本發(fā)明涉及生產(chǎn)ω-官能化羧酸酯的生物技術(shù)方法。具體而言，所述方法可以使用作為起始材料的烷烴和遺傳修飾的細(xì)胞來將烷烴轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的ω-官能化羧酸酯。

背景技術(shù)：

ω-官能化羧酸和相應(yīng)的酯，包括ω-氨基羧酸及其相應(yīng)的內(nèi)酰胺，諸如ω-氨基月桂酸、ω-氨基十一烷酸、月桂內(nèi)酰胺(laurolactame)等，是用于生產(chǎn)高性能聚酰胺的重要單體。已經(jīng)用于從石油化學(xué)或可再生原料生產(chǎn)這些單體的一些現(xiàn)有化學(xué)技術(shù)包括：

i)從月桂酸甲酯(由棕櫚仁或椰子油制備的生物柴油餾分)生產(chǎn)ω-氨基月桂酸

ii)從蓖麻油酸(制備自蓖麻油)生產(chǎn)ω-氨基十一烷酸

iii)從丁二烯生產(chǎn)月桂內(nèi)酰胺

盡管所有這三種生產(chǎn)方法都保持競爭性，但它們在給定地點(diǎn)和時(shí)間點(diǎn)的競爭性取決于許多因素，包括原材料成本和運(yùn)行方法的能源成本。

存在本領(lǐng)域已知的幾種生產(chǎn)ω-官能化羧酸和/或其酯的生物技術(shù)手段。例如，能夠從用作底物的羧酸生產(chǎn)ω-官能化羧酸的遺傳修飾的細(xì)胞先前已經(jīng)至少描述于wo2009077461和ep2322598中。wo2011008232中描述了使用假絲酵母細(xì)胞的非常類似的程序，其中β-氧化途徑在細(xì)胞中被阻斷，并且由用作底物的脂肪酸形成ω-官能化的羧酸。這些方法具有使用脂肪酸作為起始材料的缺點(diǎn)。這是因?yàn)?，使用的脂肪酸及其衍生物主要僅僅從植物和動(dòng)物油或脂肪獲得。作為原料的動(dòng)物脂肪仍然很少被客戶接受，并且含有短和中等長度脂肪酸的植物油難以獲得或僅在熱帶地區(qū)生產(chǎn)(破壞雨林的結(jié)果)。此外，特定的植物和動(dòng)物油或脂肪原料具有特定、但限定的脂肪酸概況，導(dǎo)致并聯(lián)生產(chǎn)(coupledproduction)。

wo2013024114公開了從簡單的碳源諸如(葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉、纖維素和半纖維素，還有甘油或非常簡單的有機(jī)分子諸如co2、co或合成氣)生產(chǎn)ω-官能化的羧酸和/或其酯的方法。這些簡單的糖，特別是葡萄糖，通常獲得更昂貴。從簡單的碳源生產(chǎn)ω-官能化羧酸和/或其酯的方法也可以被認(rèn)為是復(fù)雜的，因?yàn)樵摲椒ㄖ惺褂玫募?xì)胞必須進(jìn)行遺傳修飾以首先增加從這些簡單碳源生產(chǎn)羧酸。這因此增加了生產(chǎn)成本。

因此，本領(lǐng)域需要從另一原料來源生產(chǎn)ω-官能化羧酸酯的方法，其使得能夠高效和有效地生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明試圖通過提供至少一種能夠從至少一種烷烴生產(chǎn)至少一種ω-官能化羧酸酯的遺傳修飾的微生物細(xì)胞來解決上述問題。所述ω-官能化羧酸酯可以選自ω-羥基、ω-氧代、ω-羧基和ω-氨基羧酸酯。在生產(chǎn)ω-官能化羧酸酯的方法中使用這些遺傳修飾的細(xì)胞可以通過使得能夠使用易于獲得的替代石油化學(xué)原料用于其生產(chǎn)來為這些化合物的生產(chǎn)增加靈活性。此外，使用能夠在其內(nèi)整合將烷烴轉(zhuǎn)化為脂肪酸酯及其相應(yīng)的ω-官能化衍生物的完整手段的全細(xì)胞生物催化劑，使得轉(zhuǎn)化過程更簡單，因?yàn)閮H僅少量的工藝步驟參與轉(zhuǎn)化。還消除了脂肪酸和簡單碳源作為碳底物的依賴性。

根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了用于從至少一種烷烴生產(chǎn)至少一種ω-官能化羧酸酯的微生物細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含相對于野生型細(xì)胞增加以下的表達(dá)的遺傳修飾：

(i)能夠?qū)⑼闊N轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的1-烷醇的酶e1；

(ii)能夠?qū)?i)的1-烷醇轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的1-烷醛的酶e2；

(iii)能夠?qū)?ii)的1-烷醛轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的烷酸的酶e3；

(iv)能夠?qū)?iii)的烷酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的烷酸酯的酶e4；和

(v)能夠?qū)?iv)的烷酸酯轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的ω-羥基-烷酸酯的酶e5。

根據(jù)本發(fā)明的任一方面的微生物細(xì)胞是指沒有先前/以前修飾以增加由至少一種簡單碳源形成羧酸或羧酸酯的細(xì)胞。術(shù)語“簡單碳源”被理解為意指其中在碳骨架中至少一個(gè)c-c鍵已斷裂的碳源。具體而言，所述簡單碳源可以是至少一種碳水化合物，諸如例如葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉、纖維素和半纖維素，但碳源還可以包括甘油或非常簡單的有機(jī)分子諸如co2、co或合成氣。更具體而言，根據(jù)本發(fā)明的任一方面的微生物細(xì)胞可以未被遺傳修飾以相對于野生型細(xì)胞增加以下酶中的至少一種的表達(dá)：

-ec3.1.2.14或ec3.1.2.22的e20?；?acp硫酯酶，

-ec3.1.2.2、ec3.1.2.18、ec3.1.2.19、ec3.1.2.20或ec3.1.2.22的e21?；?coa硫酯酶，

-e22?；?coa:acp轉(zhuǎn)酰酶，

-e23聚酮化合物合酶，其催化參與羧酸和羧酸酯合成的反應(yīng)，和

-e24己酸合酶。

在一個(gè)實(shí)例中，根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞可以包含進(jìn)一步遺傳修飾以相對于野生型細(xì)胞增加以下的表達(dá)：

(vi)能夠?qū)?v)的ω-羥基-烷酸酯轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的ω-氧代烷酸酯的酶e6；和

(vii)能夠?qū)?vi)的ω-氧代烷酸酯轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的ω-氨基烷酸酯的酶e7。

在另一個(gè)實(shí)例中，根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞可以包含進(jìn)一步遺傳修飾以相對于野生型細(xì)胞增加以下的表達(dá)：

(vi)能夠?qū)?v)的ω-羥基-烷酸酯轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的ω-氧代烷酸酯的酶e6；

(vii)能夠?qū)?vi)的ω-氧代烷酸酯轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的ω-羧基烷酸酯的酶e13，和

(viii)能夠?qū)?vi)的ω-羧基烷酸酯轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的ω-羧基烷酸二酯的酶e14。

根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞可以用于在培養(yǎng)上清液中以高時(shí)空產(chǎn)率、高碳產(chǎn)率和高濃度從所有烷烴生產(chǎn)ω-官能化羧酸酯。作為這些優(yōu)點(diǎn)的結(jié)果，有利于有效的處理(efficientworkup)。

如本文中與細(xì)胞或微生物結(jié)合使用的短語“野生型”可以表示具有呈如在自然環(huán)境中天然可見的形式的基因組組成的細(xì)胞。該術(shù)語可適用于全細(xì)胞和個(gè)別基因。因此，術(shù)語“野生型”還可以包括已在其他方面(即，關(guān)于一個(gè)或多個(gè)基因)、但不是目標(biāo)基因相關(guān)進(jìn)行遺傳修飾的細(xì)胞。因此，術(shù)語“野生型”不包括此類細(xì)胞，其中已經(jīng)使用重組方法人工至少部分改變特定目標(biāo)基因的基因序列。因此，根據(jù)本發(fā)明的任一方面的野生型細(xì)胞是指相對于全基因組和/或特定基因沒有遺傳突變的細(xì)胞。因此，在一個(gè)實(shí)例中，關(guān)于酶e1的野生型細(xì)胞可以是指細(xì)胞中具有酶e1的天然/未改變表達(dá)的細(xì)胞。關(guān)于酶e2、e3、e4、e5、e6、e7、e8、e9、e10、e11、e12、e13、e14、e15等的野生型細(xì)胞可以相同方式解釋，并且可以是指細(xì)胞中分別具有酶e2、e3、e4、e5、e6、e7、e8、e9、e10、e11、e12、e13、e14、e15等的天然/未改變表達(dá)的細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明的任一方面使用的任何酶可以是分離的酶。具體而言，根據(jù)本發(fā)明的任一方面使用的酶可以以活性狀態(tài)和在其活性所必需的所有輔因子、底物、輔助和/或活化多肽或因子存在下使用。如本文所使用，術(shù)語“分離的”意指與其天然存在于其中的細(xì)胞相比，目標(biāo)酶是富集的。所述酶可以通過sds聚丙烯酰胺電泳和/或活性測定來富集。例如，目標(biāo)酶可以構(gòu)成制備物中存在的所有多肽的多于5％、10％、20％、50％、75％、80％、85％、90％、95％或99％，如通過在用考馬斯藍(lán)染料染色后目視檢查聚丙烯酰胺凝膠所判斷。

根據(jù)本發(fā)明的任一方面使用的酶可以是重組的。如本文所使用，術(shù)語“重組體”是指分子或由此類分子編碼，特別是多肽或核酸，其本身不是天然存在的，而是遺傳工程改造的結(jié)果；或者是指包含重組分子的細(xì)胞。例如，如果核酸分子包含與編碼催化活性多肽的序列功能性連接的啟動(dòng)子且該啟動(dòng)子已經(jīng)工程改造、使得相對于包含原始的未改變的核酸分子的相應(yīng)野生型細(xì)胞中的多肽的水平過表達(dá)該催化活性多肽，則所述核酸分子是重組的。

技術(shù)人員將能夠使用本領(lǐng)域已知的任何方法來遺傳修飾細(xì)胞或微生物。根據(jù)本發(fā)明的任一方面，遺傳修飾的細(xì)胞可以進(jìn)行遺傳修飾，使得在限定時(shí)間間隔內(nèi)，在2小時(shí)內(nèi)，特別是在8小時(shí)或24小時(shí)內(nèi)，其形成野生型細(xì)胞的至少一倍或兩倍、特別是至少10倍、至少100倍、至少1000倍或至少10000倍的ω-官能化羧酸酯。產(chǎn)物形成的增加可以例如通過以下來測定：在相同條件(相同細(xì)胞密度、相同營養(yǎng)培養(yǎng)基、相同培養(yǎng)條件)下在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中將根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞和野生型細(xì)胞各自分別培養(yǎng)指定時(shí)間間隔，然后測定營養(yǎng)培養(yǎng)基中目標(biāo)產(chǎn)物(ω-官能化羧酸酯)的量。

遺傳修飾的細(xì)胞或微生物可以在遺傳上不同于野生型細(xì)胞或微生物。根據(jù)本發(fā)明的任一方面的遺傳修飾的微生物和野生型微生物之間的遺傳差異可以是遺傳修飾的微生物中存在完整基因、氨基酸、核苷酸等，其可能在野生型微生物中不存在。在一個(gè)實(shí)例中，根據(jù)本發(fā)明的任一方面的遺傳修飾的微生物可以包含使得微生物能夠生產(chǎn)比野生型細(xì)胞更多的1-烷醇、1-烷醛、烷酸、烷酸酯、ω-羥基烷酸酯等的酶。野生型微生物相對于本發(fā)明的遺傳修飾的微生物可以沒有酶或沒有酶的可檢測活性，所述酶使得遺傳修飾的微生物能夠生產(chǎn)1-烷醇、1-烷醛、烷酸、烷酸酯、ω-羥基烷酸酯等。如本文所使用，術(shù)語“遺傳修飾的微生物”可以與術(shù)語“遺傳修飾的細(xì)胞”可互換使用。根據(jù)本發(fā)明的任一方面的遺傳修飾在微生物的細(xì)胞上實(shí)施。

根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。具體而言，所述細(xì)胞可以根據(jù)wo2013024114中公開的方法制備。

如本文所使用，短語“與其野生型相比遺傳修飾的細(xì)胞的酶活性增加”是指相應(yīng)酶活性增加至少2倍、特別是至少10倍、更特別是至少100倍、還更特別是至少1000倍、甚至更特別是至少10000倍。

如本文所使用，短語“酶活性增加”應(yīng)理解為細(xì)胞內(nèi)活性增加。基本上，酶促活性的增加可以通過以下實(shí)現(xiàn)：增加一個(gè)或多個(gè)編碼所述酶的基因序列的拷貝數(shù)，使用強(qiáng)啟動(dòng)子或采用編碼具有增加活性的相應(yīng)酶的基因或等位基因，改變基因的密碼子利用，以各種方式增加mrna或酶的半衰期，修飾基因表達(dá)的調(diào)節(jié)和任選通過組合這些措施。根據(jù)本發(fā)明的任一方面使用的遺傳修飾的細(xì)胞例如通過用含有期望基因、該基因的等位基因或其部分的載體和使得基因表達(dá)可能的載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、綴合或這些方法的組合產(chǎn)生。異源表達(dá)具體而言通過在細(xì)胞染色體或染色體外復(fù)制載體中整合基因或等位基因來實(shí)現(xiàn)。

在相同的上下文中，關(guān)于本發(fā)明的任一方面使用的短語“酶ex活性降低”可以理解為意指活性降低至少0.5倍、特別是至少0.1倍、更特別是至少0.01倍、甚至更特別地至少0.001倍且最特別地至少0.0001倍。短語“活性降低”也涵蓋沒有可檢測的活性(“活性為零”)。特定酶的活性的降低可以例如通過選擇性突變或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于降低特定酶的活性的其他措施來實(shí)現(xiàn)。具體而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員找到通過破壞特定基因來修飾和減少蛋白表達(dá)和伴隨降低酶活性的教導(dǎo)，例如至少于dubeau等人2009.singh和r?hm.2008.,lee等人,2009等。根據(jù)本發(fā)明任一方面的細(xì)胞中酶促活性的降低可以通過修飾包含所述核酸序列之一的基因來實(shí)現(xiàn)，其中所述修飾選自包含以下、由以下組成的組：在基因中插入外來dna，缺失至少部分基因，基因序列中的點(diǎn)突變，rna干擾(sirna)，反義rna或修飾(插入、缺失或點(diǎn)突變)調(diào)節(jié)序列（諸如例如啟動(dòng)子和終止子）或核糖體結(jié)合位點(diǎn)，其側(cè)接基因。

外來dna在這方面應(yīng)理解為意指對于基因(而不是生物體)“外來”的任何dna序列，即內(nèi)源dna序列在這方面也可以充當(dāng)“外來dna”。在這方面，特別優(yōu)選的是，通過插入選擇標(biāo)記基因來破壞基因，因此外來dna是選擇標(biāo)記基因，其中優(yōu)選地通過基因座中的同源重組實(shí)現(xiàn)插入。

借助1向和2向蛋白凝膠分離、隨后用適當(dāng)?shù)脑u估軟件光學(xué)鑒定凝膠中的蛋白濃度，可測定上述酶和基因和下述所有酶和基因的表達(dá)。

如果酶活性的增加僅僅基于相應(yīng)基因表達(dá)的增加，則可以通過比較野生型和遺傳修飾細(xì)胞之間的1向或2向蛋白分離來簡單地確定酶活性增加的定量。用細(xì)菌制備蛋白凝膠和鑒定蛋白的常用方法是hermann等人(electrophoresis,22:1712-23(2001))描述的方法。蛋白濃度也可以通過以下分析：用對于待測定的蛋白特異性的抗體的western印跡雜交(sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual,第2版.coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.usa,1989)，隨后用適當(dāng)軟件進(jìn)行光學(xué)評估用于測定濃度(lohaus和meyer(1989)biospektrum,5:32-39;lottspeich(1999),angewandtechemie111:2630-2647)。當(dāng)由待測定的酶活性催化的反應(yīng)的可能產(chǎn)物可以在微生物中快速代謝或者野生型中的活性本身對于其太低而不可能足以基于產(chǎn)生形成而測定待測定的酶活性時(shí)，該方法也總是一種選項(xiàng)。

具體而言，

-酶e1可以選自p450烷烴羥化酶(ea)和ec1.14.15.3的alkb烷烴羥化酶(eb)；

-酶e2可以選自p450烷烴羥化酶(ea)、ec1.14.15.3的alkb烷烴羥化酶(eb)、ec1.1.3.20的醇氧化酶(ec)和醇脫氫酶(ed)；

-酶e3選自ec1.14.15.3-的p450烷烴羥化酶(ea)、ec1.14.15.3的alkb烷烴羥化酶(eb)、醛脫氫酶(ee)、ec1.1.3.20的雙官能醇氧化酶(ec)、雙官能alkj醇脫氫酶(edi)和ec1.1.1.1或ec1.1.1.2的雙官能醇脫氫酶(edii)，其中ec、edi和edii能夠經(jīng)由1-烷醛將1-烷醇直接氧化為相應(yīng)的烷酸；

-酶e4可以選自蠟酯合酶(ef)和醇o(jì)-酰基轉(zhuǎn)移酶(eg)；

-酶e5可以選自p450烷烴羥化酶(ea)和ec1.14.15.3的alkb烷烴羥化酶(eb)；

-酶e6可以選自p450烷烴羥化酶(ea)、ec1.14.15.3的alkb烷烴羥化酶(eb)、醇氧化酶(ec)和醇脫氫酶(ed)；

-酶e7可以是ω-轉(zhuǎn)氨酶(eh)。

在一個(gè)實(shí)例中，酶e1、e2、e3和e5可以各自是可以能夠?qū)嵤┢浠钚缘牟煌?。例如，e1可以是alkb烷烴羥化酶(eb)，e2可以是醇氧化酶(ec)，e3可以是雙官能alkj醇脫氫酶，且e5可以是alkb烷烴羥化酶(eb)。在另一個(gè)實(shí)例中，e1可以是p450烷烴羥化酶(ea)，e2可以是醇脫氫酶(ec)，e3可以是醛脫氫酶(ee)，且e5可以是p450烷烴羥化酶。具體而言，酶e1、e2、e3和e5的任何組合可以用于實(shí)施它們的特定功能。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)例中，e1、e2、e3和e5可以是相同的酶。在該實(shí)例中，e1、e2、e3和e5可以選自p450烷烴羥化酶(ea)和alkb烷烴羥化酶(eb)。在一個(gè)實(shí)例中，e1、e2、e3和e5可以是p450烷烴羥化酶(ea)。在該實(shí)例中，根據(jù)本發(fā)明任一方面的細(xì)胞包含相對于野生型細(xì)胞增加的p450烷烴羥化酶(ea)(其滿足酶e1、e2、e3和e5的功能)的表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)例中，e1、e2、e3和e5可以是alkb烷烴羥化酶(eb)。在該實(shí)例中，根據(jù)本發(fā)明任一方面的細(xì)胞包含相對于野生型細(xì)胞增加的alkb烷烴羥化酶(eb)(其滿足酶e1、e2、e3和e5的功能)的表達(dá)。

酶ea至eh可以包含這樣的多肽序列，其中與以下參考序列(登錄號)相比最多達(dá)60％、優(yōu)選最多達(dá)25％、特別是最多達(dá)15％、特別是最多達(dá)10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％的氨基酸殘基通過缺失、插入、取代或其組合而被修飾，并且其仍具有擁有相應(yīng)的以下參考序列的蛋白的活性的至少50％、優(yōu)選65％、特別是優(yōu)選80％、特別是大于90％，其中參考蛋白的100％活性被理解為意指用作生物催化劑的細(xì)胞的活性(即基于使用的細(xì)胞量的每單位時(shí)間轉(zhuǎn)化的物質(zhì)的量(單位/克細(xì)胞干重[u/gcdw]))與在參考蛋白不存在下的生物催化劑的活性相比的增加。

給定多肽序列的氨基酸殘基的修飾(其導(dǎo)致給定多肽的特性和功能沒有顯著改變)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。因此，例如許多氨基酸經(jīng)常可以互相交換而沒有問題；此類合適的氨基酸取代的實(shí)例是：ala取代為ser；arg取代為lys；asn取代為gln或his；asp取代為glu；cys取代為ser；gln取代為asn；glu取代為asp；gly取代為pro；his取代為asn或gln；ile取代為leu或val；leu取代為met或val；lys取代為arg或gln或glu；met取代為leu或ile；phe取代為met或leu或tyr；ser取代為thr；thr取代為ser；trp取代為tyr；tyr取代為trp或phe；val取代為ile或leu。還已知的是，修飾，特別是以例如氨基酸插入或缺失形式的多肽的n-或c-末端處的修飾，經(jīng)常對多肽的功能沒有顯著影響。

整個(gè)本說明書中提及的與本發(fā)明結(jié)合闡明的登錄號對應(yīng)于具有日期2011年7月26日的ncbiproteinbank數(shù)據(jù)庫條目；通常，條目的版本號在這里通過“數(shù)字”諸如例如“.1”來標(biāo)識。

除非另有說明，否則所有所述百分比(％)為質(zhì)量百分比。

根據(jù)本發(fā)明的任一方面，所述微生物細(xì)胞可以選自以下的細(xì)菌物種：乏養(yǎng)菌屬（abiotrophia）、acaryochloris、accumulibacter、醋弧菌屬（acetivibrio）、醋酸桿菌屬（acetobacter）、醋鹽桿菌屬（acetohalobium）、醋絲菌屬（acetonema）、無色桿菌屬（achromobacter）、氨基酸球菌屬（acidaminococcus）、酸微菌屬（acidimicrobium）、嗜酸菌屬（acidiphilium）、酸硫桿狀菌屬（acidithiobacillus）、酸桿菌屬（acidobacterium）、熱酸菌屬（acidothermus）、食酸菌屬（acidovorax）、不動(dòng)桿菌屬（acinetobacter）、放線桿菌屬（actinobacillus）、放線菌屬（actinomyces）、束絲放線菌屬（actinosynnema）、氣球菌屬（aerococcus）、氣微菌屬（aeromicrobium）、氣單胞菌屬（aeromonas）、阿菲波菌屬（afipia）、凝聚桿菌屬（aggregatibacter）、土壤桿菌屬（agrobacterium）、ahrensia、akkermansia、食堿菌屬（alcanivorax）、脂環(huán)酸芽胞桿菌屬（alicycliphilus）、脂環(huán)酸桿菌屬（alicyclobacillus）、aliivibrio、堿湖生菌屬（alkalilimnicola）、alkaliphilus、異著色菌屬（allochromatium）、交替單胞菌目（alteromonadales）、交替單胞菌屬（alteromonas）、aminobacterium、氨基酸單胞菌屬（aminomonas）、制氨菌屬（ammonifex）、擬無枝酸菌屬（amycolatopsis）、amycolicicoccus、魚腥藻屬（anabaena）、厭氧小桿菌屬（anaerobaculum）、厭氧球菌屬（anaerococcus）、anaerofustis、厭氧繩菌屬（anaerolinea）、厭氧粘細(xì)菌屬（anaeromyxobacter）、anaerostipes、anaerotruncus、無形體屬（anaplasma）、厭氧芽孢桿菌屬（anoxybacillus）、產(chǎn)液菌屬（aquifex）、隱穩(wěn)桿菌屬（arcanobacterium）、弓形桿菌屬（arcobacter）、aromatoleum、節(jié)桿菌屬（arthrobacter）、arthrospira、不粘柄菌屬（asticcacaulis）、陌生物菌屬（atopobium）、橙單胞菌屬（aurantimonas）、固氮弓菌屬（azoarcus）、固氮根瘤菌屬（azorhizobium）、固氮螺菌屬（azospirillum）、固氮菌屬（azotobacter）、桿菌屬（bacillus）、巴通體屬（bartonella）、basfia、baumannia、蛭弧菌屬（bdellovibrio）、貝扎托菌屬（beggiatoa）、拜葉林克氏菌屬（beijerinckia）、bermanella、獲山氏菌屬（beutenbergia）、雙岐桿菌屬（bifidobacterium）、嗜膽菌屬（bilophila）、blastopirellula、blautia、blochmannia、博德氏菌屬（bordetella）、疏螺旋體屬（borrelia）、短狀桿菌屬（brachybacterium）、短螺旋體屬（brachyspira）、短根瘤菌屬（bradyrhizobium）、短小芽孢桿菌屬（brevibacillus）、短桿菌屬（brevibacterium）、短波單胞菌屬（brevundimonas）、布魯菌屬（brucella）、布赫納氏菌屬（buchnera）、bulleidia、伯克氏菌屬（burkholderia）、丁酸弧菌屬（butyrivibrio）、caldalkalibacillus、caldanaerobacter、熱解纖維素菌屬（caldicellulosiruptor）、calditerrivibrio、caminibacter、彎曲菌屬（campylobacter）、carboxydibrachium、一氧化碳嗜熱菌屬（carboxydothermus）、心桿菌屬（cardiobacterium）、肉桿菌屬（carnobacterium）、carsonella、catenibacterium、catenulispora、卡托氏菌屬（catonella）、柄桿菌屬（caulobacter）、纖維單胞菌屬（cellulomonas）、纖維弧菌屬（cellvibrio）、蜈蚣菌屬（centipeda）、根瘤菌屬(chelativorans)、綠屈撓菌屬（chloroflexus）、色桿菌屬（chromobacterium）、色鹽桿菌屬（chromohalobacter）、chthoniobacter、citreicella、檸檬酸桿菌屬（citrobacter）、檸檬酸微菌屬（citromicrobium）、棍狀桿菌屬（clavibacter）、cloacamonas、梭狀芽孢桿菌屬（clostridium）、柯林斯氏菌屬（collinsella）、科爾韋氏菌屬（colwellia）、叢毛單胞菌屬（comamonas）、conexibacter、聚集桿菌屬（congregibacter）、coprobacillus、糞球菌屬（coprococcus）、糞熱桿菌屬（coprothermobacter）、coraliomargarita、科里氏桿菌屬（coriobacterium）、corrodens、棒狀桿菌屬（corynebacterium）、柯克斯體屬（coxiella）、鱷球藻屬（crocosphaera）、阪崎腸桿菌屬（cronobacter）、短小桿菌屬（cryptobacterium）、貪銅菌屬（cupriavidus）、藍(lán)菌屬（cyanobium）、藍(lán)絲菌屬（cyanothece）、擬筒孢藍(lán)細(xì)菌屬（cylindrospermopsis）、dechloromonas、鐵還原桿菌屬（deferribacter）、dehalococcoides、dehalogenimonas、異常球菌屬（deinococcus）、代爾夫特菌屬（delftia）、氮還原弧菌屬（denitrovibrio）、皮生球菌屬（dermacoccus）、desmospora、脫硫盒菌屬（desulfarculus）、desulphateibacillum、脫亞硫酸菌屬（desulfitobacterium）、脫硫橄欖狀菌屬（desulfobacca）、脫硫桿菌屬（desulfobacterium）、脫硫葉菌屬（desulfobulbus）、脫硫球菌屬（desulfococcus）、脫硫鹽菌屬（desulfohalobium）、脫硫微菌屬（desulfomicrobium）、desulfonatronospira、desulforudis、脫硫小桿菌屬（desulfotalea）、脫硫腸狀菌屬（desulfotomaculum）、脫硫弧菌屬（desulfovibrio）、（desulfurispirillum）、脫硫桿菌屬（desulfurobacterium）、除硫單胞菌屬（desulfuromonas）、dethiobacter、脫硫代硫酸鹽弧菌屬（dethiosulfovibrio）、戴阿利斯特桿菌屬（dialister）、偶蹄形菌屬（dichelobacter）、dickeya、網(wǎng)球菌屬（dictyoglomus）、迪茨氏菌屬（dietzia）、dinoroseobacter、dorea、愛德華氏菌屬（edwardsiella）、埃里希氏體屬（ehrlichia）、艾肯氏菌屬（eikenella）、elusimicrobium、endoriftia、水棲菌屬（enhydrobacter）、腸桿菌屬（enterobacter）、腸球菌屬（enterococcus）、epulopiscium、歐文氏桿菌屬（erwinia）、丹毒絲菌屬（erysipelothrix）、赤細(xì)菌屬（erythrobacter）、埃希氏桿菌屬（escherichia）、產(chǎn)氫新菌屬（ethanoligenens）、真桿菌屬（eubacterium）、真桿菌屬（eubacterium）、微小桿菌屬（exiguobacterium）、faecalibacterium、鐵還原單胞菌屬（ferrimonas）、閃爍桿菌屬（fervidobacterium）、絲狀桿菌屬（fibrobacter）、finegoldia、彎枝菌屬（flexistipes）、弗朗西斯氏菌屬（francisella）、弗蘭克氏菌屬（frankia）、fructobacillus、fulvimarina、梭桿菌屬（fusobacterium）、gallibacterium、報(bào)毛菌屬（gallionella）、加德納氏菌屬（gardnerella）、孿生球菌屬（gemella）、出芽菌屬（gemmata）、芽單胞菌屬（gemmatimonas）、土壤芽孢桿菌屬（geobacillus）、土桿菌屬（geobacter）、地嗜皮菌屬（geodermatophilus）、冰居菌屬（glaciecola）、粘桿菌屬（gloeobacter）、舌蠅屬（glossina）、葡糖酸醋酸桿菌屬（gluconacetobacter）、戈登氏菌屬（gordonia）、granulibacter、顆粒鏈菌屬（granulicatella）、格里蒙菌屬（grimontia）、嗜血菌屬（haemophilus）、河氏菌屬（hahella）、halanaerobiumns、haliangium、鹽單胞菌屬（halomonas）、鹽紅螺旋菌屬（halorhodospira）、鹽熱發(fā)菌屬（halothermothrix）、鹽硫桿狀菌屬（halothiobacillus）、hamiltonella、螺桿菌屬（helicobacter）、陽光桿菌屬（heliobacterium）、草螺菌屬（herbaspirillum）、herminiimonas、滑柱菌屬（herpetosiphon）、希普氏菌屬（hippea）、海氏菌屬（hirschia）、嗜組織菌屬（histophilus）、hodgkinia、hoeflea、霍爾德曼氏菌屬（holdemania）、hydrogenivirga、hydrogenobaculum、hylemonella、生絲微菌屬（hyphomicrobium）、生絲單胞菌屬（hyphomonas）、idiomarina、泥桿菌屬（ilyobacter）、間孢囊菌屬（intrasporangium）、白蟻菌屬（isoptericola）、等球菌屬（isosphaera）、兩面神菌屬（janibacter）、紫色桿菌屬（janthinobacterium）、瓊斯氏菌屬（jonesia）、jonquetella、kangiella、ketogulonicigenium、動(dòng)球菌屬（kineococcus）、金氏菌屬（kingella）、克雷伯氏菌屬（klebsiella）、考克氏菌屬（kocuria）、koribacter、kosmotoga、撲科研菌屬（kribbella）、纖線桿菌屬（ktedonobacter）、皮球菌屬（kytococcus）、labrenzia、乳桿菌屬（lactobacillus）、乳球菌屬（lactococcus）、鷗桿菌屬（laribacter）、勞特羅普氏菌屬（lautropia）、勞森氏菌屬（lawsonia）、軍團(tuán)菌屬（legionella）、雷弗松氏菌屬（leifsonia）、lentisphaera、纖發(fā)鞘絲藍(lán)細(xì)菌屬（leptolyngbya）、鉤端螺旋體屬（leptospira）、纖發(fā)菌屬（leptothrix）、纖毛菌屬（leptotrichia）、明串珠菌屬（leuconostoc）、韌皮桿菌屬（liberibacter）、limnobacter、李斯特氏菌屬（listeria）、loktanella、lutiella、鞘絲藍(lán)細(xì)菌屬（lyngbya）、lysinibacillus、巨大球菌屬（macrococcus）、磁球菌屬（magnetococcus）、磁螺菌屬（magnetospirillum）、mahella、默罕氏菌屬（mannheimia）、海洋桿狀菌屬（maricaulis）、海棲熱菌屬（marinithermus）、海桿菌屬（marinobacter）、海單胞菌屬（marinomonas）、深海菌屬（mariprofundus）、maritimibacter、marvinbryantia、巨球形菌屬（megasphaera）、稍熱菌屬（meiothermus）、蜜蜂球菌屬（melissococcus）、中間根瘤菌屬（mesorhizobium）、methylacidiphilum、methylibium、甲基小桿菌屬（methylobacillus）、甲基桿菌屬（methylobacter）、甲基桿菌屬（methylobacterium）、甲基球菌屬（methylococcus）、甲基孢囊菌屬（methylocystis）、甲基微菌屬（methylomicrobium）、噬甲基菌屬（methylophaga）、嗜甲基菌目（methylophilales）、甲基曲菌屬（methylosinus）、methyloversatilis、食甲基菌屬（methylovorus）、微桿菌屬（microbacterium）、微球菌屬（micrococcus）、微鞘藍(lán)細(xì)菌屬（microcoleus）、微囊藍(lán)細(xì)菌屬（microcystis）、小月菌屬（microlunatus）、小單孢菌屬（micromonospora）、光崗菌屬（mitsuokella）、動(dòng)彎桿菌屬（mobiluncus）、穆爾氏菌屬（moorella）、莫拉氏菌屬（moraxella）、南極嗜冷菌屬（moritella）、分枝桿菌屬（mycobacterium）、粘球菌屬（myxococcus）、nakamurella、鹽堿厭氧菌屬（natranaerobius）、奈瑟氏球菌屬（neisseria）、新立克次氏體屬（neorickettsia）、neptuniibacter、nitratifractor、nitratiruptor、硝化桿菌屬（nitrobacter）、硝化球菌屬（nitrococcus）、亞硝化單胞菌屬（nitrosomonas）、亞硝化螺菌屬（nitrosospira）、硝化螺菌屬（nitrospira）、諾卡氏菌屬（nocardia）、類諾卡氏菌屬（nocardioides）、擬諾卡氏菌屬（nocardiopsis）、節(jié)球藍(lán)細(xì)菌屬（nodularia）、念珠藍(lán)細(xì)菌屬（nostoc）、新鞘脂菌屬（novosphingobium）、oceanibulbus、oceanicaulis、海洋生菌屬（oceanicola）、海洋棲熱菌屬（oceanithermus）、海洋芽胞桿菌屬（oceanobacillus）、蒼白桿菌屬（ochrobactrum）、十八桿菌屬（octadecabacter）、odyssella、寡養(yǎng)菌屬（oligotropha）、olsenella、豐佑菌屬（opitutus）、oribacterium、東方體屬（orientia）、ornithinibacillus、顫藍(lán)細(xì)菌屬（oscillatoria）、綠顫細(xì)菌屬（oscillochloris）、草酸桿菌屬（oxalobacter）、類芽孢桿菌屬（paenibacillus）、泛菌屬（pantoea）、副球菌屬（paracoccus）、parascardovia、parasutterella、parvibaculum、微單胞菌屬（parvimonas）、短小盒菌屬（parvularcula）、巴斯德氏菌屬（pasteurella）、巴斯德氏芽菌屬（pasteuria）、果膠桿菌屬（pectobacterium）、片球菌屬（pediococcus）、pedosphaera、pelagibaca、遠(yuǎn)洋桿菌屬（pelagibacter）、暗桿菌屬（pelobacter）、pelotomaculum、peptoniphilus、消化鏈球菌屬（peptostreptococcus）、persephonella、石袍菌屬（petrotoga）、褐桿菌屬（phaeobacter）、考拉桿菌屬（phascolarctobacterium）、苯基桿菌屬（phenylobacterium）、發(fā)光桿菌屬（photobacterium）、小小梨形菌屬（pirellula）、浮霉?fàn)罹鷮伲?i>planctomyces）、動(dòng)性球菌屬（planococcus）、plesiocystis、極胞菌屬（polaromonas）、極胞菌屬（polaromonas）、polymorphum、多核桿菌屬（polynucleobacter）、海綿桿菌門（poribacteria）、原綠球菌屬（prochlorococcus）、丙酸桿菌屬（propionibacterium）、變形菌屬（proteus）、普羅威登斯菌屬（providencia）、假交替單胞菌屬（pseudoalteromonas）、pseudoflavonifractor、假單胞菌屬（pseudomonas）、假諾卡氏菌屬（pseudonocardia）、假枝桿菌屬（pseudoramibacter）、pseudovibrio、假黃色單胞菌屬（pseudoxanthomonas）、嗜冷桿菌屬（psychrobacter）、冷單胞菌屬（psychromonas）、puniceispirillum、pusillimonas、維形桿菌屬（pyramidobacter）、拉恩氏菌屬（rahnella）、羅爾斯通氏菌屬（ralstonia）、尖頭藻屬（raphidiopsis）、regiella、reinekea、腎桿菌屬（renibacterium）、根瘤菌屬（rhizobium）、紅細(xì)菌屬（rhodobacter）、紅球菌屬（rhodococcus）、紅育菌屬（rhodoferax）、紅微菌屬（rhodomicrobium）、紅小梨形菌屬（rhodopirellula）、紅假單胞菌屬（rhodopseudomonas）、紅螺菌屬（rhodospirillum）、立克次氏體屬（rickettsia）、立克次氏小體屬（rickettsiella）、riesia、羅斯伯里氏菌屬（roseburia）、玫瑰菌屬（roseibium）、玫瑰彎菌屬（roseiflexus）、玫瑰桿菌屬（roseobacter）、玫瑰單胞菌屬（roseomonas）、玫瑰變色菌屬（roseovarius）、羅斯氏菌屬（rothia）、紅長命菌屬（rubrivivax）、紅色桿菌屬（rubrobacter）、魯杰氏菌屬（ruegeria）、瘤胃球菌屬（ruminococcus）、ruthia、糖單孢菌屬（saccharomonospora）、saccharophagus、糖多孢菌屬（saccharopolyspora）、箭頭菌屬（sagittula）、salinispora、沙門氏菌屬（salmonella）、血桿菌屬（sanguibacte）、scardovia、塞巴魯?shù)戮鷮伲?i>sebaldella）、segniliparus、月形單胞菌屬（selenomonas）、沙雷氏菌屬（serratia）、希瓦氏菌屬（shewanella）、志賀氏菌屬（shigella）、shuttleworthia、sideroxydans、silicibacter、西蒙斯氏菌屬（simonsiella）、中華根瘤菌屬（sinorhizobium）、史雷克氏菌屬（slackia）、伴蠅菌屬（sodalis）、solibacter、solobacterium、堆囊菌屬（sorangium）、球桿菌屬（sphaerobacter）、鞘脂菌屬（sphingobium）、鞘氨醇單胞菌屬（sphingomonas）、sphingopyxis、螺旋體屬（spirochaeta）、芽孢八疊球菌屬（sporosarcina）、stackebrandtia、葡萄球菌屬（staphylococcus）、starkeya、寡養(yǎng)單胞菌屬（stenotrophomonas）、標(biāo)樁菌屬（stigmatella）、鏈桿菌屬（streptobacillus）、鏈球菌屬（streptococcus）、鏈霉菌屬（streptomyces）、鏈孢囊菌屬（streptosporangium）、subdoligranulum、subvibrioides、succinatimonas、亞硫酸鹽桿菌屬（sulfitobacter）、硫化桿菌屬（sulfobacillus）、sulfuricurvum、sulfurihydrogenibium、sulfurimonas、硫化螺旋菌屬（sulfurospirillum）、sulfurovum、薩特氏菌屬（sutterella）、symbiobacterium、集胞藍(lán)細(xì)菌屬（synechocystis）、互營桿菌屬（syntrophobacter）、共養(yǎng)香腸樣桿菌屬（syntrophobotulus）、共養(yǎng)單胞菌屬（syntrophomonas）、互營熱菌屬（syntrophothermus）、互養(yǎng)菌屬（syntrophus）、taiwanensis、泰勒氏菌屬（taylorella）、teredinibacter、terriglobus、thalassiobium、索氏菌屬（thauera）、嗜熱好氧桿菌屬（thermaerobacter）、熱厭氧弧菌屬（thermanaerovibrio）、thermincola、熱厭氧桿菌屬（thermoanaerobacter）、熱厭氧桿菌屬（thermoanaerobacterium）、thermobaculum、喜熱裂孢菌屬（thermobifida）、嗜熱雙孢菌屬（thermobispora）、熱發(fā)狀菌屬（thermocrinis）、thermodesulphateator、熱脫硫桿菌屬（thermodesulfobacterium）、熱脫硫菌屬（thermodesulfobium）、熱脫硫弧菌屬（thermodesulfovibrio）、熱微菌屬（thermomicrobium）、高溫單孢菌屬（thermomonospora）、thermosediminibacter、thermosinus、棲熱腔菌屬（thermosipho）、thermosynechococcus、棲熱孢菌屬（thermotoga）、熱弧菌屬（thermovibrio）、棲熱菌屬（thermus）、thioalkalimicrobium、thioalkalivibrio、硫桿菌屬（thiobacillus）、硫微螺菌屬（thiomicrospira）、硫單胞菌屬（thiomonas）、甲苯單胞菌屬（tolumonas）、密螺旋體屬（treponema）、tribocorum、束毛藍(lán)細(xì)菌屬（trichodesmium）、tropheryma、特呂珀菌屬（truepera）、冢村氏菌屬（tsukamurella）、turicibacter、貪噬菌屬（variovorax）、韋榮氏菌屬（veillonella）、verminephrobacter、疣微菌屬（verrucomicrobium）、疣孢菌屬（verrucosispora）、vesicomyosocius、弧菌屬（vibrio）、弧菌目（vibrionales）、食物谷菌屬（victivallis）、魏斯氏菌屬（weissella）、威格爾斯沃思氏菌屬（wigglesworthia）、沃爾巴克氏體屬（wolbachia）、沃林氏菌屬（wolinella）、黃色桿菌屬（xanthobacter）、黃單胞菌屬（xanthomonas）、致病桿菌屬（xenorhabdus）、xylanimonas、木桿菌屬（xylella）、耶爾森氏菌屬（yersinia）、zinderia和發(fā)酵單孢菌屬（zymomonas）。

具體而言，所述微生物細(xì)胞可以來自大腸桿菌（e.coli）、假單胞菌屬種（pseudomonassp.）、熒光假單胞菌（pseudomonasfluorescens）、惡臭假單胞菌（pseudomonasputida）、施氏假單胞菌（pseudomonasstutzeri）、不動(dòng)桿菌屬種（acinetobactersp.）、伯克氏菌屬種（burkholderiasp.）、burkholderiathailandensis、cyanobakterien、克雷伯氏菌屬種（klebsiellasp.）、產(chǎn)酸克雷伯氏菌（klebsiellaoxytoca）、沙門氏菌屬種（salmonellasp.）、根瘤菌屬種（rhizobiumsp.）和苜蓿根瘤菌（rhizobiummeliloti）、芽孢桿菌屬種（bacillussp.）、枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）、梭狀芽胞桿菌屬種（clostridiumsp.）、棒狀桿菌屬種（corynebacteriumsp.）、谷氨酸棒狀桿菌（corynebacteriumglutamicum）、短桿菌屬種（brevibacteriumsp.）、小球藻屬種（chlorellasp.）和念珠藻屬種（nostocsp.）。更具體地，所述微生物細(xì)胞可以來自大腸桿菌。

烷烴是具有各種應(yīng)用的飽和烴，這取決于碳原子的數(shù)目和烷烴的結(jié)構(gòu)(即支鏈、直鏈、環(huán)狀等)。烷烴(技術(shù)上，總是無環(huán)或開鏈化合物)具有化學(xué)通式cnh2n+2。根據(jù)本發(fā)明的任一方面使用的烷烴可以包含至少6個(gè)c原子。

具體而言，根據(jù)本發(fā)明的任一方面使用的烷烴可以包含6-22、6-20、6-18、6-17、6-16、6-15、6-14、6-13、6-12、6-11、6-10、8-20、8-19、8-18、8-16、8-15、8-12、8-10個(gè)碳原子(包括端值)。所述烷烴可以選自己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、十五烷、十六烷和二十烷。具體而言，使用的烷烴可以是癸烷、十一烷或十二烷。

酶e1

酶e1可以能夠?qū)⒅辽僖环N烷烴轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的1-烷醇。具體而言，e1可以是至少一種ec1.14.15.1的p450烷烴羥化酶(ea)或ec1.14.15.3的alkb烷烴羥化酶(eb)。p450烷烴羥化酶(ea)是反應(yīng)系統(tǒng)的組分，所述反應(yīng)系統(tǒng)包含

-兩種酶組分細(xì)胞色素p450烷烴羥化酶和ec1.6.2.4的nad(p)h細(xì)胞色素p450氧化還原酶，或

-三種酶組分cyp153類型的細(xì)胞色素p450烷烴羥化酶、ec1.18.1.2或ec1.18.1.3的鐵氧還蛋白nad(p)+還原酶和鐵氧還蛋白。

alkb烷烴羥化酶(e1b)是反應(yīng)系統(tǒng)的組分，所述反應(yīng)系統(tǒng)包含

-ec1.14.15.3的alkb烷烴羥化酶，其為反應(yīng)系統(tǒng)的組分，所述反應(yīng)系統(tǒng)包含三種酶組分ec1.14.15.3的alkb烷烴羥化酶、ec1.18.1.1或ec1.18.1.4的alkt紅素氧還蛋白nad(p)+還原酶和紅素氧還蛋白alkg。

具體而言，e1可以是也稱為烷烴單加氧酶的alkb烷烴羥化酶(eb)。更具體而言，e1可以包含與由alkbgt編碼的來自惡臭假單胞菌gpo1的烷烴單加氧酶的至少50％的序列同一性。甚至更具體而言，e1可以包含與多肽yp_001185946.1的至少50％序列同一性。更具體而言，e1可以包含與多肽yp_001185946.1具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、94％、95％、98％或100％的序列同一性的多肽。

酶ea

具體而言，酶e1可以是至少一種選自以下的p450烷烴羥化酶(ea)：

和。

酶eb

在另一實(shí)例中，酶e1可以是至少一種選自以下的alkb烷烴羥化酶(e1b)：

和。

酶e2

酶e2可以能夠?qū)?-烷醇轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的1-烷醛。具體而言，e2可以是至少一種ec1.14.15.3的p450烷烴羥化酶(ea)、ec1.14.15.3的alkb烷烴羥化酶(eb)、ec1.1.3.20的醇氧化酶(ec)或ec1.1.1.1或ec1.1.1.2的醇脫氫酶(ed)。更具體而言，e2可以選自p450烷烴羥化酶(ea)、alkb烷烴羥化酶(eb)、ec1.1.3.20的醇氧化酶(ec)、alkj醇脫氫酶(edi)和ec1.1.1.1或ec1.1.1.2的醇脫氫酶(edii)。

具體而言，e2可以是也稱為烷烴單加氧酶的alkb烷烴羥化酶(eb)。更具體而言，e2可以包含與由alkbgt編碼的來自惡臭假單胞菌gpo1的烷烴單加氧酶的至少50％的序列同一性。甚至更具體而言，e2可以包含與多肽yp_001185946.1的至少50％序列同一性。更具體而言，e2可以包含與多肽yp_001185946.1具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、94％、95％、98％或100％的序列同一性的多肽。

酶ec

所述醇氧化酶(ec)可以選自：

和

。

具體而言，所述醇氧化酶(ec)可以選自

和。

酶edi

具體而言，所述alkj醇脫氫酶(edi)可以選自：

和。

具體而言，edi可以選自

和。

酶edii

所述醇脫氫酶(edii)可以選自來自細(xì)菌、特別是大腸桿菌的

和。

酶e3

酶e3可以能夠?qū)⒅辽僖环N1-烷醛轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的烷酸。具體而言，e3可以選自ec1.14.15.3-的p450烷烴羥化酶(ea)、ec1.14.15.3的alkb烷烴羥化酶(eb)、ec1.1.3.20的雙官能醇氧化酶(ec)、能夠經(jīng)由1-烷醛將1-烷醇直接氧化為相應(yīng)的烷酸的雙官能alkj醇脫氫酶(edi)或ec1.1.1.1或ec1.1.1.2的雙官能醇脫氫酶(edii)和醛脫氫酶(ee)。

酶ee

酶ee，醛脫氫酶，可以能夠催化以下的轉(zhuǎn)化

ω-氧代烷酸(酯)=ω-羧基烷酸(酯)。

為了催化上述反應(yīng)，ee可以是ec1.2.1.3、ec1.2.1.4或ec1.2.1.5的醛脫氫酶，ec1.1.3.20的脂肪醇氧化酶，ec1.1.99.-的alkj醇脫氫酶和ec1.1.1.1或ec1.1.1.2的醇脫氫酶。

在一個(gè)實(shí)例中，ee可以能夠特異性催化以下反應(yīng)：

ω-氧代烷酸(酯)+nad(p)⁺=ω-羧基烷酸(酯)+nad(p)h+h⁺

在該情況下，酶ee可以是ec1.2.1.3、ec1.2.1.4或ec1.2.1.5的醛脫氫酶，并且可以選自來自細(xì)菌、特別是大腸桿菌的

和。

在另一個(gè)實(shí)例中，酶ee可以能夠催化以下反應(yīng)：

ω-氧代烷酸(酯)+o2=ω-羧基烷酸(酯)+h2o2

在該情況下，ee可以是ec1.1.3.20的脂肪醇氧化酶，并且可以選自上面作為酶ec提供的列表。

在另一個(gè)實(shí)例中，ee可以是至少一種ec1.1.99的alkj醇脫氫酶，并且可以選自上面作為edi提供的列表。

在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)例中，ee可以是選自作為酶edii提供的列表的ec1.1.1.1或ec1.1.1.2的醇脫氫酶。

酶e4

酶e4可以能夠?qū)⒅辽僖环N烷酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的烷酸酯。具體而言，e4可以是至少一種蠟酯合酶，也稱為醇o(jì)-?；D(zhuǎn)移酶(ec2.3.1.20、ec2.3.1.75)(ef)或醇o(jì)-乙?；D(zhuǎn)移酶(eg)(ec2.3.1.20、ec2.3.1.75或ec2.3.1.84)。

在一個(gè)實(shí)例中，e4可以是至少一種蠟酯合酶(ef)。更具體而言，e4可以包含與醋酸鈣不動(dòng)桿菌adp1或hahellachejuensis的o-乙酰轉(zhuǎn)移酶的至少50％的序列同一性。甚至更具體而言，e4可以包含與多肽yp_045555.1、wp_011398768.1或np_808414.2的至少50％的序列同一性。更具體而言，e4可以包含與選自多肽yp_045555.1、wp_011398768.1和np_808414.2的多肽具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、94％、95％、98％或100％的序列同一性的多肽。在一個(gè)實(shí)例中，e4可以包含與seqidno:2具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、94％、95％、98％或100％的序列同一性的多肽。

酶ef

具體而言，所述酶ef可以選自：

和。

在另一個(gè)實(shí)例中，所述酶ef可以選自以下ncbi基因標(biāo)識符：

和。

酶eg

具體而言，所述酶eg可以選自

和。

酶e5

酶e5可以能夠?qū)⒅辽僖环N烷酸酯轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的ω-羥基-烷酸酯。具體而言，e5可以是作為e1列出的任何酶。具體而言，e5可以是至少一種ec1.14.15.3的p450烷烴羥化酶(ea)或ec1.14.15.3的alkb烷烴羥化酶(eb)。

酶e6

酶e6可以能夠?qū)⒅辽僖环Nω-羥基-烷酸酯轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的ω-氧代烷酸酯。具體而言，e6可以是作為e2列出的任何酶。具體而言，e6可以選自ec1.14.15.3-的p450烷烴羥化酶(ea)、ec1.14.15.3的alkb烷烴羥化酶(eb)、ec1.1.3.20的醇氧化酶(ec)和ec1.1.1.1或ec1.1.1.2的醇脫氫酶(ed)。

關(guān)于酶e6使用的短語“當(dāng)存在時(shí)”是指已經(jīng)被遺傳修飾以生產(chǎn)ω-氧代烷酸酯的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞可以包含酶e6相對于野生型細(xì)胞增加的表達(dá)，因此能夠生產(chǎn)ω-氧代烷酸酯。在另一個(gè)實(shí)例中，根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞也可以包含酶e6相對于野生型細(xì)胞無增加的表達(dá)，因此不能生產(chǎn)ω-氧代烷酸酯。因此，這些細(xì)胞可以主要生產(chǎn)ω-羥基-烷酸酯。因此，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞包含酶e6的增加的表達(dá)時(shí)(即當(dāng)存在時(shí))，則可以生產(chǎn)ω-氧代烷酸酯。

酶e7

酶e7可以能夠?qū)⒅辽僖环Nω-氧代烷酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的ω-氨基烷酸酯。具體而言，e7可以是ec2.6.1的ω-轉(zhuǎn)氨酶(eh)。

具體而言，所述酶e7可以是選自以下的轉(zhuǎn)氨酶(eh)：惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)(wp_016502144;wp_016500675.1)、紫色色桿菌(chromobacteriumviolaceum)(np_901695.1)、類球紅細(xì)菌(rhodobactersphaeroides)2.4.1(yp_353455.1)和

具體而言，所述酶e7可以是選自以下的轉(zhuǎn)氨酶(eh)：

和。

關(guān)于酶e7使用的短語“當(dāng)存在時(shí)”是指已經(jīng)被遺傳修飾以生產(chǎn)ω-氨基烷酸酯的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞可以包含酶e7相對于野生型細(xì)胞增加的表達(dá)，因此能夠生產(chǎn)ω-氨基烷酸酯。在另一個(gè)實(shí)例中，根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞也可以包含酶e7相對于野生型細(xì)胞無增加的表達(dá)，因此不能生產(chǎn)ω-氨基烷酸酯。因此，這些細(xì)胞可以主要生產(chǎn)ω-氧代-烷酸酯。在一個(gè)實(shí)例中，相對于野生型細(xì)胞包含酶e6、而非e7的增加的表達(dá)的細(xì)胞可以能夠生產(chǎn)ω-氧代-烷酸酯。在另一個(gè)實(shí)例中，當(dāng)所述細(xì)胞未被遺傳修飾以增加e6、而非e7的表達(dá)時(shí),所述細(xì)胞可以生產(chǎn)ω-羥基烷酸酯。

酶eh

具體而言，所述酶eh可以選自：

和。

根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞可以進(jìn)行遺傳修飾以相對于野生型細(xì)胞增加酶e1至e5的表達(dá)。所述細(xì)胞可以進(jìn)一步遺傳修飾以增加至少酶e6和/或e7的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)例中，酶e1、e2、e3、e5和e6可以是至少一種alkb烷烴羥化酶(eb)且酶e4可以是蠟酯合酶(ef)。具體而言，

-所述alkb烷烴羥化酶(eb)包含相對于seqidno:1的至少60％序列同一性；且

-所述蠟酯合酶(ef)包含相對于seqidno:2的至少60％序列同一性。

在另一個(gè)實(shí)例中，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞被遺傳修飾以生產(chǎn)至少一種ω-氨基烷酸酯時(shí)，所述細(xì)胞可以經(jīng)修飾以表達(dá)至少一種ω-轉(zhuǎn)氨酶(eh)，其可以包含相對于seqidno:3的至少60％序列同一性。

酶e8

根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞可以進(jìn)一步遺傳修飾以降低至少一種酶e8的表達(dá)，所述酶e8在將烷烴轉(zhuǎn)化為ω-官能化羧酸酯的過程中分解至少一種中間體。具體而言，酶e8可以是能夠在細(xì)胞的脂肪酸降解能力中發(fā)揮作用的酶。具體而言，e8可以選自?；?coa脫氫酶(ei)(fade)、烯酰coa水合酶(ej)(fadb)、3-羥酰-coa脫氫酶(ek)(fadb)和也稱為3-酮脂酰-coa硫解酶的β-酮硫解酶(fada)(el)。

脂肪酸被攝取并經(jīng)由轉(zhuǎn)運(yùn)/?；罨瘷C(jī)制轉(zhuǎn)運(yùn)穿過細(xì)胞膜。第一細(xì)胞內(nèi)步驟涉及通過?；?coa脫氫酶(ei)將?；?coa轉(zhuǎn)化為烯酰-coa，所述?；?coa脫氫酶(ei)在大腸桿菌的情況下被稱為fade。?；?coa脫氫酶的活性可以如現(xiàn)有技術(shù)中所述進(jìn)行測定，例如通過在100mmmops（ph7.4）、0.2mm烯酰-coa、0.4mmnadh中在340nm分光光度監(jiān)測nadh的濃度。通過水合和氧化，將所得烯酰-coa經(jīng)由3-羥酰-coa轉(zhuǎn)化為3-酮脂酰-coa，所述水合和氧化由在大腸桿菌中被稱為fadb和fadj的烯酰-coa水合酶/(r)-3-羥酰-coa脫氫酶(ej/ek)催化。烯酰-coa水合酶/3-羥酰-coa脫氫酶活性，更具體地，產(chǎn)物nadh的形成，可以如現(xiàn)有技術(shù)中所述分光光度測定，例如如針對fade所概述。最后，3-酮脂酰-coa硫解酶(el)（大腸桿菌中的fada和fad1）催化3-酮脂酰-coa的裂解，以得到乙酰-coa，且投入?；?coa縮短兩個(gè)碳原子。酮脂酰-coa硫解酶的活性可以如現(xiàn)有技術(shù)(例如antonenkov,v.,等人,1997)中所述進(jìn)行測定。

在一個(gè)實(shí)例中，如本文所使用，術(shù)語“?；?coa脫氫酶”可以是能夠作為β-氧化途徑的一部分催化酰基-coa轉(zhuǎn)化為烯酰-coa的多肽。例如，大腸桿菌中的多肽fade(登錄號：baa77891.2)可以是?；?coa脫氫酶。如本文所使用，術(shù)語“烯酰-coa水合酶”，也稱為3-羥酰-coa脫氫酶，是指能夠作為β-氧化途徑的一部分通過水合和氧化催化烯酰-coa轉(zhuǎn)化為3-酮脂酰-coa的多肽。

例如，大腸桿菌中的多肽fadb和fadj(分別為登錄號：bae77457.1和p77399.1)是烯酰-coa水合酶。如本文所使用，術(shù)語“酮脂酰-coa硫解酶”可以是指能夠作為β-氧化途徑的最后步驟催化3-酮脂酰-coa的裂解、導(dǎo)致產(chǎn)生縮短兩個(gè)碳原子的?；?coa和乙酰基-coa的多肽。例如，大腸桿菌中的多肽fada和fadi(分別為登錄號：yp_491599.1和p76503.1)是酮脂酰-coa硫解酶。

酶e9和e10

根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞可以進(jìn)一步遺傳修飾以相對于野生型細(xì)胞增加以下的表達(dá)：

-所述酶e9是脂肪酰-輔酶a甲酯酯酶bioh(em)；和/或

-所述酶e10是選自tesa、tesb、ycia、fadm、ybff和ybgc的脂肪酰-輔酶a硫酯酶(en)。

具體而言，em可以能夠?qū)⒅舅狨ニ獬捎坞x脂肪酸和相應(yīng)的醇；和/或en可以能夠?qū)⒅觉?輔酶a水解成游離脂肪酸和輔酶a。

酶e11

根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞可以包含進(jìn)一步遺傳突變，其相對于野生型細(xì)胞增加至少一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)。這種進(jìn)一步突變使得細(xì)胞能夠增加至少一種脂肪酸的攝取。具體而言，所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以是alkl(seqidno:4或5)和/或fadl(seqidno:6)。與野生型細(xì)胞相比，alkl和/或fadl可以作為至少一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)揮功能。在一個(gè)實(shí)例中，所述細(xì)胞可以進(jìn)行遺傳修飾以過表達(dá)fadl和alkl基因兩者。根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞可以進(jìn)一步遺傳修飾以相對于野生型細(xì)胞增加alkl和/或fadl的表達(dá)。

在一個(gè)實(shí)例中，酶e11可以是fadl或baa16205.1。

酶e12

根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞可以包含進(jìn)一步遺傳突變，其相對于野生型細(xì)胞增加ec6.2.1.3、ec2.3.1.86的?；?coa合成酶(酶e12)的表達(dá)。酶e12可以催化脂肪酸轉(zhuǎn)化為脂肪酸的coa酯，即這樣的分子，其中羧基的官能團(tuán)-oh被-s-coa替代。例如，大腸桿菌中的多肽fadd和fadk(分別是登錄號：baa15609.1和np_416216.4)是?；?coa合成酶。在另一個(gè)實(shí)例中，e12可以是yp_001724804.1的長鏈脂肪酸-coa連接酶。

酶e13

酶e13可以能夠?qū)ⅵ?氧代烷酸酯轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的ω-羧基烷酸酯。具體而言，酶e13可以是上文定義的任何酶e3。更具體而言，e13可以選自ec1.14.15.3-的p450烷烴羥化酶(ea)、ec1.14.15.3的alkb烷烴羥化酶(eb)、ec1.1.3.20的雙官能醇氧化酶(ec)、能夠經(jīng)由ω-氧代烷酸酯將ω-羥基烷酸酯直接氧化為相應(yīng)的ω-羧基烷酸酯的雙官能alkj醇脫氫酶(edi)或ec1.1.1.1或ec1.1.1.2的雙官能醇脫氫酶(edii)；和醛脫氫酶(ee)。

酶e14

酶e14可以能夠?qū)ⅵ?羧基烷酸酯轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的ω-羧基烷酸二酯。具體而言，酶e14可以是上文定義的任何酶e4。更具體而言，e14可以是至少一種蠟酯合酶(ef)或醇o(jì)-酰基轉(zhuǎn)移酶(eg)(ec2.3.1.20、ec2.3.1.75或ec2.3.1.84)。

根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞不包含遺傳修飾，所述遺傳修飾相對于野生型細(xì)胞增加選自以下的以下酶e20-e24中的至少一種的表達(dá)：

-ec3.1.2.14或ec3.1.2.22的e20?；?acp硫酯酶，

-ec3.1.2.2、ec3.1.2.18、ec3.1.2.19、ec3.1.2.20或ec3.1.2.22的e21?；?coa硫酯酶，

-e22?；?coa:acp轉(zhuǎn)酰酶，

-e23聚酮化合物合酶，和

-e24己酸合酶。

具體而言，根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞具有酶e20-e24的野生型表達(dá)。因此，在根據(jù)本發(fā)明的方法的細(xì)胞中，酶e20-e24既不過表達(dá)、也不敲除。更具體而言，在根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞中，酶e20-e24中的任一種，即酶e20、e21、e22、e23或e24，所有酶e20、e21、e22、e23和e24的表達(dá)，沒有遺傳修飾。甚至更具體而言，根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞可以包含在開始的細(xì)胞中可以天然存在的酶e20-e24中的任一種的天然、野生型表達(dá)。因此，根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞可以被認(rèn)為不包含酶e20-e24中的任一種的重組表達(dá)。這是特別有利的，因?yàn)槿缓罂梢匀菀椎剡x擇酶e20-e24中的任一種沒有增加表達(dá)(即具有酶e20-e24中的任一種的野生型表達(dá))的細(xì)胞以使用烷烴作為碳源用于ω-官能化羧酸酸酯形成。具體而言，具有酶e20-e24中的任一種的增加表達(dá)的任何細(xì)胞可以導(dǎo)致增加生產(chǎn)這樣的脂肪酸，所述脂肪酸可以用作碳源用于由具有酶e20-e24中的任一種的增加表達(dá)的細(xì)胞形成ω-官能化羧酸和/或其酯。具有酶e20-e24中的任一種的增加表達(dá)的細(xì)胞因此可以有利于使用高濃度的脂肪酸作為底物用于生產(chǎn)ω-官能化羧酸酯，并且烷烴將因此不用于由細(xì)胞形成ω-官能化羧酸酯。使用烷烴以外的其它碳源用于ω-官能化羧酸酯形成可急劇增加生產(chǎn)成本以生產(chǎn)更多的脂肪酸，所述細(xì)胞將需要其它碳源，諸如葡萄糖。因此，根據(jù)本發(fā)明的任一方面使用根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞(其不包含相對于野生型細(xì)胞增加以下酶e20-e24中的至少一種的表達(dá)的遺傳修飾)用于從至少一種烷烴生產(chǎn)至少一種ω-官能化羧酸酯。

酶e20-e24

酶e20-e24在wo2013024114中在wo2013024114的第60-79頁分別詳細(xì)解釋為酶ei至eiv。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了生產(chǎn)至少一種ω-官能化羧酸酯的方法，其中所述方法包括使至少一種根據(jù)根據(jù)本發(fā)明任一方面的細(xì)胞與至少一種烷烴接觸的步驟。具體而言，形成的ω-官能化羧酸酯可以選自ω-羥基-烷酸酯、ω-氧代-烷酸酯、ω-羧基-烷酸酯、ω-氨基-烷酸酯。具體而言，所述ω-官能化羧酸酯可以是來自烷烴十二烷的12-氨基月桂酸甲酯、12-羥基月桂酸甲酯、12-羧基月桂酸甲(二)酯和/或月桂酸甲酯。在另一個(gè)實(shí)例中，生產(chǎn)的ω-官能化羧酸酯可以是來自烷烴十一烷的11-氨基十一烷酸甲酯、11-羥基十一烷酸甲酯、11-羧基十一烷酸甲(二)酯和/或十一烷酸甲酯。在至少一個(gè)進(jìn)一步實(shí)例中，單官能醇和/或醛可以作為副產(chǎn)物形成。

如本文所使用，術(shù)語“接觸”意指在水溶液中使根據(jù)本發(fā)明的任一方面的烷烴和/或細(xì)胞之間直接接觸。例如，所述細(xì)胞和烷烴可以不在通過屏障諸如無機(jī)膜隔開的不同隔室中。如果所述烷烴是可溶的并且可以被細(xì)胞吸收或可以擴(kuò)散穿過生物膜，則其可以簡單地添加至在水溶液中的根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞。在其不充分溶解的情況下，其可以在添加至水溶液中之前溶解于合適的有機(jī)溶劑中。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過添加合適的有機(jī)和/或極性溶劑來制備溶解性不足的烷烴的水溶液。此類溶劑可以以包含液體有機(jī)溶劑的有機(jī)相的形式提供。在一個(gè)實(shí)例中，當(dāng)在25℃和標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下為液體時(shí)，有機(jī)溶劑或相可以被認(rèn)為是液體。在另一個(gè)實(shí)例中，脂肪酸可以以脂肪酸酯諸如相應(yīng)的甲酯或乙酯的形式提供。在另一個(gè)實(shí)例中，化合物和催化劑可以在體外接觸，即以或多或少富集或甚至純化的狀態(tài)接觸，或者可以原位接觸，即它們作為細(xì)胞代謝的一部分制備，且隨后在細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)。

術(shù)語“水溶液”與術(shù)語“水性介質(zhì)”可互換使用，并且是指包含水的任何溶液，主要是水作為溶劑，其可以用于至少暫時(shí)地將根據(jù)本發(fā)明的任一方面的細(xì)胞保持在代謝活性和/或活力狀態(tài)，并且包含(如果此為必要的)任何額外底物。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉制備許多水溶液，通常稱為可用于保持本發(fā)明細(xì)胞的培養(yǎng)基，例如在大腸桿菌的情況下為lb培養(yǎng)基。有利的是使用作為水溶液的基本培養(yǎng)基，即合理簡單組成的培養(yǎng)基，其與復(fù)合培養(yǎng)基相比僅包含用于將細(xì)胞保持在代謝活性和/或存活狀態(tài)必不可少的鹽和營養(yǎng)物的最小集合，以避免具有不想要的副產(chǎn)物的不必要的產(chǎn)物污染。例如，m9培養(yǎng)基可以用作基本培養(yǎng)基。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了從烷烴生產(chǎn)至少一種ω-官能化羧酸酯的方法，其中所述方法包括：

(a)使以下酶與所述烷烴接觸：

(i)能夠?qū)⑺鐾闊N轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的1-烷醇的酶e1；

(ii)能夠?qū)?i)的1-烷醇轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的1-烷醛的酶e2；

(iii)能夠?qū)?ii)的1-烷醛轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的烷酸的酶e3；

(iv)能夠?qū)?iii)的烷酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的烷酸酯的酶e4；和

(v)能夠?qū)?iv)的烷酸酯轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的ω-羥基-烷酸酯的酶e5。

根據(jù)本發(fā)明的任一方面的方法可以包括以下步驟：

(b)使以下酶與所述ω-羥基-烷酸酯接觸：

(vi)能夠?qū)?v)的相應(yīng)的ω-羥基-烷酸酯轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的ω-氧代烷酸酯的酶e6；或

(vii)能夠?qū)?v)的相應(yīng)的ω-羥基-烷酸酯轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的ω-氧代烷酸酯的酶e6和能夠?qū)ⅵ?氧代烷酸酯轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的ω-氨基烷酸酯的酶e7；或

(viii)能夠?qū)?v)的相應(yīng)的ω-羥基-烷酸酯轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的ω-氧代烷酸酯的酶e6和能夠?qū)ⅵ?氧代烷酸酯轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的ω-羧基烷酸酯的酶e13以及能夠?qū)ⅵ?羧基烷酸酯轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的ω-羧基烷酸二酯的酶e14。

根據(jù)本發(fā)明的任一方面使用的酶可以與根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞的上下文中公開的酶是相同的。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例

前述描述了優(yōu)選實(shí)施方案，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在不背離權(quán)利要求的范圍的情況下，其可以進(jìn)行設(shè)計(jì)、構(gòu)建或操作的變化或修改。這些變化例如意欲被權(quán)利要求的范圍所覆蓋。

實(shí)施例1

用攜帶烷烴單加氧酶和蠟酯合酶且催化脂肪酸降解的酶和將脂肪酸酯水解為游離脂肪酸和相應(yīng)醇的酶減弱的全細(xì)胞生物催化劑分別從十二烷和十一烷(以及在甲酯的情況下，甲醇)生產(chǎn)月桂酸(甲酯)和十一烷酸(甲酯)。

實(shí)施例2

用攜帶烷烴單加氧酶、蠟酯合酶和ω-轉(zhuǎn)氨酶且催化脂肪酸降解的酶和將脂肪酸酯水解為游離脂肪酸和相應(yīng)醇的酶減弱的全細(xì)胞生物催化劑分別從十二烷和十一烷生產(chǎn)12-氨基月桂酸甲酯和11-氨基十一烷酸甲酯。

實(shí)施例3

用于過表達(dá)大腸桿菌fadd基因和編碼蠟酯合酶的hahellachejuensis基因的表達(dá)載體的構(gòu)建

載體pcdf-fadd_ec-wes_hche(seqidno:7)攜帶來自大腸桿菌的基因fadd(編碼?；?coa合酶)和針對在大腸桿菌中表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化的來自hahellachejuensis的蠟酯合酶基因(seqidno：2)。盡管?；?coa合酶負(fù)責(zé)將脂肪酸活化為相應(yīng)的coa硫酯，但蠟酯合酶是脂肪酰-coa和醇、更具體地甲醇之間的酯形成所需要的。該載體基于質(zhì)粒pcdfduet-1(merckbiosciences;nottingham,uk)，并且攜帶在tac啟動(dòng)子控制下的fadd基因和在t5啟動(dòng)子控制下的編碼hahellachejuensis蠟酯合酶的基因。通過pcr分別從大腸桿菌w3110的基因組dna擴(kuò)增大腸桿菌fadd以及tac和t5啟動(dòng)子盒，通過dna合成獲得編碼hahellachejuensis蠟酯合酶的基因。使用用于體外重組的市售試劑盒(nebuilderhifidnaassemblycloningkit;neb;frankfurt/main,germany)，將載體骨架和代表大腸桿菌fadd、tac和t5啟動(dòng)子盒和編碼hahellachejuensis蠟酯合酶的基因的四個(gè)dna片段融合，以得到載體pcdf-fadd_ec-wes_hche(seqidno:7).。

實(shí)施例4

能夠?qū)⑼闊N轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的ω-官能化脂肪酸甲酯的大腸桿菌菌株的構(gòu)建

表達(dá)載體pbt10_alkl(關(guān)于構(gòu)建細(xì)節(jié)和所列的seqidno：8,參見wo/2011/131420的實(shí)施例1)含有來自食油假單胞菌(pseudomonasoleovorans)的alk操縱子的基因alkb、alkg、alkt、alks和alkl。相應(yīng)的基因產(chǎn)物催化烷烴氧化成相應(yīng)的烷醇、烷醛和脂肪酸(alkbgt)以及底物的攝取(alkl)。此外，一旦通過酶?；?coa合成酶和蠟酯合酶的作用從脂肪酸和甲醇形成脂肪酸甲酯(參見實(shí)施例1)，alkbgt基因產(chǎn)物還催化脂肪酸甲酯的氧化。載體pj294_aladh_b.s._ta_c.v.(ct)(關(guān)于構(gòu)建細(xì)節(jié)和所列的seqidno：17，參見wo/2013/024114的實(shí)施例1)攜帶來自枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)的基因ald(編碼丙氨酸脫氫酶)和來自紫色色桿菌(chromobacteriumviolaceum)的cv_2505(編碼ω-轉(zhuǎn)氨酶)。盡管ω-轉(zhuǎn)氨酶負(fù)責(zé)將olame和ouame轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的胺alame和auame，但需要丙氨酸脫氫酶從丙酮酸和無機(jī)氨提供胺供體丙氨酸。

將質(zhì)粒pbt10_alkl和pcdf-fadd_ec-wes_hche加上(適當(dāng)時(shí))pj294_aladh_b.s._ta_c.v.(ct)經(jīng)由電穿孔轉(zhuǎn)化至大腸桿菌w3110?bioh?fade中，鋪板于含有卡那霉素(50μg/ml)、氨芐青霉素(100μg/ml)和壯觀霉素(100μg/ml)(如果適用)的lb瓊脂板上。通過質(zhì)粒制備和限制性消化分析篩選轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒的存在和真實(shí)性。生成以下菌株：

●大腸桿菌w3110?bioh?fadepbt10_alkl/pcdf-fadd_ec-wes_hche

●大腸桿菌w3110?bioh?fadepbt10_alkl/pj294_aladh_b.s._ta_c.v.(ct)/pcdf-fadd_ec-wes_hche。

實(shí)施例5

用于將烷烴轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的ω-官能化脂肪酸甲酯的生物轉(zhuǎn)化

菌株大腸桿菌w3110?bioh?fadepbt10_alkl/pcdf-fadd_ec-wes_hche和大腸桿菌w3110?bioh?fadepbt10_alkl/pj294_aladh_b.s._ta_c.v.(ct)/pcdf-fadd_ec-wes_hche經(jīng)受補(bǔ)料分批發(fā)酵、隨后生物轉(zhuǎn)化，以便研究它們從十二烷生產(chǎn)ω-羥基月桂酸甲酯(hlame)、ω-氧代月桂酸甲酯(olame)、ω-氨基月桂酸甲酯(alame)、十二烷二酸單甲酯(ddame)和十二烷二酸二甲酯(ddadme)的能力。所述菌株還經(jīng)受補(bǔ)料分批發(fā)酵、隨后生物轉(zhuǎn)化，以便研究它們從十一烷生產(chǎn)ω-羥基十一烷酸甲酯(huame)、ω-氧代十一烷酸甲酯(ouame)、ω-氨基十一烷酸甲酯(auame)、十一烷二酸單甲酯(udame)和十一烷二酸二甲酯(udadme)的能力。這在來自dasgip的8重平行發(fā)酵系統(tǒng)中實(shí)施。

對于發(fā)酵，使用1l反應(yīng)器，其裝備有頂置式攪拌器和葉輪渦輪。為了監(jiān)測過程，在線測量ph和po2。otr/ctr測量尤其用于估計(jì)細(xì)胞的代謝活性和適合性。

ph探針根據(jù)dasgip提供的技術(shù)參考文獻(xiàn)用ph4.0和ph7.0的測量溶液借助兩點(diǎn)校準(zhǔn)來進(jìn)行校準(zhǔn)。根據(jù)dasgip提供的技術(shù)參考文獻(xiàn)準(zhǔn)備具有所需傳感器和連接的反應(yīng)器，并且安裝攪拌器軸。然后用300ml水裝填反應(yīng)器，并在121℃下高壓滅菌20min以確保無菌。連接至測量放大器后，將po2探針極化過夜（至少6h）。然后在潔凈臺下去除水，并通過高細(xì)胞密度培養(yǎng)基替換，所述高細(xì)胞密度培養(yǎng)基由以下組成：(nh4)2so41.76g/l、k2hpo419.08g/l、kh2po412.5g/l、酵母提取物6.66g/l、檸檬酸三鈉二水合物11.2g/l、17ml/l的濾器滅菌的1%強(qiáng)度的檸檬酸鐵銨溶液和5ml/l的濾器滅菌的痕量元素儲(chǔ)備溶液(其由hcl(37%)36.50g/l、mncl2*4h2o1.91g/l、znso4*7h2o1.87g/l、乙二胺四乙酸二水合物0.84g/l、h3bo30.30g/l、na2moo4*2h2o0.25g/l、cacl2*2h2o4.70g/l、feso4*7h2o17.80g/l、cucl2*2h2o0.15g/l組成)，具有15g/l葡萄糖作為碳源(通過計(jì)量添加30ml/l無菌補(bǔ)料溶液來添加，所述補(bǔ)料溶液由500g/l葡萄糖、1%(w/v)mgso4*7h2o和2.2%(w/v)nh4cl組成)，以及50mg/l卡那霉素。

隨后，根據(jù)dasgip提供的技術(shù)參考文獻(xiàn)，將po2探針使用單點(diǎn)校準(zhǔn)（攪拌器：600rpm/通氣:10sl/h空氣）進(jìn)行校準(zhǔn)至100％，并且借助原地清潔（cleaning-in-place）清潔補(bǔ)料、校正劑(correctionagent)和誘導(dǎo)劑部分(stretches)。為此，將管首先用70％乙醇、隨后用1mnaoh、隨后用無菌的去礦物質(zhì)水沖洗，并最終用各種培養(yǎng)基裝滿。

所有前述的大腸桿菌菌株首先從冷凍培養(yǎng)物在具有50mg/l卡那霉素的lb培養(yǎng)基(25ml，于100ml帶有擋板的搖瓶中)中在37℃和200rpm下過夜培養(yǎng)約18h。然后，將2ml的該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至100ml搖瓶中的25ml的高細(xì)胞密度培養(yǎng)基中并在37℃/200rpm下再孵育6h進(jìn)行第二預(yù)培養(yǎng)階段，所述高細(xì)胞密度培養(yǎng)基由以下組成：(nh4)2so41.76g/l、k2hpo419.08g/l、kh2po412.5g/l、酵母提取物6.66g/l、檸檬酸三鈉二水合物11.2g/l、17ml/l的濾器滅菌的1%強(qiáng)度的檸檬酸鐵銨溶液和5ml/l的濾器滅菌的痕量元素儲(chǔ)備溶液(其由hcl(37%)36.50g/l、mncl2*4h2o1.91g/l、znso4*7h2o1.87g/l、乙二胺四乙酸二水合物0.84g/l、h3bo30.30g/l、na2moo4*2h2o0.25g/l、cacl2*2h2o4.70g/l、feso4*7h2o17.80g/l、cucl2*2h2o0.15g/l組成)，具有15g/l葡萄糖作為碳源(通過計(jì)量添加30ml/l無菌補(bǔ)料溶液來添加，所述補(bǔ)料溶液由500g/l葡萄糖、1%(w/v)mgso4*7h2o和2.2%(w/v)nh4cl組成)，以及已描述的抗生素。

為了以0.1的光密度接種反應(yīng)器，測量第二預(yù)培養(yǎng)階段的od600，并計(jì)算接種所需的培養(yǎng)物的量。借助于5ml注射器將所需量的培養(yǎng)物經(jīng)隔膜(septum)添加入經(jīng)熱處理且通氣的反應(yīng)器中。

使用以下標(biāo)準(zhǔn)程序：

。

用12.5%強(qiáng)度的氨溶液在一側(cè)將ph調(diào)節(jié)至ph6.8。在培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化期間，借助攪拌器補(bǔ)料和通氣速率將培養(yǎng)物中的溶解氧(po2或do)調(diào)節(jié)至至少30％。接種后，do從100％降至30％，其中其對于發(fā)酵的剩余過程中保持穩(wěn)定。

發(fā)酵作為補(bǔ)料分批實(shí)施，其中經(jīng)由誘導(dǎo)分批期結(jié)束的do峰，用由500g/l葡萄糖、1%(w/v)mgso4*7h2o和2.2%(w/v)nh4cl組成的5g/l*h葡萄糖補(bǔ)料，引發(fā)補(bǔ)料開始為進(jìn)入補(bǔ)料期。隨著補(bǔ)料開始，37℃的溫度降低至30℃。補(bǔ)料開始后10h，用0.025%(v/v)dcpk誘導(dǎo)氧化基因的表達(dá)。補(bǔ)料開始后14h，實(shí)施生產(chǎn)的開始（＝生物轉(zhuǎn)化的開始）。為此目的，將150ml的十二烷或十一烷作為一批添加至發(fā)酵液中。

為了定量發(fā)酵樣品中的lsme和hls，在生物轉(zhuǎn)化開始后1/2/4/20/22h取樣。制備這些樣品用于如實(shí)施例6中提供的分析。

實(shí)施例6

產(chǎn)物的基于lc-esi/ms²的定量

發(fā)酵樣品中hlame、olame、alame、ddame和ddadme以及huame、ouame、auame、udame和udadme的定量借助lc-esi/ms²參考所有分析物的外部校準(zhǔn)(0.1–50mg/l)并使用內(nèi)標(biāo)氨基十一烷酸(對于hlsme，aua)和d3-lsme(對于lsme)來實(shí)施。

在此使用以下儀器：

●具有自動(dòng)取樣器(g1367e)、二元泵(g1312b)和柱溫箱(g1316a)的hplc系統(tǒng)1260(agilent;b?blingen)

●具有esi源的質(zhì)譜儀tripelquad6410(agilent;b?blingen)

●hplc柱：kinetexc18,100x2.1mm,粒徑:2.6μm,孔徑100?(phenomenex;aschaffenburg)

●預(yù)柱：krudkatcherultrahplc串聯(lián)濾器；0.5μm濾器深度和0.004mm內(nèi)徑(phenomenex;aschaffenburg)。

通過移取1900μl溶劑(80%(v/v)乙腈、20%雙蒸h2o(v/v)和0.1%甲酸)和100μl樣品至2ml反應(yīng)容器中來制備樣品。將混合物渦旋約10秒，然后以約13000rpm離心5min。使用移液器移取澄清的上清液，并在用稀釋劑(80%(v/v)acn、20%雙蒸h2o(v/v)和0.1%甲酸)適當(dāng)稀釋后進(jìn)行分析。將100μl的istd移取至每一900μl樣品中(對于90μl的樣品體積，10μl)。

用上述柱或預(yù)柱實(shí)施hplc分離。注射體積為0.7μl，柱溫為50℃，流速為0.6ml/min。流動(dòng)相由洗脫液a(0.1%(v/v)甲酸水溶液)和洗脫液b(含0.1%(v/v)甲酸的乙腈)組成。使用以下梯度概況：

。

用esi源的以下參數(shù)以正離子化模式實(shí)施esi-ms2分析：

●氣體溫度280℃

●氣體流速11l/min

●霧化壓力50psi

●毛細(xì)管電壓4000v。

化合物hlame、olame、alame、ddame、ddadme、huame、ouame、auame、udame和udadme的檢測和定量用以下mrm參數(shù)進(jìn)行，在每種情況下一種產(chǎn)物離子用作定性物(qualifier)，且一種用作定量物(quantifier)：

表1.以sim模式(m/z201和215)檢測分析物la和lame。

實(shí)施例7

通過大腸桿菌w3110?bioh?fadepbt10_alkl/pcdf-fadd_ec-wes_hche和大腸桿菌w3110?bioh?fadepbt10_alkl/pj294_aladh_b.s._ta_c.v.(ct)/pcdf-fadd_ec-wes_hche將烷烴轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的ω-官能化脂肪酸甲酯

使用上述方案，可以顯示大腸桿菌w3110?bioh?fadepbt10_alkl/pcdf-fadd_ec-wes_hche從十二烷生產(chǎn)ddame和ddadme以及從十一烷生產(chǎn)udame和udadme(參見表1和2)。此外，可以顯示大腸桿菌w3110?bioh?fadepbt10_alkl/pj294_aladh_b.s._ta_c.v.(ct)/pcdf-fadd_ec-wes_hche從十二烷生產(chǎn)hlame和alame以及從十一烷生產(chǎn)huame和auame(參見表2和3)。

表2.用菌株大腸桿菌w3110?bioh?fadepbt10_alkl/pcdf-fadd_ec-wes_hche(菌株1)和大腸桿菌w3110?bioh?fadepbt10_alkl/pj294_aladh_b.s._ta_c.v.(ct)/pcdf-fadd_ec-wes_hche(菌株2)由十二烷形成的ω-官能化脂肪酸甲酯的濃度。

表3.用菌株大腸桿菌w3110?bioh?fadepbt10_alkl/pcdf-fadd_ec-wes_hche(菌株1)和大腸桿菌w3110?bioh?fadepbt10_alkl/pj294_aladh_b.s._ta_c.v.(ct)/pcdf-fadd_ec-wes_hche(菌株2)由十一烷形成的ω-官能化脂肪酸甲酯的濃度。

序列表

<110>evonikdegussagmbh

<120>ω-官能化羧酸及其酯的生物技術(shù)生產(chǎn)

<130>201500273ep

<150>ep15196180

<151>2015-11-25

<160>7

<170>patentin版本3.5

<210>1

<211>401

<212>prt

<213>惡臭假單胞菌

<400>1

metleuglulyshisargvalleuaspseralaproglutyrvalasp

151015

lyslyslystyrleutrpileleuserthrleutrpproalathrpro

202530

metileglyiletrpleualaasngluthrglytrpglyilephetyr

354045

glyleuvalleuleuvaltrptyrglyalaleuproleuleuaspala

505560

metpheglygluasppheasnasnproproglugluvalvalprolys

65707580

leuglulysgluargtyrtyrargvalleuthrtyrleuthrvalpro

859095

methistyralaalaleuilevalseralatrptrpvalglythrgln

100105110

prometsertrpleugluileglyalaleualaleuserleuglyile

115120125

valasnglyleualaleuasnthrglyhisgluleuglyhislyslys

130135140

gluthrpheaspargtrpmetalalysilevalleualavalvalgly

145150155160

tyrglyhisphepheilegluhisasnlysglyhishisargaspval

165170175

alathrprometaspproalathrserargmetglygluseriletyr

180185190

lyspheserilearggluileproglyalapheileargalatrpgly

195200205

leuglugluglnargleuserargargglyglnservaltrpserphe

210215220

aspasngluileleuglnprometileilethrvalileleutyrala

225230235240

valleuleualaleupheglyprolysmetleuvalpheleuproile

245250255

glnmetalapheglytrptrpglnleuthrseralaasntyrileglu

260265270

histyrglyleuleuargglnlysmetgluaspglyargtyrgluhis

275280285

glnlysprohishissertrpasnserasnhisilevalserasnleu

290295300

valleuphehisleuglnarghisserasphishisalahisprothr

305310315320

argsertyrglnserleuargasppheproglyleuproalaleupro

325330335

thrglytyrproglyalapheleumetalametileproglntrpphe

340345350

argservalmetaspprolysvalvalasptrpalaglyglyaspleu

355360365

asnlysileglnileaspaspsermetarggluthrtyrleulyslys

370375380

pheglythrserseralaglyhisserserserthrseralavalala

385390395400

ser

<210>2

<211>458

<212>prt

<213>hahellachejuensis

<400>2

metthrproleuserprovalaspglnilepheleutrpleuglulys

151015

argglnglnpromethisvalglyglyleuhisilepheserphepro

202530

aspaspalaaspalalystyrmetthrgluleualaglnglnleuarg

354045

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505560

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65707580

hisphearghisglualaleuprolysproglyargilearggluleu

859095

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100105110

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115120125

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130135140

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145150155160

metproproiletrpalaileserlysaspvalthrproalaargglu

165170175

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180185190

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195200205

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210215220

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225230235240

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245250255

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260265270

cysglyseralaleuargasntyrleuleuserargglnalaleupro

275280285

aspglnproleuilealametalaprometserileargglnaspasp

290295300

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305310315320

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325330335

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355360365

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370375380

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385390395400

mettyrprovalserileprovalasptyralaalaleuasnilethr

405410415

leuvalsertyrargaspglnleuglupheglyphethralacysarg

420425430

argthrleuprosermetglnargleuleuasptyrilegluglngly

435440445

ilealagluleuglulysalaalaglyval

450455

<210>3

<211>459

<212>prt

<213>紫色色桿菌

<400>3

metglnlysglnargthrthrserglntrparggluleuaspalaala

151015

hishisleuhisprophethraspthralaserleuasnglnalagly

202530

alaargvalmetthrargglygluglyvaltyrleutrpaspserglu

354045

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505560

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65707580

gluleuprophetyrasnthrphephelysthrthrhisproalaval

859095

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100105110

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195200205

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<210>4

<211>230

<212>prt

<213>惡臭假單胞菌

<400>4

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151015

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<210>5

<211>230

<212>prt

<213>人工序列

<220>

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151015

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