本發(fā)明涉及一種牛支原體培養(yǎng)基及其制備方法，確切講是一種其組分中包括有：PPLO肉湯、丙酮酸鈉、葡萄糖、新鮮酵母浸出液、馬血清、青霉素、酚紅、去離子水的牛支原體培養(yǎng)基及其制備方法。

背景技術(shù)：

牛支原體（Mycoplasma bovis,M.bovis）能夠引起牛肺炎、關(guān)節(jié)炎、乳房炎、角膜結(jié)膜炎、耳炎、生殖道炎癥、流產(chǎn)與不孕等多種疾病。該病原引起的疾病在全世界范圍流行并造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。牛支原體是牛呼吸疾病綜合征的主要病因。我國自2008年首次從湖北省爆發(fā)壞死性肺炎肉牛身上分離到牛支原體以來，隨后在全國多個(gè)省市地區(qū)不斷有牛支原體病例的報(bào)道，現(xiàn)今牛支原體在我國已成普遍感染狀態(tài)，牛支原體也已經(jīng)成為威脅我國養(yǎng)牛業(yè)的重要病原之一。

牛支原體病的防控需要綜合防控措施，疫苗免疫是預(yù)防控制牛支原體病發(fā)生的一個(gè)重要手段，而優(yōu)質(zhì)高效疫苗需要優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)基作為支撐。目前牛支原體的培養(yǎng)基主要有牛心湯培養(yǎng)基、改良KM2培養(yǎng)基、改良Thiaucourt’s培養(yǎng)基等?，F(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)基培養(yǎng)牛支原體存在培養(yǎng)時(shí)間較長、活菌滴度較低、繁殖能力較差等問題。此外，現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)基中血清含量普遍在10%～20%之間，不僅增加了制苗成本，過量的血清制備的疫苗無疑增加了異源體對(duì)牛體的過敏應(yīng)激反應(yīng)，最終影響疫苗的免疫效果。單純降低現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)基中血清含量會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)牛支原體抗原滴度低10～100倍左右，既達(dá)不到免疫所需抗原劑量，又需提高濃縮倍數(shù)，實(shí)際上增加了生產(chǎn)成本。

中國發(fā)明專利2011100012310公開一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基及其制備方法，該專利的基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成成分為：腦心浸液、乳清蛋白水解物、PPLO肉湯、酵母浸粉、示蛋白胨、硫代硫酸鈉、Hank’s液、丙酮酸鈉、0.1％酚紅溶液、青霉素和去離子水，以使用前加入140～200ml的健康馬血清，并需要再加入瓊脂。根據(jù)其公開的內(nèi)容，用該專利的培養(yǎng)基培養(yǎng)的豬肺炎支原體培養(yǎng)基活菌滴度可達(dá)1×10⁹CCU/ml～1×10¹⁰CCU/ml,并且具有支原體生長速度快、分離的敏感性強(qiáng),制備方法工藝簡單，可操作性強(qiáng)，適合工業(yè)化大生產(chǎn)的特點(diǎn)。

中國發(fā)明專利申請(qǐng)2015100244778公開的一種山羊支原體山羊肺炎亞種體外培養(yǎng)基由：PPLO肉湯21g/L，葡萄糖2g/L，丙酮酸鈉2g/L，質(zhì)量體積比25%的酵母浸液100ml/L，0.4%的酚紅0.18ml/L，滅活馬血清100mL/L，及水溶解的青霉素200IU/ml構(gòu)成，其pH值為7.4～7.6。采用該培養(yǎng)基培養(yǎng)山羊支原體山羊肺炎亞種，56小時(shí)生長滴度可達(dá)到4×10⁹ccu，在達(dá)到原有培養(yǎng)基生長滴度的同時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間縮短10小時(shí)，同時(shí)可以降低培養(yǎng)基的成本。

但由于上述專利用于培養(yǎng)豬肺炎支原體和山羊支原體山羊肺炎亞種，培養(yǎng)牛支原體滴度均不高于10⁹ CCU/ml；此外，上述專利所需用的馬血清量較大，馬血清含量均在10%及以上；因此，開發(fā)高效的牛支原體低血清培養(yǎng)基已成為牛支原體疫苗研究和生產(chǎn)中急需解決的重要問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種可克服現(xiàn)有技術(shù)不足的牛支原體低血清高效培養(yǎng)基，本發(fā)明另一目的是提供該培養(yǎng)基的制備方法。

本發(fā)明的這種牛支原體培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和輔助培養(yǎng)基混合構(gòu)成，其中每升的培養(yǎng)基內(nèi)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成為：

（1）PPLO肉湯 22.0～24.0g

（2）丙酮酸鈉 5.0～6.0g

（3）葡萄糖 6.0～8.0g

（4）質(zhì)量濃度為1%的酚紅 2.0～2.5ml

（5）去離子水750 ml；

輔助培養(yǎng)基的組成為：

（6）質(zhì)量濃度為25%的新鮮酵母浸出液 110～120ml

（7）質(zhì)量濃度為3%的L-谷氨酰胺16～17 ml

（8）質(zhì)量濃度為10%的L-半胱氨酸4.0～6.0 ml

（9）質(zhì)量濃度為15%的水解乳蛋白 32.0～35.0 ml

（10）青霉素 (20萬IU/ml) 0.25 ml

（11）無菌馬血清50 ml

培養(yǎng)基的pH值為7.2～7.4。

本發(fā)明的牛支原體培養(yǎng)基制備方法為：將基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組分逐一溶入750ml去離子水中，115℃高壓滅菌20min后晾至室溫備用；將輔助培養(yǎng)基的各組分分別經(jīng)0.22 微米濾膜濾過除菌后充分混合；無菌條件下，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基和輔助培養(yǎng)基混合，用滅菌水補(bǔ)齊定容至1000ml，用滅菌的1M NaOH（4 g溶于100 ml去離子水）調(diào)pH值到7.2-7.4，充分搖勻，分裝，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

本發(fā)明的牛支原體低血清高效培養(yǎng)基培養(yǎng)牛支原體可在牛支原體疫苗抗原制備中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明的牛支原體低血清高效培養(yǎng)基根據(jù)牛支原體的生長特性，通過對(duì)不同的碳源、氮源、蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽、膽固醇等諸多營養(yǎng)組分的組合進(jìn)行篩選，同時(shí)對(duì)培養(yǎng)基的pH值、滲透壓、離子強(qiáng)度等進(jìn)行了比較分析，研究出了適合培養(yǎng)牛支原體的低血清高效培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基中PPLO肉湯是支原體生長基礎(chǔ)液；丙酮酸鈉可作為支原體培養(yǎng)中的替代碳源；培養(yǎng)基中的葡萄糖為牛支原體生長提供能量；通過添加新鮮酵母浸出液，為牛支原體生長提供所需的氮源、維生素及微量元素等營養(yǎng)成分；添加L-谷氨酰胺可促進(jìn)微生物代謝、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成；添加L-半胱氨酸和水解乳蛋白為牛支原體生長提供合適的氨基酸；通過添加少量馬血清，向牛支原體提供生長所需的膽固醇和必需的飽和或不飽和脂肪酸；通過添加青霉素可抑制雜菌生長，對(duì)支原體無抑制效果，可避免培養(yǎng)基污染和延長培養(yǎng)基保存時(shí)間；添加酚紅作為pH值指示劑，可判斷支原體的生長狀況。該培養(yǎng)基的配方中除基本成份外，在培養(yǎng)基中還添加了新鮮酵母浸出液、L-谷氨酰胺、L-半胱氨酸和水解乳蛋白，上述成分的添加既能減少血清用量，還明顯提高了牛支原體的活菌滴度；經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，未添加之前活菌滴度為10⁸-10⁹ CCU/ml，添加之后活菌滴度可達(dá)10¹⁰ CCU/ml。而本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于培養(yǎng)基中低血清含量，培養(yǎng)基中血清用量僅為5%，是現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)基血清含量的1/2～1/4；用本發(fā)明方法制備的牛支原體半成品菌液滴度達(dá)10¹⁰ CCU/ml，活菌滴度明顯高于改良KM2培養(yǎng)基（10⁷ CCU/ml）、牛心湯培養(yǎng)基（10⁸ CCU/ml）和改良Thiaucourt’s培養(yǎng)基（10^8～10⁹CCU/ml）。牛支原體低血清高效培養(yǎng)基大大減輕了疫苗中異源體血清對(duì)牛體的過敏應(yīng)激反應(yīng)，提高了生物安全，也提高了活菌菌液滴度，降低了生產(chǎn)成本，為牛支原體優(yōu)質(zhì)疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

1、本發(fā)明培養(yǎng)基的制備：

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：

（1）PPLO肉湯22.0 g

（2）丙酮酸鈉5.0 g

（3）葡萄糖6.0 g

（4）質(zhì)量濃度為1%的酚紅2.0 ml

（5）去離子水750ml。

115℃滅菌20min，待冷卻后，在無菌條件下加入下列輔助培養(yǎng)基成分，制成本發(fā)明培養(yǎng)基。

輔助培養(yǎng)基：

（6）質(zhì)量濃度為25%的新鮮酵母浸出液110 ml

（7）質(zhì)量濃度為3%的L-谷氨酰胺17.0 ml

（8）質(zhì)量濃度為10%的L-半胱氨酸5.0 ml

（9）質(zhì)量濃度為15%的水解乳蛋白 33.0 ml

（10）青霉素 (20萬IU/ml) 0.25ml

（11）無菌馬血清50 ml

將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中（1）～（4）成分逐一溶入750ml去離子水（5）中，115℃高壓滅菌20min后晾至室溫備用。將輔助培養(yǎng)基的（6）～（11）成分分別經(jīng)0.22 微米濾膜濾過除菌后充分混合；無菌條件下，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基和輔助培養(yǎng)基混合，用滅菌水補(bǔ)齊定容至1000ml，用滅菌的1M NaOH（4 g溶于100 ml去離子水）調(diào)pH值到7.2-7.4，充分搖勻，分裝，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2、質(zhì)量濃度為25%的新鮮酵母浸出液的制備方法為：

取鮮酵母500 g，加入去離子水2000 ml中，攪拌溶解，用濃鹽酸：去離子水以=1:1（體積比）調(diào)pH值至4.5-5.0，80℃水?。ㄆ績?nèi)溫度）30分鐘，3000 轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取上清液。將上清液用1 M NaOH（4 g溶于100 ml去離子水）調(diào)pH值至7.8-8.0，煮沸，置室溫放涼后用雙層濾紙過濾，再補(bǔ)去離子水至2000 ml，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3、質(zhì)量濃度為1%的酚紅溶液的配制：

稱取酚紅1.0 g，置玻璃研缽中，逐滴加入0.1M NaOH（0.4 g溶于10 ml去離子水），研磨至完全溶解。將溶解的酚紅吸入100 ml量瓶中，用去離子水小心洗下研缽中殘留酚紅液至量瓶中，最后補(bǔ)加去離子水至100 ml。

實(shí)施例2：

本發(fā)明培養(yǎng)基的制備：

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：

（1）PPLO肉湯22.0 g

（2）丙酮酸鈉5.0 g

（3）葡萄糖8.0 g

（4）1%酚紅2.0 ml

（5）去離子水750ml。

115℃滅菌20min，待冷卻后，在無菌條件下加入下列輔助培養(yǎng)基成分，制成本發(fā)明培養(yǎng)基。

輔助培養(yǎng)基：

（6）25%新鮮酵母浸出液120 ml

（7）質(zhì)量濃度為3%的L-谷氨酰胺17.0 ml

（8）質(zhì)量濃度為10%的L-半胱氨酸5.0 ml

（9）質(zhì)量濃度為15%水解乳蛋白33.0 ml

（10）青霉素 (20萬IU/ml) 0.25ml

（11）無菌馬血清50 ml

將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中（1）～（4）成分逐一溶入750ml去離子水（5）中，115℃高壓滅菌20min后晾至室溫備用。將輔助培養(yǎng)基的（6）～（11）成分分別經(jīng)0.22 微米濾膜濾過除菌后充分混合；無菌條件下，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基和輔助培養(yǎng)基混合，用滅菌水補(bǔ)齊定容至1000ml，用滅菌的1M NaOH（4 g溶于100 ml去離子水）調(diào)pH值到7.2-7.4，充分搖勻，分裝，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

對(duì)比試驗(yàn)

應(yīng)用本發(fā)明培養(yǎng)基、改良Thiaucourt’s培養(yǎng)基、牛心湯培養(yǎng)基和改良KM2培養(yǎng)基對(duì)牛支原體PG45株進(jìn)行了比較試驗(yàn)，試驗(yàn)及結(jié)果如下。

一、培養(yǎng)基制備

1、本發(fā)明培養(yǎng)基的制備

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：

（1）PPLO肉湯22.0 g

（2）丙酮酸鈉5.0 g

（3）葡萄糖6.0 g

（4）質(zhì)量濃度為1%的酚紅2.5 ml

（5）去離子水750ml。

115℃滅菌20min，待冷卻后，在無菌條件下加入下列輔助培養(yǎng)基成分，制成本發(fā)明培養(yǎng)基。

輔助培養(yǎng)基：

（6）質(zhì)量濃度為25%的新鮮酵母浸出液110 ml

（7）質(zhì)量濃度為3%的L-谷氨酰胺16.7 ml

（8）質(zhì)量濃度為10%的L-半胱氨酸5.0ml

（9）質(zhì)量濃度為15%的水解乳蛋白 33.0 ml

（10）青霉素 (20萬IU/ml) 0.25ml

（11）無菌馬血清50 ml

將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中（1）～（4）成分逐一溶入750ml去離子水（5）中，115℃高壓滅菌20min后晾至室溫備用。將輔助培養(yǎng)基的（6）～（11）成分分別經(jīng)0.22 微米濾膜濾過除菌后充分混合；無菌條件下，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基和輔助培養(yǎng)基混合，用滅菌水補(bǔ)齊定容至1000ml，用滅菌的1M NaOH（4 g溶于100 ml去離子水）調(diào)pH值到7.2-7.4，充分搖勻，分裝，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2、改良Thiaucourt’s培養(yǎng)基的配制

基礎(chǔ)液：

PPLO肉湯21.0 g

丙酮酸鈉2.0 g

葡萄糖1.0 g

0.4%酚紅4.5 ml

去離子水700ml。

115℃高壓滅菌20min。

培養(yǎng)基：

基礎(chǔ)液 700ml

25%新鮮酵母浸出液100 ml

青霉素（20萬IU/ml）1ml

10%醋酸鉈1 ml

無菌馬血清200 ml

混合后用滅菌的1M NaOH調(diào)pH值到7.4，經(jīng)0.22 微米濾膜濾過除菌后分裝備用。

3、牛心湯培養(yǎng)基的配制

1％水解乳蛋白Hank’s液562.5 ml

牛心湯337.5 ml

25%新鮮酵母浸出液20 ml

青霉素（20萬IU/ml）1ml

1%酚紅2.5 ml

10%醋酸鉈1 ml

無菌馬血清100 ml

混合后用滅菌的1M NaOH調(diào)pH值到7.4，經(jīng)0.22 微米濾膜濾過除菌后分裝備用。

4、改良KM2培養(yǎng)基的配制

MEM 5 g

葡萄糖0.4 g

丙酮酸鈉0.2 g

水解乳蛋白5.1 g

1%酚紅2.5 ml

25%新鮮酵母浸出液20 ml

青霉素（20萬IU/ml）1ml

10%醋酸鉈1 ml

無菌馬血清200 ml

混合，用去離子水定容至1000ml，用滅菌的1M NaOH調(diào)pH值到7.4，經(jīng)0.22 微米濾膜濾過除菌后分裝備用。

二、牛支原體的培養(yǎng)

將牛支原體PG45株（購自美國菌種保藏中心ATCC，編號(hào)ATCC 25523）分別接種本發(fā)明培養(yǎng)基（血清含量為5%）、牛心湯培養(yǎng)基（血清含量為10%）、改良Thiaucourt’s培養(yǎng)基（血清含量為20%）和改良KM2培養(yǎng)基（血清含量為20%），種子繼代復(fù)壯后，分別按10% (V/V) 的比例接種對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)基的顏色變黃、pH值由7.4 降至6.8～6.9 時(shí)，無菌取出培養(yǎng)物。

三、檢測

活菌滴度（CCU）測定。方法如下：取12支試管，每管加對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基4.5 ml，在第1管中加入0.5 ml生長良好的牛支原體培養(yǎng)物，用振蕩器充分混勻，換新的移液管，從第1管吸取0.5 ml加入到第2管中，依次進(jìn)行10倍稀釋至第11管，第11管中棄去0.5 ml培養(yǎng)液；得到培養(yǎng)液的稀釋度分別為10^-1-10^-11，第12管為對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基對(duì)照。試驗(yàn)管設(shè)3個(gè)重復(fù)。將試管置37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每天觀察顏色變化，連續(xù)觀察10天，發(fā)生顏色變化的最高稀釋度即為該培養(yǎng)物的活菌滴度，用顏色變化單位（CCU）表示。試驗(yàn)重復(fù)3次。

四、試驗(yàn)結(jié)果：

牛支原體接種4種培養(yǎng)基3次生長試驗(yàn)CCU測定結(jié)果見表1。

經(jīng)3次試驗(yàn)結(jié)果顯示，在同樣條件下，使用本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)牛支原體的生長時(shí)間為1天，改良Thiaucourt’s培養(yǎng)基培養(yǎng)牛支原體的生長時(shí)間為1天，牛心湯培養(yǎng)基和改良KM2培養(yǎng)基培養(yǎng)牛支原體的生長時(shí)間為2天；改良Thiaucourt’s培養(yǎng)基3次CCU測定結(jié)果為10⁸～10⁹CCU/ml，牛心湯培養(yǎng)基3次CCU測定結(jié)果均為10⁸ CCU/ml，改良KM2培養(yǎng)基3次CCU測定結(jié)果均為10⁷ CCU/ml。使用本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)牛支原體，3次CCU測定結(jié)果均為10¹⁰ CCU/ml（表1），明顯高于現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)基培養(yǎng)牛支原體的活菌滴度。結(jié)果說明，本發(fā)明的牛支原體培養(yǎng)基具有血清含量低、生長迅速和活菌滴度高的特點(diǎn)。