰胺類、氯霉素和利福平比較不敏感，抑菌圈直徑只在藥紙片的直徑(5.32±0.23mm)附近，而對(duì)頭孢類的頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢呋辛和頭孢唑林及青霉素類的氨芐西林、哌拉西林和羧芐西林則比較敏感，抑菌圈直徑在17mm以上。表1實(shí)施例4彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)5-1耐酸和耐膽鹽能力。1、耐酸能力試驗(yàn)將活化好的菌株分別置于pH為6.2(對(duì)照組)、2、3和4的MRS培養(yǎng)基中，30℃下處理1h、2h、3h和4h后，進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)。彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)5-1的耐酸能力如圖2所示，雖然pH2.0的酸性環(huán)境對(duì)其存活有較大影響，但在pH3.0的條件下處理4h該菌株能夠保持107cfu/mL以上的活菌數(shù)；而通常胃酸pH在3.0左右，食物通過胃的時(shí)間一般為1～2，由此可說明，彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)5-1具備了抵抗多數(shù)條件下人體酸性環(huán)境的能力。2、耐膽鹽能力試驗(yàn)將活化好的菌株分別置于牛膽粉濃度分別為0(對(duì)照組)、0.1％、0.2％、0.3％、0.6％和0.9％的MRS培養(yǎng)基中，30℃下處理1h、2h、3h和4h后，進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)。人體小腸中膽汁的濃度范圍在0.03％～0.3％。能在正常生理膽鹽濃度中生長和進(jìn)行代謝的乳酸菌被認(rèn)為是能在腸道轉(zhuǎn)運(yùn)過程中存活。結(jié)果如圖3所示，在膽鹽濃度≤0.3％時(shí)，彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)5-1的活菌數(shù)保持在107cfu/mL以上，說明彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)5-1可以耐受人體正常膽汁濃度，具備在腸道中生存所需的膽鹽耐受能力。實(shí)施例5彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)5-1在空腹和飽腹?fàn)顟B(tài)下對(duì)人工消化液的耐受性。1、相關(guān)人工消化液營養(yǎng)液(1L)：阿拉伯半乳糖，1g；膠質(zhì)，2g；木聚糖，1g；土豆淀粉，3g；葡萄糖，0.4g；酵母粉，3g；蛋白胨，1g；粘蛋白，4g；L-半胱氨酸，0.5g。人工胃液：3.33％胃蛋白酶，pH2或3。人工腸液(1L)：NaHCO3，12.5g；膽鹽，6.0g；胰酶，0.9g，pH6.8?？崭?fàn)顟B(tài)：不加營養(yǎng)液的人工胃液(pH2)和人工腸液。飽腹?fàn)顟B(tài)：加有營養(yǎng)液成分的人工胃液(pH3)和人工腸液。2、腸道模擬處理人工消化液(空腹和飽腹兩個(gè)狀態(tài))耐受性的測(cè)定：取30℃靜置培養(yǎng)30h的菌液1mL，4℃、4000r/min離心10min，去掉上清，將菌體懸浮于1mL的人工胃液中處理2h(37℃，800r/min)；離心菌體，棄上清，將菌體懸浮在1mL人工腸液中處理2h(37℃，800r/min)后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，原菌液作對(duì)照。結(jié)果如圖4所示。雖然在空腹時(shí)彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)5-1存活能力不高，活菌數(shù)只有103cfu/mL左右，主要是因?yàn)槠湓趐H2的酸性環(huán)境中耐受性較弱(圖3)。但在飽腹?fàn)顟B(tài)下，彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)5-1表現(xiàn)出比較強(qiáng)的存活能力，活菌數(shù)在107cfu/mL以上，明顯高于活性乳桿菌在腸道發(fā)揮其益生作用所要求的菌體數(shù)(1×106cfu/mL)。以上結(jié)果說明彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)5-1適宜在飯后攝取，以便使其能更好地發(fā)揮益生功能。實(shí)施例6彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)5-1在飽腹的人工腸液中嘌呤物質(zhì)降解能力。離心收集2mL菌體培養(yǎng)液，用滅菌生理鹽水洗滌2次，將菌體懸浮于750mL含有濃度都為12.6mM的肌苷和鳥苷的緩沖液和飽腹人工腸液中反應(yīng)(37℃，800r/min)，于1h后測(cè)定肌苷和鳥苷的降解率。對(duì)照組不加菌體。從表2結(jié)果可知，與在緩沖液中一樣，彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)5-1在飽腹的人工腸液中同樣展現(xiàn)出了高效的肌苷和鳥苷降解能力。表2濃度(mM)肌苷降解率(％)鳥苷降解率(％)緩沖液89.37±1.5993.20±0.92飽腹人工腸液83.44±3.3686.36±3.08SEQUENCELISTING<110>浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院<120>一種彎曲乳桿菌及其應(yīng)用<130><160>3<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1478<212>DNA<213>彎曲乳桿菌（Lactobacilluscurvatus）<400>1gccccttgcggggtgctaataatgcaagtcgaacgcactctcgttagattgaagaagctt60gcttctgattgataacatttgagtgagtggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctg120ccctaaagtgggggataacatttggaaacagatgctaataccgcataaaacctagcaccg180catggtgcaaggttgaaagatggtttcggctatcactttaggatggacccgcggtgcatt240agttagttggtgaggtaaaggctcaccaagaccgtgatgcatagccgacctgagagggta300atcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaat360cttccacaatggacgaaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcgga420tcgtaaaactctgttgttggagaagaacgtatttgatagtaactgatcaggtagtgacgg480tatccaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggc540aagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggtttcttaagtctgatgt600gaaagccttcggctcaaccgaagaagtgcatcggaaactgggaaacttgagtgcagaaga660ggacagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtgg720cgaaggcggctgtctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcaaacag780gattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgagtgctaggtgttggagggtttcc840gcccttcagtgccgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggt900tgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcga960agcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctttgaccactctagagatagagctt1020tcccttcggggacaaagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatg1080ttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattactagttgccagcatttagttgggc1140actctagtgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggacgacgtcaaatcatcat1200gccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaacgagtcgcgagacc1260gcgaggtttagctaatctcttaaaaccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcc1320tacatgaagccggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccg1380ggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccaaagccggtgaggt1440aaccttcggagccagccgtctaaagtggaccagtgggg1478<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2agagtttgatcmtggctcag20<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>3ggctaccttgttacgactt19當(dāng)前第1頁1 2 3