本發(fā)明涉及血清學檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種O型口蹄疫病毒樣顆粒的制備方法及檢測試紙。

背景技術(shù)：

口蹄疫(Foot-and-Mouth，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸傳染性和可快速遠距離傳播的動物疫病。FMD的宿主范圍很廣，包括家養(yǎng)的反芻動物、鹿和豬以及70多種野生的偶蹄動物均可感染，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為A類傳染病之首。口蹄疫一旦爆發(fā)往往會大規(guī)模流行，且不易控制和消滅，給疾病流行國家和地區(qū)的畜牧業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。

因此，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將該病列在15個A類動物疫病之首，我國政府也將口蹄疫排在14個一類動物傳染病的第一位，口蹄疫目前已知的有7個血清型：O型、A型、C型、南非1型、南非2型、南非3型和Asia1型，同時，還包括65個以上亞型，O型口蹄疫為全世界流行最廣的一個血清型，由于相同血清型的不同病毒株的抗原性不完全同，且由于病毒處于不斷進化變異的狀態(tài)，容易出現(xiàn)新的毒株，導致口蹄疫的防治工作產(chǎn)生比較困難。

目前O型口蹄疫的流行呈現(xiàn)上升趨勢，簡單、快速、有效的抗體監(jiān)測方法，是防制口蹄疫爆發(fā)和流行的保障，也是制定口蹄疫免疫程序的重要依據(jù)。

目前O型口蹄疫抗體的檢測方法主要包括CFT(補體結(jié)合試驗)、VNT(人玻連蛋白)、凝集試驗、免疫擴散和ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定法)等，但是這些方法容易受到外部環(huán)境的干擾，需要在條件穩(wěn)定的實驗室中進行檢測。

其中最常用于的檢測FMDV(foot and mouth disease virus，口蹄疫病毒)的方法是ELISA方法，但此方法需要預先對血液樣品進行純化，且需要在特定溫度等外部條件下，需要經(jīng)過較繁復的操作和使用較多的檢測設(shè)備才能完成檢測，檢測周期長，且對檢測人員的要求較高，無法在現(xiàn)場進行實時快速的測定。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種O型口蹄疫病毒樣顆粒的制備方法及檢測試紙，能夠縮短檢測周期，檢測方法比較簡單，能夠在現(xiàn)場進行實時快速的測定。

為達到以上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

一種O型口蹄疫病毒樣顆粒的制備方法，包括以下步驟：

S1、小泛素樣修飾蛋白融合表達載體pSM的構(gòu)建：從釀酒酵母菌株EGY48基因組上擴增smt3基因，使用經(jīng)Nco I和BamH I雙酶切后將smt3基因插入到用同樣內(nèi)切酶處理的pET-28a載體中，所得載體為pSM1，將pSM1的卡那霉素抗性基因替換為氨芐抗性基因，得載體pSM2；

S2、重組表達載體的構(gòu)建：根據(jù)GenBank中記載的豬O型FMDV設(shè)計引物，從豬O型口蹄疫病毒中提取該病毒的RNA，反轉(zhuǎn)錄后分別擴增獲得VP0，VP3和VP1基因；

將經(jīng)BsmB I/BamH I雙酶切后的VP0、VP3和VP1片段分別插入經(jīng)Bsa I酶切處理的pSM1，pSM2和pSM1，得到重組表達載體pSM1/VP0，pSM2/VP3和pSM1/VP1；

S3、雙表達重組載體的構(gòu)建：以pSM1/VP1為模板，以T7BamH I/VP1Xho I為引物擴增獲得含有T7啟動子等原核表達元件和VP1基因的DNA片段，經(jīng)BamH I/Xho I雙酶切后插入用同樣酶切處理的pSM1/VP0中，得雙表達重組載體pSM1/VP0-VP1；

S4、蛋白表達與純化：將測序正確的陽性重組質(zhì)粒pSM2/VP3和pSM1/VP0-VP1共轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中，挑取單克隆菌落接種于含有氨芐抗生素、卡納抗生素和氯霉素3種抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；

向菌液中加入IPTG至濃度為0.5mmol/L誘導表達16h，從誘導后的菌液中獲取菌體，將菌體懸浮于buffer A中，離心分離得到重組蛋白；

S5、O型口蹄疫病毒樣顆粒的體外組裝：用小泛素樣修飾融合蛋白，通過HisTrap HP除去小泛素樣修飾蛋白，收集含有VP0、VP1和VP3的液體，用透析緩沖液PBS透析組裝成O型口蹄疫病毒樣顆粒。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述O型口蹄疫病毒樣顆粒的直徑為18～21nm。

一種用于檢測O型口蹄疫的試紙，包括底板，底板的頂部設(shè)置有檢測層，檢測層上設(shè)置有檢測線和對照線，檢測層的頂部靠近對照線的一側(cè)設(shè)置有吸收層，靠近檢測線的一側(cè)設(shè)置有免疫金標墊，免疫金標墊的頂部設(shè)置有樣品墊；

免疫金標墊上涂覆有膠體金顆粒，該膠體金顆粒上結(jié)合有SPA標記物，檢測線上涂覆/浸潤有O型口蹄疫病毒樣顆粒，對照線上涂覆/浸潤有兔IgG。

所述免疫金標墊上膠體金與SPA的比例為2×10⁴:1～2。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述免疫金標墊上膠體金與SPA的比例為2×10⁴:1.3。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述免疫金標墊的吸附比例為10～50μL/cm。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述檢測線上涂覆/浸潤有濃度為0.5～1mg/mL的O型口蹄疫病毒樣顆粒。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述對照線上涂覆/浸潤有濃度為0.8～1.5mg/mL的免疫兔血清IgG。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：

(1)本發(fā)明中用于檢測O型口蹄疫的試紙，由于檢測層上設(shè)置有檢測線和對比線，且檢測線上涂覆/浸潤有濃度為0.5～1mg/mL的O型口蹄疫病毒樣顆粒，對照線上涂覆/浸潤有濃度為0.8～1.5mg/mL兔IgG，在使用時，直接將血液樣品稀釋后在現(xiàn)場(溫度在0～35°均可)進行檢測，如果血液樣品中含有O型口蹄疫抗體，血液樣品中的抗體與免疫金標墊中SPA修飾的膠體金結(jié)合形成復合物，與檢測線上O型口蹄疫病毒樣顆粒結(jié)合形成紫紅色線條，繼續(xù)前行，未與抗原結(jié)合的抗體攜帶重組蛋白SPA與對照線中的IgG抗體形成紫紅色線條。

將檢測結(jié)果與常規(guī)的CFT、VNT凝集試驗、免疫擴散和ELISA進行比較，結(jié)果基本一致，且本發(fā)明的血液未經(jīng)過純化，說明本發(fā)明的準確度較高，且檢測條件不高，穩(wěn)定性較好，具有操作簡單、檢測快速、結(jié)果清楚，易于判斷和保存，且無需大型儀器設(shè)備，成本較低，能夠用于臨床快速實時檢測，快速檢測流行病，便于快速采取相應措施，避免疾病大規(guī)模爆發(fā)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例中用于檢測O型口蹄疫的試紙的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖中：1-底板，2-樣品墊，3-免疫金標墊，4-檢測層，5-吸收層，6-檢測線，7-對照線。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。

本發(fā)明實施例提供一種O型口蹄疫病毒樣顆粒的制備方法，包括以下步驟：

S1、小泛素樣修飾蛋白融合表達載體pSM的構(gòu)建：

a、從釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株EGY48基因組上擴增smt3基因(GenBank登陸號：AY558174)，引物序列如下：上游引物smt3F：5’GCCATGGGTCATCACCATCATCATCAC(6×His)GGGTCG GACTCAGAAGTCAATCAA 3’；下游引物smt3F：5’GGATCCGAGACCTTAAGGTCTCAACCTCCAATCTGTTCGCGGTG3’。

b、使用經(jīng)Nco I(限制性核酸內(nèi)切酶)和BamH I(一種限制性內(nèi)切酶)雙酶切后將smt3基因插入到用同樣內(nèi)切酶處理的pET-28a載體中，所得載體為pSM1，將pSM1的卡那霉素抗性基因替換為氨芐抗性基因，得載體pSM2。

S2、重組表達載體的構(gòu)建：

S201、O型口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP0，VP3和VP1基因的擴增：根據(jù)GenBank(基因庫)中記載的豬O型FMDV設(shè)計引物，使用Qiagen公司生產(chǎn)的RNaeasy Mini kit(一種試劑盒)從豬O型口蹄疫病毒中提取該病毒的RNA，反轉(zhuǎn)錄后分別擴增獲得VP0，VP3和VP1基因，反轉(zhuǎn)錄中PCR循環(huán)參數(shù)為：先在94℃下5min進行1個循環(huán)；然后依次在94℃下60s，58℃下60s，72℃下2.5min進行30個循環(huán)；最后一循環(huán)在72℃持續(xù)8min。

引物序列如下：

上游引物VP0-F BsmB I：

5’TACTTCGTCTCCGCGGATCCGGAGCCGGGCAATCCAGC；

下游引物VP0-RBamH I：

5’GCGAGTGGATCCATTAAGCTTGCCTCCTTCGAGGGGAGTTC；

上游引物VP1-F BsmB I：

5’GGACTTCGTCTCACTACTGCCACCGGGGAATC；

下游引物VP1-R BamH I：

5’GCTTATGGATCCTTACAGGAGTTGTTTTGCTGGG

上游引物VP3-F BsmB I：

5’GCACTTCGTCTCGCGATTGTCCCGGTTGCAT；

下游引物VP3-R BamH I：

5’GCGCACGGATCCTTGTGAGCGGGGGTCAATCG。

S202、將經(jīng)BsmB I/BamH I(兩種限制性內(nèi)切酶)雙酶切后的VP0、VP3和VP1片段分別插入經(jīng)Bsa I酶切處理的pSM1，pSM2和pSM1，得到重組表達載體pSM1/VP0，pSM2/VP3和pSM1/VP1。

S3、雙表達重組載體的構(gòu)建：

以pSM1/VP1為模板，以T7BamH I/VP1Xho I為引物擴增獲得含有T7啟動子等原核表達元件和VP1基因的DNA片段，經(jīng)BamH I/Xho I雙酶切后插入用同樣酶切處理的pSM1/VP0中，得雙表達重組載體pSM1/VP0-VP1，引物序列如下：上游引物T7BamH I：5’GCAATTGGA CCCGTCCGGCGTAGAGGATCGA，下游引物VP1Xho I：5’GCGCACCTCGAGCTACTGTTGCCGAGCGTCCAC。

S4、蛋白表達與純化。

將測序正確的陽性重組質(zhì)粒pSM2/VP3和pSM1/VP0-VP1共轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中，挑取單克隆菌落接種于含有氨芐抗生素、卡納抗生素和氯霉素3種抗生素的LB培養(yǎng)基(一種培養(yǎng)基的名稱)中，在溫度為37℃、轉(zhuǎn)速為220r/min的條件下培養(yǎng)12h，然后將培養(yǎng)的表達菌以1：100比例重新接種200ml含上述3種抗生素的LB培養(yǎng)基中，在溫度為37℃、轉(zhuǎn)速為220r/min的條件下培養(yǎng)至OD600值為0.9左右，留樣1ml作為誘導前對照。

其余菌液轉(zhuǎn)入溫度為16℃、加入IPTG(異丙基硫代半乳糖)至濃度為0.5mmol/L誘導表達16h，誘導后的菌液在轉(zhuǎn)速為4750r/min的條件下離心20min后收取菌體，隨后按1：50濃縮比例將菌體懸浮于buffer A(緩沖劑，配方為：500mmol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl，20mmol/L Imidazole，2mmol/L DTT，0.05％TritonX-100，pH 8.4)，充分混勻后在冰上超聲波處理6min，然后在溫度為4℃的條件下11500×g離心15min后收集上清，得到重組蛋白。

使用His標簽蛋白純化試劑盒(一種用于純化蛋白的試劑盒)純化重組蛋白：將重組蛋白樣品進行10％SDS-PAGE電泳，隨后采用濕轉(zhuǎn)法將重組蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯雜交膜(PVDF膜)上，用封閉液(PBS，5％脫脂奶粉，pH 7.0)在37℃條件下封閉1h，然后分別用抗His一抗(摩爾比為1：3000)和抗FLAG一抗在37℃下孵育1h，使用PBST(一種緩存溶液)充分洗滌后分別用辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG(摩爾比為1：6000)和山羊抗兔IgG(摩爾比為1：4000)在37℃孵育1h，PBST充分洗滌后于暗室內(nèi)加入發(fā)光底物反應3min，置于Kozak膠片下曝光，顯影及定影固定后，觀察目的蛋白的表達情況，經(jīng)過觀察可知，采用本方法獲得了預期大小的蛋白，且該蛋白具有免疫活性。

S5、O型口蹄疫病毒樣顆粒的體外組裝：

參照invitrogen的試劑使用說明，用小泛素樣修飾融合蛋白，通過HisTrap HP除去小泛素樣修飾蛋白，收集含有VP0、VP1和VP3的液體，用透析緩沖液PBS(pH 7.5)透析組裝成目的病毒樣顆粒，將該病毒樣顆粒置于電鏡下觀察，能夠清晰看到多個直徑為18～21nm的病毒樣顆粒，說明本發(fā)明成功的在原核生物體外組裝得到病毒顆粒。

參見圖1所示，本發(fā)明實施例提供一種用于測試動物O型口蹄疫的試紙，包括采用PVC制成的底板1，底板1的頂部設(shè)置有檢測層4，檢測層4包括檢測線6和對照線7，檢測線6上設(shè)置有檢測線6和對照線7，檢測層4的頂部靠近對照線7的一側(cè)設(shè)置有吸收層5，靠近檢測線6的一側(cè)設(shè)置有免疫金標墊3，免疫金標墊3的頂部設(shè)置有樣品墊2。

免疫金標墊3包括膠體金顆粒，該膠體金顆粒上結(jié)合有SPA(金黃色葡萄球菌A蛋白)標記物，檢測線6涂覆/浸潤有O型口蹄疫病毒樣顆粒，對照線7上涂覆/浸潤有兔IgG。

免疫金標墊3上膠體金與SPA的比例為2×10⁴:1～2，且膠體金與SPA的最佳比例為2×10⁴:1.3，免疫金標墊3的吸附比例為10～50μL/cm。

檢測線6上涂覆/浸潤有濃度為0.5～1mg/mL的O型口蹄疫病毒樣顆粒，對照線7上涂覆/浸潤有濃度為0.8～1.5mg/mL的免疫兔血清IgG

上述用于測試動物O型口蹄疫的試紙的制備方法為：

S1、制備IgG：

a、采集2只陰性家兔全血，放入4℃冰箱過夜沉淀，將沉淀的全血在轉(zhuǎn)速為4000r/min的條件下離心10min，取上清即為血清。將20ml血清中加入20ml生理鹽水中，再加入10ml飽和(NH₄)₂SO₄溶液，混合均勻后靜置30min，然后在轉(zhuǎn)速為3000r/min的條件下離心20min，棄去沉淀除去纖維蛋白，取上清液。

b、在上清液中加入30ml(NH₄)₂SO₄飽和溶液，混合均勻后靜置30min，在轉(zhuǎn)速為3000r/min的條件下離心20min，棄上清液，取沉淀物，向沉淀物中加20ml生理鹽水，10ml(NH₄)₂SO₄飽和溶液，混合均勻后靜置30min，3000r/min離心20min，棄上清。

重復b步驟2～3次后，向純化后的沉淀中加入10ml生理鹽水并透析，先放入純水中透析過夜除鹽，然后放入生理鹽水中在4℃下透析24h，透析期間每2～3h換液一次。

檢測透析是否完全：檢測試劑為濃度為1％的BaCl₂(用于檢測SO₄^2-)或以納氏試劑(用于檢測NH₄⁺)：取3～4ml透析液，加入檢測試劑1～2滴，出現(xiàn)磚紅色即認為有NH₄⁺存在)，出現(xiàn)白色沉淀即有SO₄^2-存在，透析至無沉淀出現(xiàn)后，離心去沉淀(去除雜蛋白)，上清液即為純化后的兔IgG。

S2、制備膠體金：取1g氯金酸溶于100ml三蒸水中制成濃度為1％的氯金酸溶液，向100ml水中加入1ml 1％的氯金酸水溶液，加熱至沸騰，邊攪拌邊逐滴加入1.7ml濃度為1％的檸檬酸鈉三鈉水溶液，繼續(xù)煮沸5min，冷卻后加入蒸餾水至100ml，即為膠體金放置于溫度為4℃的條件下保存。

S3、判斷SPA的最小蛋白用量：取96孔板，每孔加入100μL的膠體金，將1～20μL濃度為0.05mg/ml的SPA分別加入每孔并混勻，靜置15min，每孔加入20μL濃度為10％的NaCl，放置10min，顏色保持紅色的為最小蛋白用量，在此基礎(chǔ)上加30％為最佳標記量，本實施例中，最小蛋白用量為10μL，即每100μL濃度為1g/100ml的膠體金至少需要10μL濃度為0.05mg/ml的SPA，膠體金與SPA的質(zhì)量比為2×10⁴:1，最佳膠體金與SPA的比例為2×10⁴:1.3，在實際使用時，可以根據(jù)需要調(diào)整膠體金和SPA的比例。

S4、制備SPA修飾的膠體金和免疫金標墊3：使用濃度為0.1M的K₂CO₃調(diào)整膠體金的pH值為5.9，按質(zhì)量比為2×10⁴:1～1.5(最優(yōu)為2×10⁴:1～1.3)將相應的SPA溶液加入膠體金中放置30min后，在轉(zhuǎn)速為10000r/min、溫度為4℃的條件下離心30min，將沉淀溶于重懸液中混合均勻，得到SPA修飾的膠體金溶液，選用玻璃膜作為免疫金標墊3基材，將玻璃膜放入SPA修飾的膠體金溶液中浸潤并晾干，吸附比為10～50μL/cm，最佳吸附比為30μL/cm，得到免疫金標墊3。

S5、制備檢測層4

使用硝酸纖維膜作為檢測層4基材，在檢測層4上標記檢測線6和對照線7，檢測線6與對照線7之間的距離為0.3～1cm(最優(yōu)為0.5cm)，且對照線7位于纖維素膜的中段，在檢測線6上噴涂濃度為0.5～1mg/mL(最優(yōu)為0.8mg/mL)的O型口蹄疫病毒樣顆粒；在對照線7上噴涂兔IgG，噴涂量為10μl/1cm。

S6、制備樣品墊2：以玻璃纖維膜作為樣品墊2的基材，將20mM的PB(磷酸鹽緩存溶液)、1％的吐溫20、1％的BSA和2.5％的蔗糖溶于100ml三蒸水中并過濾得到樣品液，把玻璃纖維膜浸泡于該樣品液中，完全浸潤后取出并晾干。

S7、在底板1的頂部設(shè)置檢測層4，并將檢測層4壓平，將吸收層5(吸水紙)一部分固定在底板1上，一部分固定在檢測層4上靠近對照線7的部分，將免疫金標墊3的一側(cè)固定在底板1上，另一側(cè)固定在檢測層4靠近檢測線6的一側(cè)，樣品墊2的一側(cè)固定在底板1上，樣品墊2的一側(cè)固定在底板1上，另一側(cè)固定在免疫金標墊3上。

本發(fā)明膠體金試紙在使用時，先將樣品稀釋，然后將膠體金試紙的樣品墊2端插入樣品中，樣品墊2上設(shè)置有液面線，樣品的液面不能沒過液面線，當吸收層5完全被液體浸潤后，取出試紙條，平放后5～15分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。

如果血液樣品中含有O型口蹄疫抗體，血液樣品中的抗體與免疫金標墊3中SPA修飾的膠體金結(jié)合形成復合物，與檢測線6上O型口蹄疫病毒樣顆粒結(jié)合形成紫紅色線條，繼續(xù)前行，未與抗原結(jié)合的抗體攜帶重組蛋白SPA與對照線7中的IgG抗體形成紫紅色線條。

如果對照線7不出現(xiàn)紫紅條帶則說明該試紙條失效，如果檢測血液樣品中不含有O型口蹄疫相關(guān)抗體，則檢測線6處不會出現(xiàn)紫紅色條帶，而對照線7處必定仍出現(xiàn)紫紅色條帶。

本發(fā)明不局限于上述實施方式，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本說明書中未作詳細描述的內(nèi)容屬于本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員公知的現(xiàn)有技術(shù)。