本發(fā)明涉及EST-SSR引物、制備方法，具體涉及4對EST-SSR引物和其制備方法及在櫻屬植物指紋圖譜構建中的應用。

背景技術：

據《Flora of China》記載全世界約有櫻花150種，而中國約有48個種及8個變種，遠超日本、朝鮮、臺灣及其它國家和地區(qū)，尤以野生資源較為豐富，但我國從古至今都只重視食用櫻桃的栽培，對于觀賞類櫻花品種的培育不多，遠落后于日本。然而目前對櫻花的開發(fā)和利用卻以日本最為成功，而我國對櫻花的研究尚處于起步階段，很多野生資源還未得到充分的開發(fā)和利用，缺乏自主品種培育。目前國內觀賞類櫻花大多從日本引種，但適應性不強，壽命短，而且還容易感染病蟲害，因此亟需培育出適應性和抗性較強的自主櫻花品種。

目前各類分子標記已廣泛應用于李屬植物相關研究。如張俊衛(wèi)等利用RAPD分子生物學技術來分析桃、李、杏、梅、櫻花類植物分類，其研究結果支持將它們分成不同的屬；蔡宇良利用RAPD分子技術分別對我國野生櫻桃居群和歐洲櫻桃品種進行了遺傳多樣性分析和DNA指紋鑒定；周春玲等利用RAPD技術對19個櫻花品種進行了品種分類和親緣關系鑒定；Downey等用甜櫻桃和酸櫻桃的引物對66個黑櫻桃基因型作指紋分析；Cantini等用桃、甜櫻桃和酸櫻桃的10對SSR引物繪制了59份四倍體酸櫻桃種質資源指紋圖譜；張琪靜等利用SSR分子技術對相關櫻桃品種進行了遺傳多樣性分析，并開發(fā)了甜櫻桃的指紋檢索系統(tǒng)；李苗苗利用cpSSR與ISSR分子標記技術分別對我國櫻屬植物和中國櫻桃進行了地理親緣關系以及遺傳結構和多樣性的研究；2013年南京林業(yè)大學張瓊碩士撰寫的碩士論文《櫻屬觀賞品種資源調查及部分種與品種SSR分析》對我國的部分櫻屬植物和櫻花品種進行了相關分子研究，探討了彼此間的親緣關系。

其中SSR分子標記具有多態(tài)性高、重復性好、共顯性遺傳、技術簡單和特異性強等優(yōu)點，已應用于物種鑒定、物種分類系統(tǒng)比較以及作為構建遺傳圖譜的重要工具，此外還作為一種重要的輔助育種手段。EST–SSR標記是編碼序列的一部分，能夠作為某些性狀或者基因的直接標記，隨著EST數據庫的不斷豐富，利用EST序列開發(fā)SSR標記已成為一種簡便而有效的方法。本發(fā)明以部分中國野生櫻花為試驗材料，利用NCBI中豐富的櫻屬植物EST序列，設計EST–SSR引物用于我國野生櫻屬植物指紋圖譜的構建，以利于我國櫻屬植物的物種分類、資源保護以及雜交全本的選擇等。

技術實現要素：

為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案為：4對EST–SSR引物，其序列如下所示(序列表SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列)：

PC1：F:CACACACACCTTCTCTCTCCTG

R:GTTGTTATTGGTCTTGCTGCTG

PC10：F:GGCACAAAAGAGAGGAACTTGT

R:AGGGTTACAGCCTCAATACCAA

PC12：F:ATATGGGCTGCGTTTATATTGG

R:GATTGCACATGCCTTTGTCTTA

PC17：F:AATTTGCAGAGATGGCTTCC

R:CTTCTCCTTGGCTTCTTTTGTC

本發(fā)明還提供一種上述4對引物的開發(fā)方法，包括如下步驟：

(1)基因組DNA提取

由于櫻屬植物葉片中多糖、多酚含量較多，傳統(tǒng)方法難以提取高質量的基因組DNA，采用植物/真菌基因組DNA小量提取試劑盒(上海萊楓生物科技有限公司)按照其說明書進行櫻屬植物DNA的提取，提取完成后利用Bio-Photometr核酸檢測儀檢測DNA的濃度和純度，之后再依據所得的DNA濃度，用預熱的TE溶液將DNA樣品溶液稀釋成50ng·μL^-1作為DNA模板，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

(2)序列來源

登錄NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)，在搜索欄中輸入Cerasus(櫻屬)，搜索EST序列，隨機選擇其中部分EST序列進行后續(xù)的SSR位點查找及其引物設計；

(3)SSR位點查找

在線搜索軟件SSRIT(Simple sequence repeat identification tool)對選擇的EST序列進行SSR位點搜索(http://www.gramene.org/db/searches/ssrtool)，搜索標準為：二、三、四、五和六核苷酸的最小重復次數分別為10、6、5、4、3次，EST序列長度大于100bp，SSR起始點位置距離5'和3'應不小于20bp；

(4)SSR引物設計

用Primer5.0和Oligo7軟件進行引物設計和評價，設計引物時設置的主要參數為：GC含量40％～70％，退火溫度50～62℃，引物長18～24bp，上下游引物Tm值之差應在1℃范圍之內，預期擴增產物長度100～500bp；共設計出合格的SSR引物有20對，引物命名為PC加序號，如PC1；

(5)EST-SSR引物初步篩選

將20對通過評估的EST-SSR引物交由上海桑尼生物科技有限公司合成。引物最適復性溫度的篩選于Eppendorf公司生產的Mastercycler普通梯度PCR儀上進行；PCR反應體系為20μL，其中包括：10μL的2×TaqPCRMasterMix(含有Taq酶、dNTP和優(yōu)化的反應緩沖液)，0.4μL的模板DNA，0.8μL的引物對(5μmol·μL^-1)×2，8μL的ddH₂O；反應程序為94℃預變性5min，然后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性30s，復性(48-64℃)30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸10min，4℃保存；隨機選擇8種野生櫻屬植物用于引物以及最適退火溫度的篩選，各引物對的最適退火溫度通過梯度PCR試驗確定；最終通過瓊脂糖凝膠電泳篩選出有目標條帶的引物16對；

(6)EST-SSR引物進一步篩選

(6.1)PCR擴增

在最適退火溫度下，對櫻屬植物材料進行PCR擴增，2×TaqPCRMasterMix購自天根生物公司，PCR反應體系為20μL，其中包括：10μL的2×TaqPCRMasterMix(含有Taq酶、dNTP和優(yōu)化的反應緩沖液)，0.4μL的模板DNA(50ng·μL^-1)，0.8μL的引物對(5μmol·μL^-1)×2，8μL的ddH₂O；反應程序為94℃預變性5min，然后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性30s，復性(48-64℃)30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸7min，4℃保存；

(6.2)聚丙烯酰氨凝膠電泳

步驟(6.1)的擴增產物采用6％的聚丙烯酰胺凝膠(60mL的ddH₂O中含有27g尿素、6mL 10×TBE、6.75mL40％丙烯酰胺、60μL TEMED和60μL 25％APS)進行電泳，銀染(1/‰)，膠干后利用數碼相機進行拍照、保存；最終從16對引物中選擇出多態(tài)性高、普帶清晰的引物4對。

本發(fā)明還涉及一種上述4對EST-SSR引物在櫻屬植物指紋譜圖構建中的應用。

本發(fā)明的有益效果和優(yōu)點：

1.在分子標記技術中，SSR分子標記與RAPD等其他分子標記相比，具有多態(tài)性高、重復性好、共顯性遺傳、技術簡單和特異性強等優(yōu)點，其中EST–SSR標記是編碼序列的一部分，能夠作為某些性狀或者基因的直接標記，EST-SSR擴增結果比gSSR更穩(wěn)定，能降低條帶判讀的難度，同時也更能反映出個體或群體的遺傳變異；

2.本發(fā)明的4對EST-SSR引物可以快速、準確地將中國野生櫻屬植物區(qū)分開來，并正確反映其間的親緣關系，可用于我國野生櫻屬植物的遺傳多樣性分析、種質鑒定、物種鑒別與保護等方面。

附圖說明

圖1 PC1、PC10、PC12和PC17等4對核心引物在24份供試材料中的擴增；

圖2基于SSR擴增結果構建的24份供試材料的UPGMA聚類圖。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明不僅僅局限于以下實施例。實施例

試驗材料

采集野生櫻屬植物原種(變種)30余種，本試驗選取其中24個原種(變種)用于EST–SSR引物的篩選，如下表所示：

試驗步驟

(1)基因組DNA提取

由于櫻屬植物葉片中多糖、多酚含量較多，傳統(tǒng)方法難以提取高質量的基因組DNA，采用植物/真菌基因組DNA小量提取試劑盒(上海萊楓生物科技有限公司)進行櫻屬植物DNA的提取，具體步驟見說明書，提取完成后利用Bio-Photometr核酸檢測儀檢測DNA的濃度和純度，之后再依據所得的DNA濃度，用預熱的TE溶液將DNA樣品溶液稀釋成50ng·uL^-1。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)序列來源

登錄NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)，在搜索欄中輸入Cerasus(櫻屬)，得到111850條EST序列(截止到2015年9月15日)，隨機選擇其中部分EST序列進行后續(xù)的SSR位點查找及其引物設計；

(3)SSR位點查找

在線搜索軟件SSRIT(Simple sequence repeat identification tool)對該部分EST序列進行SSR位點搜索(http://www.gramene.org/db/searches/ssrtool)，搜索標準為：二、三、四、五和六核苷酸的最小重復次數分別為10、6、5、4、3次，EST序列長度大于100bp，SSR起始點位置距離5'和3'應不小于20bp；

(4)SSR引物設計

用Primer5.0和Oligo7軟件進行引物設計和評價，設計引物時設置的主要參數為：GC含量40％～70％，退火溫度50～62℃，引物長18～24bp，上下游引物Tm值之差應在1℃范圍之內，預期擴增產物長度100～500bp；共設計出合格的SSR引物有20對，引物命名為PC加序號，如PC1；

(5)EST-SSR引物篩選

將20對通過評估的EST-SSR引物交由上海桑尼生物科技有限公司合成。引物最適復性溫度的篩選于Eppendorf公司生產的Mastercycler普通梯度PCR儀上進行；PCR反應體系為20μL，其中包括：10μL的2×TaqPCRMasterMix(含有Taq酶、dNTP和優(yōu)化的反應緩沖液)，0.4μL的模板DNA(即步驟(1)獲得用TE稀釋成50ng·μL^-1的DNA樣品溶液)，0.8μL的引物對(5μmol·μL^-1)×2，8μL的ddH2O；反應程序為94℃預變性5min，然后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性30s，復性(48-64℃)30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸10min，4℃保存；隨機選擇8種野生櫻屬植物用于引物以及最適退火溫度的篩選，各引物對的最適退火溫度通過梯度PCR試驗確定；最終通過瓊脂糖凝膠電泳篩選出有目標條帶的引物16對；

(6)EST-SSR引物進一步篩選

(6.1)PCR擴增

在最適退火溫度下，對24份櫻屬植物材料進行PCR擴增，2×TaqPCRMasterMix購自天根生物公司，PCR反應體系為20μL，其中包括：10μL的2×TaqPCRMasterMix(含有Taq酶、dNTP和優(yōu)化的反應緩沖液)，0.4μL的模板DNA(50ng·μL^-1)，0.8μL的引物對(5μmol·μL^-1)×2，8μL的ddH2O。反應程序為94℃預變性5min，然后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性30s，復性(48—64℃)30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸7min，4℃保存；

(6.2)聚丙烯酰氨凝膠電泳

步驟(6.1)的擴增產物采用6％的聚丙烯酰胺凝膠(60mL的ddH₂O中含有27g尿素、6mL 10×TBE、6.75mL40％丙烯酰胺、60μL TEMED和60μL 25％APS)進行電泳，銀染(1/‰)，膠干后利用數碼相機進行拍照、保存。具體步驟如下：

[1]制備6％聚丙烯酰胺變性凝膠；

[2]灌膠：輕輕灌凝膠液，防止出現氣泡；聚合時間lh以上；

[3]預電泳：恒功率預電泳30min，溫度達到43℃左右；

[4]樣品變性：20μL PCR樣品加入8μL 3×LoadingBuffer[98％甲酰胺，0.5MEDTA(pH8.0)，0.25％溴酚藍，0.25％二甲苯青]，混勻后，在95℃變性5min，立即放至冰上10min以上；

[5]加樣和電泳：吸打加樣槽，清除殘膠、尿素和氣泡，每一個加樣孔點入5μL樣品；40W恒功率電泳約1.0～2.0h；電泳結束后，小心分開兩塊玻璃板；

[6]銀染程序：

固定：將凝膠板置于lL乙酸溶液(10％)中，輕輕搖蕩5-6min。

漂洗：用1.5L雙蒸水漂洗2-3min。

染色：在1.5L新配的染色液中(l.5g硝酸銀)，輕輕搖蕩15min。

漂洗：用1.5L雙蒸水漂洗，時間不超過10秒。

顯影：在1.5L顯影液中(顯影液含氫氧化鈉22.5g，37％甲醛12mL)輕輕搖蕩，直至出現帶紋。

定影：在1.5L10％乙酸溶液中定影2-3min。

漂洗：用1.5L雙蒸水漂洗2-3min。

干膠：室溫下自然晾干。

最終從16對引物中選擇出多態(tài)性高、普帶清晰的引物4對，其核苷酸序列如下所示：

PC1：F:CACACACACCTTCTCTCTCCTG

R:GTTGTTATTGGTCTTGCTGCTG

PC10：F:GGCACAAAAGAGAGGAACTTGT

R:AGGGTTACAGCCTCAATACCAA

PC12：F:ATATGGGCTGCGTTTATATTGG

R:GATTGCACATGCCTTTGTCTTA

PC17：F:AATTTGCAGAGATGGCTTCC

R:CTTCTCCTTGGCTTCTTTTGTC

(7)聚類分析

根據SSR擴增結果(圖1)，利用NTSYSpc2.10e軟件進行Jaccard相似性系數分析，計算出它們之間的遺傳相似系數，再由遺傳相似系數，進行UPGMA聚類分析，構建了24份櫻屬植物的遺傳關系圖(圖2)，由圖2可知，該4對EST-SSR引物(PC1、PC10、PC12和PC17)基本可將24份中國野生櫻屬植物區(qū)分開來，也基本能夠正確反映絕大部分材料之間的親緣關系，因此該4對引物可作為中國野生櫻屬植物的核心EST-SSR引物組合予以使用(可適當結合前人的一些gSSR引物，二者搭配使用，效果更好)，可用于我國野生櫻屬植物的遺傳多樣性分析、種質鑒定、物種鑒別與保護等方面。

以上所述，僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明的核心技術的前提下，還可以做出改進和潤飾，這些改進和潤飾也應屬于本發(fā)明的專利保護范圍。與本發(fā)明的權利要求書相當的含義和范圍內的任何改變，都應認為是包括在權利要求書的范圍內。

SEQUENCE LISTING

<110> 寧波城市職業(yè)技術學院

<120> 4對EST-SSR引物和制備方法及其在櫻屬植物指紋圖譜構建中的應用

<130> 2016

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cacacacacc ttctctctcc tg 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gttgttattg gtcttgctgc tg 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggcacaaaag agaggaactt gt 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agggttacag cctcaatacc aa 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atatgggctg cgtttatatt gg 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gattgcacat gcctttgtct ta 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aatttgcaga gatggcttcc 20

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cttctccttg gcttcttttg tc 22