本發(fā)明涉及一種生物提取方法，尤其涉及一種印楝素的發(fā)酵提取方法。

背景技術：

植物內生菌更容易產生抗菌物質或新型生物活性物質。植物內生菌是指在某一時期生活在植物體內，但對寄主植物組織并不引起明顯病害癥狀的細菌。包括那些在其生活史中的某一階段營表面生活的腐生菌，以及對宿主暫時沒有傷害的潛伏性病原菌和菌根菌。內生菌能夠產生活性很強的次生代謝產物，包括抗生素、殺昆蟲物質、植物生長調節(jié)劑、抗腫瘤活性物質等，而這些化合物包括生物堿、甾醇、萜類、大環(huán)內酯等多種類型并具有新穎的化學結構,近年來已成為國內外研究的焦點。

印楝屬楝科植物，為熱帶樹種,具有很高的生物農藥和醫(yī)藥價值。印楝殺蟲劑是當今世界公認的最優(yōu)秀的生物農藥之一，對200多種昆蟲有作用，具有很強的殺蟲、拒食、抑制生長發(fā)育、胃毒、忌避、抑制呼吸、抑制昆蟲激素分泌、抑制昆蟲生育能力等作用。它的殺蟲效果具有廣譜、高效、低毒、無殘留、對人畜無毒副作用、對害蟲天敵安全及持效期長、不易產生抗藥性等特點。印楝素是目前世界上公認的活性最強的拒食劑，因而被認為是最適合于商品化開發(fā)的植物源殺蟲劑。但目前由于氣候原因，國內只有海南、云南、廣東可以引種栽培，印楝素制劑因價格居高不下無法廣泛應用。

目前，全球有近20個國家對印楝素進行研究、開發(fā)和利用，國際上定期召開全球印楝科學與應用會議。1985年Grace在美國注冊的印楝制劑“Margosano”是世界上第一個真正商品化的植物殺蟲劑，而印楝素田間使用具有明顯的局限性，最為突出的是其持效期短。目前，對印楝素的研究大部分停留在：(1)制劑穩(wěn)定性能的研究：Sundram在實驗中發(fā)現一種紫外光吸收劑能增強印楝素的穩(wěn)定性；Szeto發(fā)現在PH1-7的緩沖液中其分解率不大，而在PH10的緩沖液中其分解則很快；Andrew發(fā)現印楝素在弱酸環(huán)境(PH4-6)很穩(wěn)定。(2)印楝素分子結構與作用強度關系的研究：Enris等研究克羅登烷雙萜結構的拒食活性，Deota等研究各種印楝素成分對拒食活性和昆蟲毒性的大小等。(3)印楝細胞的培養(yǎng)條件的優(yōu)化；(4)國內的研究集中在印楝素與其他農藥混配制劑的開發(fā)的研究。華南農大是我國最早開始研究印楝素應用開發(fā)的單位。

關于印楝植物內生菌的研究，國外曾報道過生長在印度的印楝植物內生真菌的分離和鑒定；國內曾報道對云南元江印楝植物內生真菌進行分離并進行種類鑒定，邵士成等對印楝內生真菌的多樣性及抗菌活性進行研究。但目前未見從印楝植物提取到含印楝素的內生菌，并從該內生菌發(fā)酵液提取印楝素的技術研究報道。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的就在于為了解決上述問題而提供一種印楝素的發(fā)酵提取方法。

本發(fā)明通過以下技術方案來實現上述目的：

本發(fā)明包括以下步驟：

(1)內生菌分離：采用自來水將所采集的印楝植物組織表面沖洗干凈→晾干水分后分別切取不同組織部位，采用下述方法進行表面消毒：0.1％升汞漂洗10—30S→無菌水沖洗數次75％酒精漂洗30-60S→無菌水沖洗數次；在無菌操作條件下取組織塊切成0.2cmx0.2cm長段，每個種源地的植株組織塊植于加青霉素的PDA(馬鈴薯蔗糖瓊脂糖)培養(yǎng)基中，在28±1℃條件下置于溫箱靜止培養(yǎng)；

(2)菌株純化：將上述經表面滅菌的材料不做任何處理直接種植于加青霉素的PDA培養(yǎng)基中，在28±1℃條件下置于溫箱培養(yǎng)，檢查表面消毒是否徹底；將種植樣品的PDA平板置于28±1℃溫箱培養(yǎng)3-15d待各植物組織切面長出菌絲后挑取邊緣部分移至新的PDA培養(yǎng)基上，劃線法純化；設兩類空白對照,一類采用漂洗液檢驗法,另一類采用組織印跡法以上兩種對照處理的分離培養(yǎng)基平板上無菌落出現,表明植物材料表面消毒徹底,分離到的是內生菌；

(3)菌種鑒定:采用P DA培養(yǎng)基和促孢培養(yǎng)基進行插片培養(yǎng)，對分離所得菌進行菌落特征和顯微形態(tài)特征觀察，并通過分子生物學方法做rDNA ITS(Internal Transcribed Spacer，內轉錄間隔區(qū))序列分析進行分子生物學鑒定；

(4)菌液發(fā)酵：將內生菌分別接種到250ml裝有相對應培養(yǎng)基的三角瓶中，進行搖床培養(yǎng)，細菌在370C,150r/min培養(yǎng)2d，真菌在300C,150r/min培養(yǎng)3d.

(5)抗蟲活性菌株篩選：選取有報道對印楝敏感的農業(yè)害蟲(如斜紋夜蛾、草地貪夜蛾、蚜蟲、家蠶、菜青蟲等)，采用蟲體浸漬法：將實驗室飼養(yǎng)的試蟲用毛筆挑入漏勺中，在已發(fā)酵好的內生菌菌液中浸30s取出，自然晾干后，挑入直徑12cm的培養(yǎng)皿中，并放入新鮮苞菜葉；設無菌水與對應的培養(yǎng)基為對照，每個處理20頭，重復3次"于溫度280C，光周期L:D＝16:8,相對濕度75％-85％的恒溫生化培養(yǎng)箱中飼養(yǎng),24,48,72,96,120h后觀察其死亡蟲數，并計算死亡率；或采用食葉浸漬法：取新鮮、幼嫩、沒有施過藥的甘藍葉片，浸入已發(fā)酵好的內生菌菌液中10s取出，自然晾干，置于直徑12cm的培養(yǎng)皿中(在葉柄部包裹沾有保濕劑的脫脂棉，以保證葉片新鮮)，用毛筆輕輕挑入饑餓12h的試蟲，設無菌水和相應的發(fā)酵培養(yǎng)基為對照，每個處理20頭，重復3次于溫度280C，光周期L:D＝16:8,相對濕度75％-85％的恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24,48,72,96,120h后觀察其死亡蟲數，并計算死亡率；

(6)發(fā)酵產物提?。菏占z體，分別用乙醇、氯仿、石油醚、乙酸乙酯、甲醇等進行抽提，得到最佳提取工藝。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明是一種印楝素的發(fā)酵提取方法，與現有技術相比，本發(fā)明通過內生菌分離，發(fā)酵，提取發(fā)酵液中印楝活性物質獲得抗蟲活性較高的次生代謝產物是目前適合國內開發(fā)印楝農藥的一條有效途徑，具有非常大的市場開發(fā)潛力。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的流程圖。

具體實施方式

下面結合附圖對本發(fā)明作進一步說明：

如圖1所示：本發(fā)明包括以下步驟：

(1)內生菌分離：采用自來水將所采集的印楝植物組織表面沖洗干凈→晾干水分后分別切取不同組織部位，采用下述方法進行表面消毒：0.1％升汞漂洗10—30S→無菌水沖洗數次75％酒精漂洗30-60S→無菌水沖洗數次；在無菌操作條件下取組織塊切成0.2cmx0.2cm長段，每個種源地的植株組織塊植于加青霉素的PDA(馬鈴薯蔗糖瓊脂糖)培養(yǎng)基中，在28±1℃條件下置于溫箱靜止培養(yǎng)；

(2)菌株純化：將上述經表面滅菌的材料不做任何處理直接種植于加青霉素的PDA培養(yǎng)基中，在28±1℃條件下置于溫箱培養(yǎng)，檢查表面消毒是否徹底；將種植樣品的PDA平板置于28±1℃溫箱培養(yǎng)3-15d待各植物組織切面長出菌絲后挑取邊緣部分移至新的PDA培養(yǎng)基上，劃線法純化；設兩類空白對照,一類采用漂洗液檢驗法,另一類采用組織印跡法以上兩種對照處理的分離培養(yǎng)基平板上無菌落出現,表明植物材料表面消毒徹底,分離到的是內生菌；

(3)菌種鑒定:采用P DA培養(yǎng)基和促孢培養(yǎng)基進行插片培養(yǎng)，對分離所得菌進行菌落特征和顯微形態(tài)特征觀察，并通過分子生物學方法做rDNA ITS(Internal Transcribed Spacer，內轉錄間隔區(qū))序列分析進行分子生物學鑒定；

(4)菌液發(fā)酵：將內生菌分別接種到250ml裝有相對應培養(yǎng)基的三角瓶中，進行搖床培養(yǎng)，細菌在370C,150r/min培養(yǎng)2d，真菌在300C,150r/min培養(yǎng)3d.

(5)抗蟲活性菌株篩選：選取有報道對印楝敏感的農業(yè)害蟲(如斜紋夜蛾、草地貪夜蛾、蚜蟲、家蠶、菜青蟲等)，采用蟲體浸漬法：將實驗室飼養(yǎng)的試蟲用毛筆挑入漏勺中，在已發(fā)酵好的內生菌菌液中浸30s取出，自然晾干后，挑入直徑12cm的培養(yǎng)皿中，并放入新鮮苞菜葉；設無菌水與對應的培養(yǎng)基為對照，每個處理20頭，重復3次"于溫度280C，光周期L:D＝16:8,相對濕度75％-85％的恒溫生化培養(yǎng)箱中飼養(yǎng),24,48,72,96,120h后觀察其死亡蟲數，并計算死亡率；或采用食葉浸漬法：取新鮮、幼嫩、沒有施過藥的甘藍葉片，浸入已發(fā)酵好的內生菌菌液中10s取出，自然晾干，置于直徑12cm的培養(yǎng)皿中(在葉柄部包裹沾有保濕劑的脫脂棉，以保證葉片新鮮)，用毛筆輕輕挑入饑餓12h的試蟲，設無菌水和相應的發(fā)酵培養(yǎng)基為對照，每個處理20頭，重復3次于溫度280C，光周期L:D＝16:8,相對濕度75％-85％的恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24,48,72,96,120h后觀察其死亡蟲數，并計算死亡率；

(6)發(fā)酵產物提?。菏占z體，分別用乙醇、氯仿、石油醚、乙酸乙酯、甲醇等進行抽提，得到最佳提取工藝。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征及本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。