本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及幾丁質(zhì)特異誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子Ptchi2和特異性順式作用元件及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

基因表達(dá)調(diào)控是基因工程研究的中心內(nèi)容之一，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控發(fā)生在基因表達(dá)的初期，是基因表達(dá)調(diào)控的主要方式，啟動(dòng)子則是基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)調(diào)控的重要和關(guān)鍵元件，在基因的調(diào)控方面起著決定性作用。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子靈活的表達(dá)調(diào)控方式賦予了生物更強(qiáng)的適應(yīng)環(huán)境變化能力和廣闊的開發(fā)利用前景。利用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子代替組成型啟動(dòng)子，已成為實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)調(diào)控的一個(gè)重要策略，并應(yīng)用于酵母的外源基因表達(dá)調(diào)控、植物抗逆和抗病蟲基因工程領(lǐng)域。如典型的巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，利用的是醇氧化酶-1(AOX1)基因的啟動(dòng)子，誘導(dǎo)物為甲醇，目前已廣泛應(yīng)用于異源蛋白的表達(dá)調(diào)控，但是甲醇有毒易燃，應(yīng)用受到一定的限制；hsr203J為來源于煙草的病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)基因煙草中由hsr203J驅(qū)動(dòng)的popA基因提供了對(duì)卵菌病原體的高度抗性，擬南芥逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)基因rd29A啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因小麥中可以調(diào)控小麥的耐旱、耐寒性等等。除了直接利用全長(zhǎng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)基因的表達(dá)外，利用已知的誘導(dǎo)順式調(diào)控元件組合進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控已成為一個(gè)重要策略，具有良好的應(yīng)用前景。

一個(gè)理想的誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子應(yīng)具有高效誘導(dǎo)性、特異性和誘導(dǎo)物的安全性，但是目前比較理想、能應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子還很少。幾丁質(zhì)作為幾丁質(zhì)誘導(dǎo)啟動(dòng)子的誘導(dǎo)物，不僅安全、經(jīng)濟(jì)，而且也是主要植物病原真菌細(xì)胞壁的重要成分，在基因表達(dá)調(diào)控和誘導(dǎo)植物抗病性方面發(fā)揮重要作用，具有重要的研究應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了啟動(dòng)子Ptchi2的全序列、核心序列、響應(yīng)幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的順式作用元件及其應(yīng)用，啟動(dòng)子Ptchi2為內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因Tachi2的啟動(dòng)子，是從棘孢木霉TD3104(保藏于：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)：CGMCC No.13161)中克隆得到的，該啟動(dòng)子為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，具有被幾丁質(zhì)特異誘導(dǎo)、不受葡萄糖抑制的獨(dú)特誘導(dǎo)啟動(dòng)特性。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子含有選自以下任一組并具有啟動(dòng)子功能的核苷酸序列；

a、SEQ ID No:1所示的核苷酸序列；

b、與SEQ ID No:1互補(bǔ)的核苷酸序列；

c、在高等嚴(yán)緊條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；

d、對(duì)上述a或b所示核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列；

e、與上述a或b所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。

典型地，“雜交條件”根據(jù)測(cè)量雜交時(shí)所用條件的“嚴(yán)緊性”程度來分類。嚴(yán)緊性程度可以以例如核酸結(jié)合復(fù)合物或探針的解鏈溫度(Tm)為依據(jù)。例如，“最大嚴(yán)緊性”典型地發(fā)生在約Tm-5℃(低于探針Tm 5℃)；“高等嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約5-10℃；“中等嚴(yán)緊性”發(fā)生在探針Tm以下約10-20℃；“低嚴(yán)緊性”發(fā)生在Tm以下約20-25℃。作為替代，或者進(jìn)一步地，雜交條件可以以雜交的鹽或離子強(qiáng)度條件和/或一或多次的嚴(yán)緊性洗滌為依據(jù)。例如，6×SSC＝極低嚴(yán)緊性；3×SSC＝低至中等嚴(yán)緊性；1×SSC＝中等嚴(yán)緊性；0.5×SSC＝高等嚴(yán)緊性。從功能上說，可以采用最大嚴(yán)緊性條件確定與雜交探針嚴(yán)緊同一或近嚴(yán)緊同一的核酸序列；而采用高等嚴(yán)緊性條件確定與該探針有約80％或更多序列同一性的核酸序列。

對(duì)于要求高選擇性的應(yīng)用，典型地期望采用相對(duì)嚴(yán)緊的條件來形成雜交體，例如，選擇相對(duì)低的鹽和/或高溫度條件。Sambrook等(Sambrook，J.等(1989)分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring HarborPress，Plainview，N.Y.)提供了包括中等嚴(yán)緊性和高等嚴(yán)緊性在內(nèi)的雜交條件。

為便于說明，用于檢測(cè)本發(fā)明的多核苷酸與其它多核苷酸雜交的合適的中度嚴(yán)緊條件包括：用5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)溶液預(yù)洗；在50-65℃下在5×SSC中雜交過夜；隨后用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC在65℃下各洗滌兩次20分鐘。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，能容易地操作雜交嚴(yán)緊性，如改變雜交溶液的含鹽量和/或雜交溫度。例如，在另一個(gè)實(shí)施方案中，合適的高度嚴(yán)緊雜交條件包括上述條件，不同之處在于雜交溫度升高到例如60-65℃或65-70℃。

在本發(fā)明中，所述在高等嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，其具有與SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動(dòng)子活性。

在本發(fā)明中，所述對(duì)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列，是指分別或同時(shí)在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和/或序列內(nèi)部進(jìn)行例如不超過2-45個(gè)，或者不超過2-30個(gè)，或者不超過3-20個(gè)，或者不超過4-15個(gè)，或者不超過5-10個(gè)，或者不超過6-8個(gè)的分別用逐個(gè)連續(xù)整數(shù)表示的堿基的取代、缺失、添加修飾。

在本發(fā)明中，所述對(duì)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列進(jìn)行如上述一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列具有與SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動(dòng)子活性。

通過一種多核苷酸進(jìn)行說明，其所具有的核苷酸序列例如與SEQ ID NO：1的參考核苷酸序列至少具95％的“同一性”是指：在SEQ IDNO：1的參考核苷酸序列之每100個(gè)核苷酸中，該多核苷酸的核苷酸序列除了含有多達(dá)5個(gè)核苷酸的不同外，該多核苷酸之核苷酸序列與參考序列相同。換句話說，為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸，參考序列中多達(dá)5％的核苷酸可被刪除或被另一核苷酸替代；或可將一些核苷酸插入?yún)⒖夹蛄兄?，其中插入的核苷酸可多達(dá)參考序列之總核苷酸的5％；或在一些核苷酸中，存在刪除、插入和替換的組合，其中所述核苷酸多達(dá)參考序列之總核苷酸的5％。參考序列的這些突變可發(fā)生在參考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在這些末端位置之間的任意地方，它們或單獨(dú)散在于參考序列的核苷酸中，或以一個(gè)或多個(gè)鄰近的組存在于參考序列中。

在本發(fā)明中，用于確定序列同一性和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法是例如BLAST和BLAST 2.0算法，它們分別描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.25：3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410。采用例如文獻(xiàn)中所述或者默認(rèn)參數(shù)，BLAST和BLAST 2.0可以用于確定本發(fā)明的核苷酸序列同一性百分?jǐn)?shù)。執(zhí)行BLAST分析的軟件可以通過國立生物技術(shù)信息中心為公眾所獲得。

在本發(fā)明中，所述與SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列包括與SEQ ID NO：1所公開序列基本同一的多核苷酸序列，例如當(dāng)采用本文所述方法(例如采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST分析)時(shí)，與本發(fā)明多核苷酸序列相比含有至少90％序列同一性、優(yōu)選至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性的那些序列。

在本發(fā)明中，所述與SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列具有與SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動(dòng)子活性。

本發(fā)明的另一方面涉及一種核酸構(gòu)建體，其包含上述的啟動(dòng)子，與啟動(dòng)子可操作連接的基因序列，其中所述啟動(dòng)子與所述基因序列來源相同或者不同。所述核酸構(gòu)建體為重組載體、重組菌或表達(dá)盒。

本發(fā)明還涉及用于擴(kuò)增本發(fā)明所述啟動(dòng)子的引物對(duì)，所述引物對(duì)的兩條引物分別為SEQ ID No:2和SEQ ID No:3所示的序列；優(yōu)選的，所述引物對(duì)的兩條引物在5’端還分別鏈接有限制性酶切位點(diǎn)和/或保護(hù)堿基；具體的，所述引物對(duì)的兩條引物分別具有SEQ ID No:4和SEQ ID No:5所示的序列。

本發(fā)明還涉及一種制備SEQ ID No:1所示的啟動(dòng)子的方法，包括以棘孢木霉TD3104基因組DNA為模板，使用一對(duì)擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，所述擴(kuò)增引物根據(jù)SEQ ID NO：1在棘孢木霉TD3104gDNA中的序列分別針對(duì)首尾進(jìn)行設(shè)計(jì)，例如為本發(fā)明上述的引物對(duì)。

本發(fā)明還涉及一種調(diào)控基因表達(dá)的方法，所述方法包括將本發(fā)明的啟動(dòng)子或者含有啟動(dòng)子序列的構(gòu)建體導(dǎo)入植物或真菌。上述方法用于調(diào)控植物或酵母中目的基因表達(dá)或植物育種或者用于植物抗病、蟲基因工程。

本發(fā)明的啟動(dòng)子Ptchi2的核心序列為SEQ ID No:1中第829-1042位所示的核苷酸序列；響應(yīng)幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的順式作用元件為SEQ ID No:1中第869-877位或第880-888位所示的核苷酸序列，具體序列是5’-ACTTGTTCA-3’。啟動(dòng)子Ptchi2為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，能被幾丁質(zhì)特異性誘導(dǎo)，而不被葡萄糖抑制。

棘孢木霉TD3104是一株優(yōu)良的植物病害生防菌，啟動(dòng)子Ptchi2是棘孢木霉TD3104內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因Tachi2的啟動(dòng)子。本發(fā)明首次從棘孢木霉TD3104中克隆得到內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因Tachi2的啟動(dòng)子Ptchi2，幾丁質(zhì)特異誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子Ptchi2為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，被幾丁質(zhì)特異性誘導(dǎo)，而不受葡萄糖抑制，并且存在目前未被發(fā)現(xiàn)的響應(yīng)幾丁質(zhì)新順式作用元件和一種幾丁質(zhì)誘導(dǎo)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的新機(jī)制。本發(fā)明提供了誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Ptchi2全序列、核心序列、響應(yīng)幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的順式作用元件及其應(yīng)用，為基因表達(dá)調(diào)控提供了一個(gè)新的選擇，對(duì)于基因表達(dá)調(diào)控研究和轉(zhuǎn)基因育種都具有重要作用，有廣闊的應(yīng)用前景。

本發(fā)明克隆獲得啟動(dòng)子Ptchi2全序列，并成功構(gòu)建了啟動(dòng)子Ptchi2的植物表達(dá)載體和酵母表達(dá)載體，以EGFP和RFP為報(bào)告基因，將上述表達(dá)載體侵染洋蔥表皮細(xì)胞或電轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，在膠體幾丁質(zhì)的誘導(dǎo)下，均能檢測(cè)到報(bào)告基因的表達(dá)，且表達(dá)不受葡萄糖的抑制，因此，啟動(dòng)子Ptchi2在植物和酵母中均具有啟動(dòng)子活性，可調(diào)控基因的表達(dá)；利用缺失突變研究了啟動(dòng)子Ptchi2的核心序列為SEQ ID No:1中第829-1042位所示的核酸序列、響應(yīng)幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的順式作用元件為SEQ ID No:1中第869-877位或第880-888位所示的核酸序列，具體序列是5’-ACTTGTTCA-3’，即命名為CSICAE；構(gòu)建CSICAE與花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動(dòng)子核心序列融合的雜合啟動(dòng)子，驗(yàn)證了CSICAE為響應(yīng)幾丁質(zhì)誘導(dǎo)所必需的順式作用元件，因此，啟動(dòng)子Ptchi2可應(yīng)用于真菌和植物基因的表達(dá)調(diào)控、植物抗病、蟲基因工程中。

附圖說明

圖1是啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，其中M為DL5000DNA Marker；1、2為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

圖2是Pcb302-Ptchi2-EGFP-Tnos表達(dá)載體酶切產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果，其中1是Sac Ⅰ和Xba Ⅰ雙酶切產(chǎn)物；2是用Sac Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切產(chǎn)物；M1是DL5000DNA Marker；M2是DL15000 DNA Marker；

圖3是含有啟動(dòng)子Ptchi2重組載體的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)結(jié)果，其中A是在MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的EHA105-E介導(dǎo)的洋蔥表皮細(xì)胞；B是在含1mg/mL膠體幾丁質(zhì)的MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的EHA105-E介導(dǎo)的洋蔥表皮細(xì)胞；C是在MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的EHA105-R介導(dǎo)的洋蔥表皮細(xì)胞；D是在含1mg/mL膠體幾丁質(zhì)的MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的EHA105-R介導(dǎo)的洋蔥表皮細(xì)胞；

圖4是pPIC9K-Ptchi2-EGFP-Tnos表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115誘導(dǎo)表達(dá)檢測(cè)結(jié)果，其中A，GS115-Ptchi2-EGFP在添加葡萄糖的SM培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d；B，GS115-Ptchi2-EGFP 在添加膠體幾丁質(zhì)的SM培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d；C，GS115-Ptchi2-EGFP在同時(shí)添加膠體幾丁質(zhì)和葡萄糖的SM培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d；

圖5是pPIC9K-Ptchi2-RFP-Tnos表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115誘導(dǎo)表達(dá)檢測(cè)結(jié)果，其中A，GS115-Ptchi2-RFP在添加葡萄糖的SM培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d；B，GS115-Ptchi2-RFP在添加膠體幾丁質(zhì)的SM培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d；C，GS115-Ptchi2-RFP在同時(shí)添加膠體幾丁質(zhì)和葡萄糖的SM培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d；

圖6是含Ptchi2啟動(dòng)子829bp-1042bp區(qū)域重組載體的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)結(jié)果，其中A，在MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細(xì)胞EGFP瞬時(shí)表達(dá)；B，在含1mg/mL膠體幾丁質(zhì)的MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細(xì)胞EGFP瞬時(shí)表達(dá)；C，在MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細(xì)胞RFP瞬時(shí)表達(dá)；D，在含1mg/mL膠體幾丁質(zhì)的MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細(xì)胞RFP瞬時(shí)表達(dá)；

圖7是Ptchi2核心區(qū)(829bp-1042bp)驅(qū)動(dòng)熒光蛋白在酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)檢測(cè)結(jié)果，其中A，添加葡萄糖的SM培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d的酵母EGFP表達(dá)檢測(cè)；B，添加膠體幾丁質(zhì)的SM培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d的酵母EGFP表達(dá)檢測(cè)；C，同時(shí)添加膠體幾丁質(zhì)和葡萄糖的SM培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d的酵母EGFP表達(dá)檢測(cè)；D，添加葡萄糖的SM培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d的酵母RFP表達(dá)檢測(cè)；E，添加膠體幾丁質(zhì)的SM培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d的酵母RFP表達(dá)檢測(cè)；F，同時(shí)添加膠體幾丁質(zhì)和葡萄糖的SM培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d酵母RFP表達(dá)檢測(cè)；

圖8是含CSICAE雜合啟動(dòng)子重組載體的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)結(jié)果，其中A，在含膠體幾丁質(zhì)MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的、不含CSICAE的CaMV35S啟動(dòng)子的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細(xì)胞EGFP瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)；B，在含葡萄糖MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的含1個(gè)CSICAE的CaMV35S雜合啟動(dòng)子的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細(xì)胞EGFP瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)；C，在含膠體幾丁質(zhì)MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的含1個(gè)CSICAE的CaMV35S雜合啟動(dòng)子的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細(xì)胞EGFP瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)；D，在同時(shí)含膠體幾丁質(zhì)和葡萄糖MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的含1個(gè)CSICAE的CaMV35S雜合啟動(dòng)子的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細(xì)胞EGFP瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)；

圖9是含CSICAE雜合啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)綠色熒光蛋白基因在酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)檢測(cè)結(jié)果，其中A，添加膠體幾丁質(zhì)SM培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d的不含CSICAE、僅含CaMV35S啟動(dòng)子核心序列的酵母轉(zhuǎn)化子EGFP表達(dá)檢測(cè)；B，添加葡萄糖的SM培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d的含CSICAE和CaMV35S啟動(dòng)子核心序列的雜合啟動(dòng)子的酵母轉(zhuǎn)化子EGFP表達(dá)檢測(cè)；C，同時(shí)添加膠體幾丁質(zhì)和葡萄糖的SM培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d的含CSICAE和CaMV35S啟動(dòng)子核心序列的雜合啟動(dòng)子的酵母轉(zhuǎn)化子EGFP表達(dá)檢測(cè)；D，添加膠體幾丁質(zhì)的SM培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d的含CSICAE和CaMV35S啟動(dòng)子核心序列的雜合啟動(dòng)子的酵母轉(zhuǎn)化子EGFP表達(dá)檢測(cè)。。

具體實(shí)施方式

下述具體實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，但不限定本發(fā)明的范圍，不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法或條件，如分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Molecular cloning：A laboratory manual，3rd ed.，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory，2001)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

“CSICAE”是Chitin specific induction cis-acting element的縮寫。

本發(fā)明涉及Ptchi2啟動(dòng)子及其具有相同功能特征的多核苷酸突變體。這些核苷酸突變體包括取代突變體、缺失突變體和插入突變體。如本領(lǐng)域所知的，突變體可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變?cè)搯?dòng)子的功能。

本發(fā)明的Ptchi2啟動(dòng)子的核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列來設(shè)計(jì)引物，并用木霉基因組DNA作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。

本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明啟動(dòng)子元件的構(gòu)建物或載體，以及用所述構(gòu)建物或載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(尤其是酵母和植物細(xì)胞)，以及由此再生的植株。

適用于本發(fā)明的外源基因沒有特別限制，幾乎所有的外源基因都可用于本發(fā)明，尤其是與代表性的外源基因的例子包括但并不限于RFP基因、GFP基因等。將這些基因與本發(fā)明的Ptchi2啟動(dòng)子相連，形成含外源基因的構(gòu)建物。

在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于：表達(dá)載體、克隆載體，例如適用于原核(如大腸桿菌等細(xì)菌)、真核(如酵母)、植物細(xì)胞中的載體。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含Ptchi2啟動(dòng)子和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。

宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如植物細(xì)胞。

實(shí)施例1、啟動(dòng)子的制備及幾丁質(zhì)特異誘導(dǎo)表達(dá)驗(yàn)證

一、啟動(dòng)子的制備

1、PCR擴(kuò)增

以棘孢木霉Trichoderma asperellum TD3104基因組DNA為模板，用4POS和4POA引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

引物序列如下：

4POS：5’-AACTCGTTGATTGGGGAGGATAATAGCAG-3’ SEQ ID No:2

4POA：5’-GGTTATTGGTGATGAAAAGTAATTGGAGAT-3’ SEQ ID No:3

反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；94℃變性45s；54℃退火45s；72℃延伸60s，共進(jìn)行36個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。結(jié)束后進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖1)，膠回收目的產(chǎn)物。

將目的產(chǎn)物與載體pMD18-T連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，抗性篩選培養(yǎng)，挑取陽性單克隆測(cè)序，獲得1128bp啟動(dòng)子序列。序列如SEQ ID No:1所示。

SEQ ID No:1

二、幾丁質(zhì)特異誘導(dǎo)啟動(dòng)子Ptchi2洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證

1啟動(dòng)子Ptchi2全長(zhǎng)克隆載體的構(gòu)建

為了方便后續(xù)的構(gòu)建載體操作，根據(jù)啟動(dòng)子Ptchi2全長(zhǎng)序列，在引物的5′端設(shè)計(jì)相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)如下引物：

PS0：CGAGCTCACTAGTAACTCGTTGATTGGGGAGGATAATAGCAG SEQ ID No:4

PA0：GCTCTAGAGGTTATTGGTGATGAAAAGTTAATTGGAGAT SEQ ID No:5

以棘孢木霉Trichoderma asperellum TD3104(CGMCC No.13161)基因組DNA為模板，用引物對(duì)PS0和PA0進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將目的產(chǎn)物與載體pMD18-T連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，抗性篩選培養(yǎng)，挑取陽性單克隆測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒記作pMD18-T-Ptchi2Vector。

2Pcb302-Ptchi2-EGFP-Tnos植物表達(dá)載體構(gòu)建

利用OMEGA質(zhì)粒提取試劑盒，分別提取pMD18-T-Ptchi2Vector和Pcb302質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Sac Ⅰ和Xba Ⅰ雙酶切后回收目的條帶(Ptchi2和Pcb302載體骨架)，用T4DNALigase，16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，挑取陽性克隆測(cè)序，提取質(zhì)粒命名為Pcb302-Ptchi2。

將質(zhì)粒pMD18-T–EGFP-Z Vector(綠色熒光蛋白EGFP基因兩側(cè)分別設(shè)計(jì)有Xba Ⅰ和Xma Ⅰ酶切位點(diǎn))和Pcb302-Ptchi2用Xba Ⅰ和Xma Ⅰ進(jìn)行雙酶切，膠回收約750bp的EGFP和Pcb302-Ptchi2載體片段，連接后獲得質(zhì)粒命名為Pcb302-Ptchi2-EGFP。

質(zhì)粒Pcb302-Ptchi2-EGFP和pMD18-T-Tnos Vector(胭脂堿合成酶基因終止子Tnos序列兩側(cè)分別設(shè)計(jì)有Xma Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn))用Xma Ⅰ和EcoR Ⅰ進(jìn)行雙酶切，膠回收約300bp的Tnos和Pcb302-Ptchi2-EGFP載體片段，連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選陽性克隆以獲得植物表達(dá)載體，經(jīng)PCR驗(yàn)證、酶切驗(yàn)證(圖2)并測(cè)序，正確質(zhì)粒命名為Pcb302-Ptchi2-EGFP-Tnos。

3Pcb302-Ptchi2-RFP-Tnos植物表達(dá)載體構(gòu)建

提取pMD18-T-RFP-Z Vector(RFP基因兩側(cè)分別設(shè)計(jì)有Xba Ⅰ和Xma Ⅰ酶切位點(diǎn))和Pcb302-Ptchi2-EGFP-Tnos質(zhì)粒，用Xba Ⅰ和Xma Ⅰ進(jìn)行雙酶切，膠回收RFP目的基因和載體，用T4DNA Ligase，16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證和酶切驗(yàn)證。連接后獲得植物表達(dá)載體，質(zhì)粒命名為Pcb302-Ptchi2-RFP-Tnos。

4表達(dá)載體Pcb302-Ptchi2-EGFP-Tnos和Pcb302-Ptchi2-RFP-Tnos轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

將Pcb302-Ptchi2-EGFP-Tnos和Pcb302-Ptchi2-RFP-Tnos分別轉(zhuǎn)化凍融法制備的農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞。獲得Pcb302-Ptchi2-EGFP-Tnos的農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化子EHA105-E，Pcb302-Ptchi2-RFP-Tnos的農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化子EHA105-R。

5洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)體系檢測(cè)Ptchi2啟動(dòng)活性

膠體幾丁質(zhì)的制備：稱取10g幾丁質(zhì)粉緩慢加入100mL濃鹽酸中，攪拌至幾丁質(zhì)完全溶解，加入5倍體積預(yù)冷的50％乙醇，4000rpm離心20min，沉淀用蒸餾水沖洗至中性，調(diào)節(jié)濃度至25mg/mL，備用。

去掉新鮮的洋蔥外層2-3層鱗片，取內(nèi)表面的表皮貼于MS培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)過夜。

分別將農(nóng)桿菌EHA105-R、EHA105-E 10μL菌液接種于10mL含有Kan 50mg/L和Rif 50mg/L的YEB液體培養(yǎng)基中，200r/min、28℃培養(yǎng)至OD₆₀₀值為0.6左右。4℃、2800g、10min離心；菌體用約25mL MS液體培養(yǎng)基重懸菌體(MS液體培養(yǎng)基中乙酰丁香酮終濃度為20μmol/L、氯化鎂終濃度為10mmol/L)。

將黑暗培養(yǎng)的洋蔥表皮放于MS重懸的菌液中，用鑷子將洋蔥表皮浸在菌液中與菌液充分接觸。侵染20min后洋蔥表皮用滅菌濾紙將菌液吸干，分別鋪于新的含1mg/mL膠體幾丁質(zhì)的MS固體培養(yǎng)基及同時(shí)含有1mg/mL膠體幾丁質(zhì)和葡萄糖的MS固體培養(yǎng)基中繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，對(duì)照組用不含有膠體幾丁質(zhì)的MS固體培養(yǎng)基、含有1mg/mL葡萄糖的MS固體培養(yǎng)基，3次重復(fù)。25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h后，利用Nikon eclipse Ti熒光倒置顯微鏡進(jìn)行熒光顯微鏡觀察。

結(jié)果如圖3所示，含有啟動(dòng)子Ptchi2重組載體的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)時(shí)，在幾丁質(zhì)誘導(dǎo)后呈現(xiàn)相應(yīng)的綠色或紅色熒光(圖3中的B中白色處為綠色熒光，D中白色處為紅色熒光)，不經(jīng)幾丁質(zhì)誘導(dǎo)則未觀察到相應(yīng)的熒光(圖3中的A和C)。結(jié)果顯示，膠體幾丁質(zhì)誘導(dǎo)可啟動(dòng)報(bào)告基因EGFP和RFP在洋蔥表皮細(xì)胞中特異表達(dá)，本發(fā)明的Ptchi2啟動(dòng)子在植物中對(duì)基因表達(dá)具有誘導(dǎo)調(diào)控作用。

三Ptchi2酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及啟動(dòng)活性鑒定

提取Pcb302-Ptchi2-EGFP-Tnos、Pcb302-Ptchi2-RFP-Tnos和pPIC9K質(zhì)粒，分別用限制性內(nèi)切酶Sac Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切后回收Ptchi2-EGFP-Tnos表達(dá)盒、Ptchi2-RFP-Tnos表達(dá)盒和9.3kb的pIC9K目的條帶。分別將回收的Ptchi2-EGFP-Tnos表達(dá)盒、Ptchi2-RFP-Tnos表達(dá)盒與9.3kb的pPIC9K用T4DNA Ligase連接(分別用Ptchi2-EGFP-Tnos表達(dá)盒、Ptchi2-RFP-Tnos表達(dá)盒替換掉pPIC9K載體中的的Sac Ⅰ酶切位點(diǎn)至EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)區(qū)域)，獲得酵母表達(dá)載體pPIC9K-Ptchi2-EGFP-Tnos、pPIC9K-Ptchi2-RFP-Tnos。

酵母表達(dá)載體用SalⅠ線性化，純化試劑盒純化。電壓1500V、電擊時(shí)間0.5ms電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115。分別獲得酵母工程菌GS115-Ptchi2-EGFP、GS115-Ptchi2-RFP。

將轉(zhuǎn)化子分別接種到含有800μL YPD的1.5mL離心管中，28℃，180r/min搖培24h。10000r/min離心1min，用ddH₂O清洗10遍左右，最后用100μL ddH₂O重懸菌體，備用。

(1)取10μL以上菌液，50μL 50×SM培養(yǎng)基，450μL濃度為20mg/mL的葡萄糖，加入到1.5mL離心管中，28℃，180r/min搖培。

(2)取10μL以上菌液，50μL 50×SM培養(yǎng)基，20μL濃度為25mg/mL的膠體幾丁質(zhì)，430μL蒸餾水，加入到1.5mL離心管中，28℃，180r/min搖培。

(3)取10μL以上菌液，50μL 50×SM培養(yǎng)基，20μL濃度為25mg/mL的膠體幾丁質(zhì)，50μL濃度為200mg/mL的葡萄糖，380μL蒸餾水，加入到1.5mL離心管中，28℃，180r/min搖培。

每組試驗(yàn)3個(gè)重復(fù)。每隔12h取樣10μL，直到216h，制片，用熒光顯微鏡進(jìn)行熒光檢測(cè)(圖4，圖5)。結(jié)果如下：

(1)用添加葡萄糖的SM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，酵母未觀察到熒光。說明僅有葡萄糖的SM 培養(yǎng)基不能使Ptchi2啟動(dòng)EGFP和RFP的表達(dá)。

(2)添加膠體幾丁質(zhì)的SM培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)第4d-9d酵母能夠觀察到綠色或紅色熒光。說明：在畢赤酵母GS115中，從誘導(dǎo)開始第4d-9d，膠體幾丁質(zhì)也可以誘導(dǎo)Ptchi2啟動(dòng)EGFP和RFP的的高效表達(dá)。

(3)膠體幾丁質(zhì)和葡萄糖都添加的SM培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)第4d-9d酵母能夠觀察到綠色或紅色熒光。說明：在畢赤酵母GS115中，同時(shí)添加膠體幾丁質(zhì)和葡萄糖，膠體幾丁質(zhì)仍然可以誘導(dǎo)Ptchi2啟動(dòng)EGFP和RFP的的高效表達(dá)，對(duì)于表達(dá)時(shí)間無影響，表達(dá)效率無影響。

綜上所述，Ptchi2啟動(dòng)子在酵母中不受葡萄糖抑制，可以被較低濃度的膠體幾丁質(zhì)誘導(dǎo)，啟動(dòng)EGFP和RFP的高效表達(dá)。

實(shí)施例2棘孢木霉幾丁質(zhì)酶基因啟動(dòng)子Ptchi2核心區(qū)域鑒定

一、啟動(dòng)子Ptchi2缺失載體的構(gòu)建和洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證

根據(jù)已知的啟動(dòng)子全序列和生物信息學(xué)分析，設(shè)計(jì)序列缺失引物，見表1。

表1.缺失突變引物的設(shè)計(jì)

以pMD18-T-Ptchi2Vector質(zhì)粒為模板，分別以p1s206、p1s401、p1s604、p1s780、p1s829、p1s901為系列缺失上游引物，4POA或p1a1042為下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、膠回收，并且與克隆載體pMD18-T Vector進(jìn)行連接，獲得啟動(dòng)子Ptchi2系列缺失突變體克隆載體。分別將Ptchi2系列缺失突變體克隆載體和Pcb302-Ptchi2-EGFP-Tnos質(zhì)粒、Pcb302-Ptchi2-RFP-Tnos質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Sac Ⅰ和Xba Ⅰ進(jìn)行雙酶切，回收目的條帶，用T4DNA Ligase將Ptchi2系列缺失突變體分別與切除Ptchi2的Pcb302-Ptchi2-EGFP-Tnos載體、Pcb302-Ptchi2-RFP-Tnos載體連接，獲得Ptchi2系列缺失突變體表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，獲得系列含有不同Ptchi2缺失突變體表達(dá)載體的農(nóng)桿菌EHA105。利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)體系，檢測(cè)不同啟動(dòng)子Ptchi2缺失突變體幾丁質(zhì)誘導(dǎo)啟動(dòng)活性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖6)顯示(圖6中的B中白色處為綠色熒光，D中白色處為紅色熒光，A和C無熒光)：?jiǎn)?dòng)子5’端0-829bp個(gè)堿基缺失時(shí)，膠體幾丁質(zhì)均可以正常誘導(dǎo)啟動(dòng)EGFP 和RFP的高效表達(dá)；而5’端缺失901bp時(shí)，膠體幾丁質(zhì)不能誘導(dǎo)啟動(dòng)EGFP和RFP表達(dá)。Ptchi2啟動(dòng)子829bp-1042bp區(qū)域，具有與全長(zhǎng)Ptchi2相同的幾丁質(zhì)誘導(dǎo)啟動(dòng)活性，說明829bp-1042bp區(qū)域是Ptchi2啟動(dòng)子的核心區(qū)域，響應(yīng)幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的順式作用元件在829bp-901bp之間。

二、啟動(dòng)子Ptchi2核心區(qū)酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及啟動(dòng)活性鑒定

克隆啟動(dòng)子Ptchi2核心區(qū)(829bp-1042bp)，替換載體pPIC9K-Ptchi2-EGFP-Tnos、pPIC9K-Ptchi2-RFP-Tnos中的全長(zhǎng)Ptchi2區(qū)域，構(gòu)建含啟動(dòng)子Ptchi2核心區(qū)酵母表達(dá)載體，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115選取陽性克隆，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

(1)只添加葡萄糖的SM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，觀察不到熒光。

(2)添加膠體幾丁質(zhì)的SM培養(yǎng)基或同時(shí)添加膠體幾丁質(zhì)和葡萄糖的SM培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)4-9d，酵母細(xì)胞都可以觀察到相應(yīng)的熒光(如圖7，其中的B、C中白色處為綠色熒光，E、F中白色處為紅色熒光，A和D無熒光)。試驗(yàn)結(jié)果與洋蔥瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果一致。

實(shí)施例3順式作用元件鑒定與分析

根據(jù)啟動(dòng)子Ptchi2的核心區(qū)分析，設(shè)計(jì)定點(diǎn)堿基置換突變引物對(duì)和定點(diǎn)堿基缺失引物對(duì)，如表2。

表2.定點(diǎn)突變分析所需引物表

按照OneTube Mutagenesis Kit(北京艾德萊生物科技有限公司)說明書，分別以Pcb302-p1s829-EGFP-Tnos(p1s829代表Ptchi2啟動(dòng)子的829bp-1042bp區(qū)域的序列)、Pcb302-p1s829-RFP-Tnos(p1s829代表Ptchi2啟動(dòng)子的829bp-1042bp區(qū)域的序列)質(zhì)粒為模板，采用表2中的序列引物對(duì)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下：

PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s；55℃退火30s；72℃延伸12min，共進(jìn)行24個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

于20μL PCR產(chǎn)物中加0.5μL Dpn Ⅰ酶，充分混勻，繼續(xù)PCR儀器上37℃孵育3小時(shí)，消化PCR產(chǎn)物，取10μL消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。

挑取陽性克隆，測(cè)序鑒定，提取測(cè)序正確的突變轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，采用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。采用洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)體系檢測(cè)誘導(dǎo)啟動(dòng)活性。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在829bp-1042bp區(qū)域，缺失869bp-896bp 28個(gè)堿基、或缺失869bp-888bp 20個(gè)堿基，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)檢測(cè)不到熒光，說明869bp-888bp區(qū)域20個(gè)堿基含有誘導(dǎo)所必須的順式作用元件，該區(qū)域含有2個(gè)“ACTTGTTCA”。單獨(dú)將869bp-877bp 9個(gè)堿基突變?yōu)椤癎ACGTCGTC”或886bp-890bp 5個(gè)堿基突變?yōu)椤癎TCGA”，保持幾丁質(zhì)誘導(dǎo)啟動(dòng)活性。單獨(dú)缺失869bp-877bp 9個(gè)堿基或單獨(dú)缺失880bp-890bp 11個(gè)堿基，保持幾丁質(zhì)誘導(dǎo)啟動(dòng)活性；在缺失880bp-890bp 11個(gè)堿基的基礎(chǔ)上，將869bp-877bp區(qū)域由9個(gè)堿基組成的“ACTTGTTCA”突變?yōu)椤癎ACGTCGTC”，則失去幾丁質(zhì)誘導(dǎo)啟動(dòng)活性。說明啟動(dòng)子核心區(qū)“ACTTGTTCA”序列(命名為CSICAE)為響應(yīng)幾丁質(zhì)誘導(dǎo)所必須，是Ptchi2啟動(dòng)子響應(yīng)幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的順式作用元件。

實(shí)施例4含CSICAE雜合啟動(dòng)子構(gòu)建及誘導(dǎo)活性鑒定

一、含CSICAE雜合啟動(dòng)子植物表達(dá)載體的構(gòu)建及誘導(dǎo)活性鑒定

pROKⅡ質(zhì)粒為模板，以RH35SS：CGAGCTCACTTGTTCATTACTTGTTCATCGCAAGACCCTTCCTCT SEQ ID No:28和RH35SA：GCTCTAGACCCGTGTTCTCTCCAAATGAAATGAACT SEQ ID No:29為引物，進(jìn)行融合PCR擴(kuò)增，將CSICAE與花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動(dòng)子核心序列融合，擴(kuò)增體系如下：

PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，46℃退火45s，72℃延伸20s，5個(gè)循環(huán)；94℃變性45s，53℃退火45s；72℃延伸20s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

pROKⅡ質(zhì)粒為模板，以35SS：CgagctcCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGT SEQ ID No:30和35SA：GctctagaCCCGTGTTCTCTCCAAATGAAATGAACT SEQ ID No:31為引物，擴(kuò)增CaMV35S序列。

PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，膠回收產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。挑取單菌落，用特異性引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，陽性克隆測(cè)序驗(yàn)證，提取質(zhì)粒分別用Sac Ⅰ和Xba Ⅰ進(jìn)行雙酶切，回收目的片段；Pcb302-p1s829-EGFP-Tnos質(zhì)粒用Sac Ⅰ和Xba Ⅰ進(jìn)行雙酶切，回收載體片段。連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，獲得含CSICAE雜合啟動(dòng)子植物表達(dá)載體和含CaMV35S啟動(dòng)子核心序列的植物表達(dá)載體，采用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。采用洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)體系檢測(cè)誘導(dǎo)啟動(dòng)活性。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含CSICAE和CaMV35S啟動(dòng)子核心序列的雜合啟動(dòng)子可以被膠體幾丁質(zhì)誘導(dǎo)啟動(dòng)EGFP報(bào)告基因表達(dá)，檢測(cè)到綠色熒光；不含CSICAE的CaMV35S啟動(dòng)子不能被膠體幾丁質(zhì)，檢測(cè)不到綠色熒光。采用同樣的方法，構(gòu)建只含有1個(gè)CSICAE和CaMV35S啟動(dòng)子核心序列的雜合啟動(dòng)子，仍然可以被膠體幾丁質(zhì)誘導(dǎo)啟動(dòng)EGFP報(bào)告基因表達(dá)，檢測(cè)到綠色熒光；不含CSICAE的CaMV35S啟動(dòng)子不能被膠體幾丁質(zhì)誘導(dǎo)啟動(dòng)EGFP報(bào)告基因表達(dá)，檢測(cè)不到綠色熒光(圖8)。證明CSICAE是響應(yīng)幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的順式作用元件。

二、含CSICAE雜合啟動(dòng)子酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及誘導(dǎo)活性鑒定

進(jìn)一步以JRH35SS：CGAGCTCACTTGTTCATTACTTGTTCATCGCAAGACCCTTCCTCT SEQ ID No:32和JRH35SA：CGGAATTCCCCGTGTTCTCTCCAAATGAAATGAACT SEQ ID No:33為引物，以“實(shí)施例4、一”構(gòu)建的含CSICAE和CaMV35S啟動(dòng)子核心序列的雜合啟動(dòng)子為模板，PCR擴(kuò)增含CSICAE和CaMV35S啟動(dòng)子核心序列的雜合啟動(dòng)子。采用“實(shí)施例1、三”中的方法，用含有CSICAE和CaMV35S啟動(dòng)子核心序列的雜合啟動(dòng)子替換載體pPIC9K-Ptchi2-EGFP-Tnos中的全長(zhǎng)Ptchi2區(qū)域，構(gòu)建含CSICAE和CaMV35S啟動(dòng)子核心序列的雜合啟動(dòng)子的酵母表達(dá)載體，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115選取陽性克隆，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。熒光顯微觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)：酵母在添加葡萄糖的SM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，觀察不到熒光；在添加膠體幾丁質(zhì)的SM培養(yǎng)基上培養(yǎng)，或同時(shí)添加膠體幾丁質(zhì)和葡萄糖的SM培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)4-9d，可以觀察到綠色熒光(圖9)。

該結(jié)果進(jìn)一步證明CSICAE是響應(yīng)幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的順式作用元件；同時(shí)也證明CSICAE不僅在植物中可誘導(dǎo)調(diào)控基因表達(dá)，并且在真菌酵母中也可誘導(dǎo)調(diào)控基因表達(dá)。

序列表

<110> 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 特異性順式作用元件及含該順式作用元件的啟動(dòng)子和核酸構(gòu)建體及其應(yīng)用

<130>

<160> 33

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1128

<212> DNA

<213> 幾丁質(zhì)特異誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子Ptchi2

<400> 1

aactcgttga ttggggagga taatagcagt ttcgtcaagc tcctgctaga atacggtgct 60

gaaattgatg cagcagatat caacggcaaa actccgctta tccacgcttc cagtgtcggg 120

catgagaata cagttaaagt gctgctagag tatggcgccc aagtcaatgc agcagataac 180

gacggccaga cagcactaat gaaggctgca tgttccgaag acttgtttgg gaaggctaat 240

atcaacaccg tcaagttgct gctagaatat ggagccgaaa ttgatgcggc agattgtggc 300

ggccagacag cacttatttg tactgcatat gctgggaacg aggatagcgt caggctactg 360

ctgcaaaatg gcgctcaagt taatgcagca gatacaagtg gtttcacagc gttattctgg 420

gcaaattcaa gggggaagag agaacttatc aagctgctgc tggagcacgg cgctgctgat 480

ccaggcactt acatgatgca tataacataa tgtgggctat aagatagaaa tcaggcacta 540

cctacctagc catcaagcac agctgaggcg acaagcagac aaaacatatc agcagattgc 600

attttgtact ctataaaaga gccaattggc caacatgaat ttggtcaact agcttgctcc 660

atatcttcct gctaaatagg aaaagcaagt ctacacatgg gtattggctc gtttgtgggc 720

atggacaagc aaaagatgag ctgtcgatga ggcggtgctg gccagtcagc agcatcgaca 780

gcgcatacaa agtggaggct ggggcgaaag ccgcgacagc atctgaggcc gccattaagc 840

tgttccacca tgactgggtc gccaagcaac ttgttcatta cttgttcatg ttattccaaa 900

gaggacatag agcaagggtt catatttatg tttgccatat aagtatataa agggcagcca 960

tttgttcaaa gccacttgct tcccaacaaa gctcctgttg gataagtacc agcaaacata 1020

tttcgtcata gggatctagc tgtccccaaa tacctcattc tccttgcggg cctcatttta 1080

gcattgtctt tcataccaat ctccaattac ttttcatcac caataacc 1128

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aactcgttga ttggggagga taatagcag 29

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggttattggt gatgaaaagt aattggagat 30

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgagctcact agtaactcgt tgattgggga ggataatagc ag 42

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gctctagagg ttattggtga tgaaaagtta attggagat 39

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgagctcctg catgttccga agac 24

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgagctcgtt tcacagcgtt attctg 26

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgagctcatg tactctataa aagagccaat 30

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgagctcagc gcatacaaag tgga 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgagctcccg ccattaagct gttc 24

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cgagctcgag gacatagagc aagggtt 27

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gctctagaca gctagatccc tatgacg 27

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gctctagagg ttattggtga tgaaaagt 28

<210> 14

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tcgccaagca gacgtcgtct tacttgttca tgttattc 38

<210> 15

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gaacaagtaa gacgacgtct gcttggcgac ccagtcatg 39

<210> 16

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tcgccaagca gacgtcgtct tttattccaa agaggac 37

<210> 17

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ctctttggaa taaaagacga cgtctgcttg gcgacccagt catggt 46

<210> 18

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gttcattact tgtgtcgatt attccaaaga ggacatagag caagg 45

<210> 19

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ctctttggaa taatcgacac aagtaatgaa caagttgctt ggc 43

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gggtcgccaa gcattacttg ttcatgttat tccaaagagg 40

<210> 21

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

catgaacaag taatgcttgg cgacccagtc atggtgg 37

<210> 22

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gcaacttgtt cattttattc caaagaggac atagagcaag gg 42

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

cctctttgga ataaaatgaa caagttgctt ggcgacccag 40

<210> 24

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gggtcgccaa gcacaaagag gacatagagc aagggttc 38

<210> 25

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ctatgtcctc tttgtgcttg gcgacccagt catggtgg 38

<210> 26

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gggtcgccaa gcagttattc caaagaggac atagagc 37

<210> 27

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

cctctttgga ataactgctt ggcgacccag tcatggtgg 39

<210> 28

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

cgagctcact tgttcattac ttgttcatcg caagaccctt cctct 45

<210> 29

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

gctctagacc cgtgttctct ccaaatgaaa tgaact 36

<210> 30

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

cgagctccgc aagacccttc ctctatataa ggaagt 36

<210> 31

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

gctctagacc cgtgttctct ccaaatgaaa tgaact 36

<210> 32

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

cgagctcact tgttcattac ttgttcatcg caagaccctt cctct 45

<210> 33

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

cggaattccc cgtgttctct ccaaatgaaa tgaact 36