本發(fā)明提供一種聚乙烯醚苯甲酸酯的制備方法，用于從螺旋藻破壁清液中萃取藻藍蛋白。屬于食品分離工程技術領域。
背景技術：
螺旋藻藻藍蛋白存在于螺旋藻的藻膽體中。藻膽體是紅藻和藍藻所特有的一種超分子捕光色素復合體。藻藍蛋白色澤呈明亮的藍色，顏色鮮艷，是食品、高級眼影、唇膏的首選純天然色素。藻藍蛋白還可以調節(jié)和合成人體代謝所需要的多種重要酶，具有明顯的抗氧化、抗炎癥作用，調節(jié)人體免疫系統(tǒng)，增強免疫系統(tǒng)功能。高純度的藻藍蛋白帶有很強的熒光，制成的純天然熒光試劑，用于臨床醫(yī)學診斷，免疫化學及生物醫(yī)學工程等研究領域。
在我國，每年的螺旋藻全國總產量已達到7000噸。螺旋藻產量的三分之一用于直接出口，其它螺旋藻多以藻粉、微藻藻片和灌注膠囊的形式當作保健品使用。螺旋藻的規(guī)模化開發(fā)和利用處于初級加工階段，還沒有深加工產品。螺旋藻中藻藍蛋白的提取還處于實驗室研究階段，沒有適合于工業(yè)化生產的好的工藝方法。目前，市場上銷售的高純度的藻藍蛋白商品都是從國外進口，價格昂貴，在應用上受到限制。
因此，開發(fā)簡便、快速的螺旋藻藻藍蛋白的提取過程，提高螺旋藻藻藍蛋白產品純度是目前螺旋藻藻藍蛋白的規(guī)?；_發(fā)利用中亟待解決的關鍵問題。聚合物雙水相分離蛋白質具有生物相容性高，操作條件溫和，易于進行連續(xù)化操作等優(yōu)點。已報道的有關制備藻類藻藍蛋白的雙水相萃取分離藻藍蛋白的專利技術，例如中國專利CN103880950A采用價格昂貴的離子液體組成雙水相，增加生產成本，CN102993297A、CN101891809A等采用市售的PEG組成聚合物雙水相，分離藻藍蛋白的選擇性差，需要與鹽析等其它提取手段聯(lián)合使用才能得到高純度產品，過程繁瑣。
本發(fā)明提供一種對藻藍蛋白具有特異性萃取能力的聚乙烯醚苯甲酸酯，可通過兩相萃取方式從螺旋藻破壁液中直接分離純化藻藍蛋白，無需與鹽析等其它提取手段聯(lián)合使用，就能得到高純度藻藍蛋白。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種聚乙烯醚苯甲酸酯的制備方法，用于雙水相萃取分離螺旋藻藻藍蛋白，獲得高純度的藻藍蛋白，應用于天然色素、保健食品和新藥的研究開發(fā)。
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種聚乙烯醚苯甲酸酯的制備方法，用于從螺旋藻破壁液中萃取分離藻藍蛋白。其方法簡單，快捷，成本低，分離藻藍蛋白具有較高的純度，原料既可采用新鮮螺旋藻也可采用螺旋藻干粉，從而提供了一種解決螺旋藻藻藍蛋白資源規(guī)?；玫姆椒ā?/p>
本發(fā)明的技術方案：一種聚乙烯醚苯甲酸酯雙水相萃取螺旋藻藻藍蛋白的分離技術，步驟為：
(1)聚乙烯醚苯甲酸酯的制備；(2)雙水相萃取分離藻藍蛋白；(3)藻藍蛋白水溶液經濃縮和冷凍干燥獲得藻藍蛋白粉。
所述的方案，步驟1中，在圓底燒瓶中放入聚乙二醇、氫氧化鈉水溶液和三甲胺，氫氧化鈉水溶液重量百分比濃度為0.8～2.5％，氫氧化鈉與聚乙二醇的重量比為0.02～0.05:1，三甲胺的加入量為0.3～0.8g，在0℃～5℃和磁力攪拌條件下，滴加苯甲酰氯反應1～2小時，苯甲酰氯與聚乙二醇的重量比為0.05～0.15:1，然后在反應混合物中加入200～500ml的二氯甲烷萃取，收集上相在45℃下真空蒸餾1小時，加入2～5倍體積0℃乙醚沉淀，過濾獲得聚乙烯醚苯甲酸酯。
所述的方案，步驟2中，螺旋藻破壁清液的制備：采用水或磷酸緩沖液作提取劑，磷酸緩沖液的濃度為25～100mmol/L，藻粉或鮮藻與提取液的固液比為1:50～1:150，攪拌均勻后，置于-10℃～-20℃下冷凍一定時間后，37℃溶解，如此反復凍融4-6次，融化后離心獲得的破壁清液，破壁清液中蛋白質濃度為1.0～5.6mg/ml，藻藍蛋白純度為0.5～0.72。
所述的方案，步驟2中，在螺旋藻破壁清液中加入聚乙烯醚苯甲酸酯和無機鹽，聚乙烯醚苯甲酸酯:無機鹽:破壁清液的重量比為0.05～0.25:0.2～0.35:1，震蕩混合2分鐘，靜置分相，藻藍蛋白富集于下相。將含藻藍蛋白的下相經截留分子量為30000道爾頓的超濾膜過濾，去除聚乙烯醚苯甲酸酯和無機鹽，獲得藻藍蛋白水溶液，純度為3.8～4.7，蛋白濃度為5.15～6.6mg/ml。
所述的方案，步驟3中，將藻藍蛋白水溶液在60℃下真空濃縮至原體積三分之一，冷凍干燥后得到藻藍蛋白粉末。
本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，主要具有以下優(yōu)點：1.聚乙烯醚苯甲酸酯對藻藍蛋白的萃取吸附選擇性高，適合不同規(guī)模和場地的工業(yè)化生產要求；2.聚乙烯醚苯甲酸酯可直接從螺旋藻破壁清液中萃取獲得高純度的藻藍蛋白，無需其它提取手段配合，生產成本低；3.制備藻藍蛋白的原料可以是螺旋藻鮮藻或者干藻粉，有效地解決螺旋藻資料的利用和高值化問題。
具體實施方式
實施實例1
(1)螺旋藻破壁清液的制備
取產于江蘇東臺市賜百年生物工程有限公司的鈍頂螺旋藻干粉，用去離子水作提取劑，藻粉與去離子水的固液比為1:50，置于-20℃下冷凍4小時后，37℃融解，如此反復凍融4次，融化后的藍藻破壁液用離心機在6000轉/min下離心10分鐘，取上清液為破壁清液，清液中蛋白質濃度為1.0mg/ml，藻藍蛋白純度A620/A280為0.52mg/ml。
(2)聚乙烯醚苯甲酸酯的制備
在1000ml的圓底燒瓶中放入100g聚乙二醇PEG-1000(購自海安石油化工廠)和重量百分比濃度為0.8％氫氧化鈉(購自南京化學試劑有限公司)水溶液，氫氧化鈉與聚乙二醇的重量比為0.02:15g，再加入0.3g三甲胺，在0℃和磁力攪拌條件下，滴加5g苯甲酰氯反應1小時，然后在反應混合物中加入200ml的二氯甲烷(購自河南八方化工有限公司)萃取，收集上相在45℃下真空蒸餾1小時，加入2倍體積0℃乙醚沉淀，過濾獲得聚乙烯醚苯甲酸酯。
(3)兩相萃取
在10g螺旋藻破壁清液中加入0.5g聚乙烯醚苯甲酸酯和0.3g無水硫酸鎂(購自南京大唐化工有限責任公司)，震蕩混合2分鐘，靜置分相，藻藍蛋白富集于下相，下相經截留分子量為30000道爾頓的超濾膜(頗爾過濾器有限公司)過濾，去除聚乙烯醚苯甲酸酯和硫酸鎂，獲得藻藍蛋白水溶液，純度為3.8，蛋白濃度為5.15mg/ml。
(4)冷凍干燥獲得藻藍蛋白粉
將前述步驟(3)中獲得的藻藍蛋白水溶液在60℃下真空濃縮至原體積三分之一，冷凍干燥后得到藻藍蛋白粉產品。產品中藻藍蛋白純度A620/A280為3.9，蛋白回收率為85％。
實施例2
(1)螺旋藻破壁液的制備
取產于江蘇大豐賜百年生物科技有限公司的新鮮螺旋藻，用50mmol/L磷酸緩沖液作提取劑，螺旋藻與去離子水的固液比為1:100，置于-10℃下冷凍4小時后，37℃融解，如此反復凍融5次。融化后的藍藻破壁液用離心機在6000轉/min下離心10分鐘，取上清液為破壁清液，清液中蛋白質濃度為3.1mg/ml，藻藍蛋白純度A620/A280為0.5。
(2)聚乙烯醚苯甲酸酯的制備
在1500ml的圓底燒瓶中放入100g聚乙二醇PEG-3000(購自海安石油化工廠)和重量百分比濃度為1.8％氫氧化鈉(購自南京化學試劑有限公司)水溶液，氫氧化鈉與聚乙二醇的重量比為0.03:1g，再加入0.6g三甲胺，在0℃和磁力攪拌條件下，滴加10g苯甲酰氯反應1小時，然后在反應混合物中加入400ml的二氯甲烷(購自河南八方化工有限公司)萃取，收集上相在45℃下真空蒸餾1小時，加入4倍體積0℃乙醚沉淀，過濾獲得聚乙烯醚苯甲酸酯。
(3)兩相萃取
在10g螺旋藻破壁清液中加入1.7g聚乙烯醚苯甲酸酯和3g無水硫酸鈉(購自南京大唐化工有限責任公司)，震蕩混合2分鐘，靜置分相，藻藍蛋白富集于下相，將下相經截留分子量為30000道爾頓的超濾膜(頗爾過濾器有限公司)過濾，去除聚乙烯醚苯甲酸酯和硫酸鈉，獲得藻藍蛋白水溶液，純度為4.3，蛋白濃度為6.6mg/ml。
(4)冷凍干燥獲得藻藍蛋白粉
將前述步驟(3)中獲得的藻藍蛋白水溶液在60℃下真空濃縮至原體積三分之一，冷凍干燥后得到藻藍蛋白粉產品。產品中藻藍蛋白純度A620/A280為4.6，蛋白回收率85％。
實施例3
(1)螺旋藻破壁液的制備
取產于云南麗江程海源螺旋藻基地的螺旋藻粉，用150mmol/L磷酸緩沖液作提取劑，螺旋藻與去離子水的固液比為1:150，置于-20℃下冷凍4小時后，37℃融解，如此反復凍融6次。融化后的藍藻破壁液用離心機在6000轉/min下離心10分鐘，取上清液為破壁清液，清液中的藻藍蛋白純度A620/A280為0.77，破壁液蛋白質濃度為4.6mg/ml。
(2)聚乙烯醚苯甲酸酯的制備
在1500ml的圓底燒瓶中放入100g聚乙二醇PEG-3000(購自海安石油化工廠)和重量百分比濃度為2.5％氫氧化鈉(購自南京化學試劑有限公司)水溶液，氫氧化鈉與聚乙二醇的重量比為0.05:1g，再加入0.8g三甲胺，在0℃和磁力攪拌條件下，滴加15g苯甲酰氯反應2小時，然后在反應混合物中加入500ml的二氯甲烷(購自河南八方化工有限公司)萃取，收集上相在45℃下真空蒸餾1小時，加入5倍體積0℃乙醚沉淀，過濾獲得聚乙烯醚苯甲酸酯。
(3)兩相萃取
在10g螺旋藻破壁清液中加入2.2g聚乙烯醚苯甲酸酯和3.2g無水磷酸鉀(購自南京大唐化工有限責任公司)，震蕩混合2分鐘，靜置分相，藻藍蛋白富集于上相，將上相經截留分子量為30000道爾頓的超濾膜(頗爾過濾器有限公司)過濾，去除聚乙烯醚苯甲酸酯和磷酸鉀，獲得藻藍蛋白水溶液，純度為4.7，蛋白濃度為5.6mg/ml。
(4)冷凍干燥獲得藻藍蛋白粉
將前述步驟(3)中獲得的藻藍蛋白水溶液在60℃下真空濃縮至原體積三分之一，冷凍干燥后得到藻藍蛋白粉產品。產品中藻藍蛋白純度A620/A280為4.7，蛋白回收率90％。