本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是一種檢測(cè)大分子水產(chǎn)膠原蛋白或明膠的PCR引物及方法。
背景技術(shù)：
膠原蛋白原本指的是生物體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的一類結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，是一類外觀呈白色、不透明、沒(méi)有支鏈的纖維型蛋白質(zhì)，它在生物體內(nèi)作為一種重要的功能性蛋白質(zhì)，在細(xì)胞再生、保證皮膚、骨骼發(fā)揮正常功能中有著重要作用，同時(shí)也與細(xì)胞分化、細(xì)胞衰老、關(guān)節(jié)潤(rùn)滑及疾病產(chǎn)生息息相關(guān)。目前，市售膠原蛋白主要來(lái)源于陸源性畜禽(豬、牛等)皮骨、淡水魚(yú)魚(yú)皮、魚(yú)鱗以及深海魚(yú)皮等，而水產(chǎn)膠原蛋白因其優(yōu)良的理化特性和生理活性功能，漸漸成為市售膠原蛋白主要來(lái)源，也逐漸被人們所認(rèn)可。
隨著膠原蛋白在市場(chǎng)上的流通，膠原蛋白的品質(zhì)及其來(lái)源也成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)：最初對(duì)于膠原蛋白產(chǎn)品的鑒定，大都通過(guò)外觀、氣味進(jìn)行觀察識(shí)別，但此方法準(zhǔn)確性較差，檢測(cè)的結(jié)果并不可靠，不值得提倡。進(jìn)一步的，膠原蛋白產(chǎn)品的鑒別采用理化鑒定方法，如鈣鹽沉淀法以及鹽酸部分水解法等，這類鑒別方法同樣存在弊端：準(zhǔn)確性差、重復(fù)性低，可操作不強(qiáng)等，未能得到很好的使用。
PCR技術(shù)自發(fā)明以來(lái)被廣泛證明具有高特異性，高靈敏度的特點(diǎn)，在鑒定物種來(lái)源中發(fā)揮著重要作用。本發(fā)明所參考序列線粒體基因組具有種內(nèi)高度保守性，特別是線粒體12SrRNA基因具有抗腐蝕以及耐高溫的特點(diǎn)，廣泛被應(yīng)用于牛肉、豬肉及其制品、其他肉類加工制品以及飼料的檢測(cè)。本發(fā)明利用水產(chǎn)品的線粒體——12SrRNA基因進(jìn)行測(cè)定與鑒別，以期為水產(chǎn)膠原蛋白的檢測(cè)提供有效的分子標(biāo)記系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)膠原蛋白類制品行業(yè)的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化以及國(guó)際化。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了實(shí)現(xiàn)對(duì)市售水產(chǎn)膠原蛋白產(chǎn)品的鑒別，同時(shí)也為魚(yú)皮魚(yú)鱗膠原產(chǎn)品質(zhì)量控制、膠原蛋白類藥物的質(zhì)量控制以及含膠原生物材料、醫(yī)療器械、生化材料質(zhì)量控制提供理論依據(jù)與技術(shù)借鑒，實(shí)現(xiàn)膠原蛋白類制品行業(yè)的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化以及國(guó)際化，本發(fā)明提出了一種檢測(cè)大分子水產(chǎn)膠原蛋白或明膠的PCR引物及方法，其技術(shù)方案如下：
一種檢測(cè)大分子水產(chǎn)膠原蛋白或明膠的PCR引物及方法，其特征在于：所述PCR引物分別為COD ID NO：1&COD ID NO：2或TIL ID NO：1&TIL ID NO：2或RAF ID NO：1&RAF ID NO：2；其中，所述引物上下游核苷酸序列分別為：
COD ID NO：1ACCTCCGATTCCACGAAAG
COD ID NO：2ACGCTACACCTCGACCTGAC
TIL ID NO：1GGCTTGGTCCTGACTTTACTG
TIL ID NO：2CCTGATACCGGCTCCTTGTT
RAF ID NO：1AGCCCTAAACCCAGATGTCC
RAF ID NO：2AGCCCATTTCTTCCCACTTC
所述檢測(cè)方法包括以下步驟：
(1)對(duì)膠原蛋白樣本進(jìn)行預(yù)處理，直至膠原蛋白粉末被完全消化；
(2)提取膠原蛋白樣本中的DNA作為核苷酸檢測(cè)的模板；
(3)將樣本中所提取的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
(4)將擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并確定產(chǎn)物的目標(biāo)條帶。
進(jìn)一步的，所述步驟(3)中PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min；所述PCR反應(yīng)體系包括樣本DNA 1ul，2×Tap PCR Master Mix 12.5ul，ddH2O 9.5ul，上下游引物各1ul。
進(jìn)一步的，所述步驟(3)設(shè)置陰性對(duì)照，所述陰性對(duì)照組為去離子水。
進(jìn)一步的，所述樣本DNA由DNA提取試劑盒提取獲得。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有如下優(yōu)點(diǎn)：
本發(fā)明根據(jù)三種魚(yú)類線粒體保守基因12srRNA設(shè)計(jì)了大量引物，從中選取出了可對(duì)不同種類水產(chǎn)膠原蛋白進(jìn)行有效檢測(cè)的引物，與樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增生成特異性的基因片段，之后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳過(guò)程得出樣品鑒定的結(jié)果，其檢測(cè)方法具有高特異性，高靈敏度以及實(shí)用性的特點(diǎn)，能夠有效的對(duì)水產(chǎn)膠原蛋白物種來(lái)源進(jìn)行檢測(cè)。樣品DNA由深加工食品DNA提取試劑盒DNeasymericon Food Kit(德國(guó)Qiagen公司)提取獲得，操作過(guò)程嚴(yán)格依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，保證獲取足夠的DNA量進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。本發(fā)明檢測(cè)方法具有高特異性、高靈敏度的特點(diǎn)，現(xiàn)已在鑒定物種來(lái)源中發(fā)揮著重要作用，檢測(cè)的結(jié)果精確可靠。同時(shí)，本發(fā)明的引物序列經(jīng)過(guò)本領(lǐng)域相關(guān)軟件DNAman、Primer Premier 6.0、Oligo 7設(shè)計(jì)獲得，三對(duì)引物分別對(duì)各自物種的12SrDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，不會(huì)擴(kuò)增該物種的其它區(qū)域以及其它物種的DNA序列，其引物干粉可通過(guò)化學(xué)合成方法獲得。
附圖說(shuō)明
圖1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖譜。
其中，圖a為羅非魚(yú)膠原蛋白檢測(cè)結(jié)果，圖b為鱈魚(yú)膠原蛋白檢測(cè)圖譜，圖c為斑點(diǎn)叉尾鮰膠原蛋白檢測(cè)圖譜。
樣品順序?yàn)椋篗-分子量Marker；1-豬膠原蛋白；2-鱈魚(yú)膠原蛋白；3-羅非魚(yú)膠原蛋白；4-牛膠原蛋白；5-斑點(diǎn)叉尾鮰膠原蛋白；6-水。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖1對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說(shuō)明，如圖1所示，一種檢測(cè)大分子水產(chǎn)膠原蛋白或明膠的PCR引物及方法，其特征在于：所述PCR引物分別為COD ID NO：1&COD ID NO：2或TIL ID NO：1&TIL ID NO：2或RAF ID NO：1&RAF ID NO：2；其中，所述引物上下游核苷酸序列分別為：
COD ID NO：1ACCTCCGATTCCACGAAAG
COD ID NO：2ACGCTACACCTCGACCTGAC
TIL ID NO：1GGCTTGGTCCTGACTTTACTG
TIL ID NO：2CCTGATACCGGCTCCTTGTT
RAF ID NO：1AGCCCTAAACCCAGATGTCC
RAF ID NO：2AGCCCATTTCTTCCCACTTC
所述檢測(cè)方法包括以下步驟：
(1)對(duì)膠原蛋白樣本進(jìn)行預(yù)處理，直至膠原蛋白粉末被完全消化；
(2)提取膠原蛋白樣本中的DNA作為核苷酸檢測(cè)的模板；
(3)將樣本中所提取的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
(4)將擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并確定產(chǎn)物的目標(biāo)條帶。
其中，樣品DNA樣品由深加工食品DNA提取試劑盒DNeasymericon Food Kit(德國(guó)Qiagen公司)提取獲得，操作過(guò)程嚴(yán)格依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，保證獲取足夠的DNA量進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在此基礎(chǔ)上再對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)。
所述步驟(3)中PCR反應(yīng)程序?yàn)椋涸?4℃條件下進(jìn)行預(yù)變性5min，接著94℃條件下變性30s，然后55℃條件下退火30s，再72℃條件下延伸1min，一共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后在72℃條件下延伸10min；所述PCR反應(yīng)體系包括樣本DNA 1ul，2×Tap PCR Master Mix 12.5ul，ddH2O 9.5ul，上下游引物各1ul。
作為優(yōu)選方案，所述步驟(3)設(shè)置陰性對(duì)照，所述陰性對(duì)照組為去離子水。
作為優(yōu)先方案，所述樣本DNA由DNA提取試劑盒提取獲得。
實(shí)施例1：羅非魚(yú)膠原蛋白檢測(cè)
(1)DNA提取：取羅非魚(yú)膠原蛋白樣品2g，使用DNeasymericon Food Kit試劑盒或者同類型食品深加工DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取。提取過(guò)程中的操作要嚴(yán)格依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，保證獲取足夠的DNA量進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在此基礎(chǔ)上再對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)。
(2)PCR擴(kuò)增：建立25ul PCR反應(yīng)體系：取1ul提取的DNA模板，2×Tap PCR Master Mix 12.5ul，ddH2O 9.5ul，上下游引物均為1ul。PCR反應(yīng)進(jìn)程為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)。
(3)凝膠電泳：制備2％的瓊脂糖凝膠，混合DNA樣品、上樣緩沖液和膠體染色劑SYBR Green I并將其加入至膠體點(diǎn)樣孔中。接通電源進(jìn)行電泳，80V恒壓電泳40min后凝膠成像系統(tǒng)下拍照，如圖1a所示。
實(shí)施例2：鱈魚(yú)膠原蛋白檢測(cè)
(1)DNA提?。喝△L魚(yú)膠原蛋白樣品2g，使用DNeasymericon Food Kit試劑盒或者
同類型食品深加工DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取。提取過(guò)程中的操作要嚴(yán)格依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，保證獲取足夠的DNA量進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在此基礎(chǔ)上再對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)。
(2)PCR擴(kuò)增：建立25ul PCR反應(yīng)體系：取1ul提取的DNA，2×Tap PCR Master Mix 12.5ul，ddH2O 9.5ul，上下游引物均為1ul。PCR反應(yīng)進(jìn)程為預(yù)變性94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)。
(3)凝膠電泳：制備2％的瓊脂糖凝膠，混合DNA樣品、上樣緩沖液和膠體染色劑SYBR Green I并將其加入至膠體點(diǎn)樣孔中。接通電源進(jìn)行電泳，80V恒壓電泳40min后凝膠成像系統(tǒng)下拍照，如圖1b所示。
實(shí)施例3：斑點(diǎn)叉尾鮰膠原蛋白的檢測(cè)
(1)DNA提?。喝“唿c(diǎn)叉尾鮰膠原蛋白樣品2g，使用DNeasymericon Food Kit試劑盒或者同類型食品深加工DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取。提取過(guò)程中的操作要嚴(yán)格依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，保證獲取足夠的DNA量進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在此基礎(chǔ)上再對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)。
(2)PCR擴(kuò)增：建立25ul PCR反應(yīng)體系：取1ul提取的DNA，2×Tap PCR Master Mix 12.5ul，ddH2O 9.5ul，上下游引物和模板均為1ul。PCR反應(yīng)進(jìn)程為預(yù)變性94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)。
(3)凝膠電泳：制備2％的瓊脂糖凝膠，混合DNA樣品、上樣緩沖液和膠體染色劑SYBR Green I并將其加入至膠體點(diǎn)樣孔中。接通電源進(jìn)行電泳，80V恒壓電泳40min后凝膠成像系統(tǒng)下拍照，如圖1c所示。
以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以所述權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。