本發(fā)明屬于核酸提取純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種無需轉(zhuǎn)管的DNA提取方法。

背景技術(shù)：

DNA是遺傳信息的載體，對于真核生物而言，核基因組DNA位于細胞核內(nèi)，要獲得純化的DNA，首先需要裂解細胞膜、核膜等結(jié)構(gòu)，使DNA被釋放出來，然后去除細胞碎片、蛋白質(zhì)、脂類、糖類等雜質(zhì)，使DNA純化；如果需要從拭子、糞便、泥土等樣品中提取DNA，還要考慮去除拭子、糞便、泥土等雜質(zhì)；目前，可供選擇的DNA提取方法包括苯酚-氯仿抽提法、磁珠法、硅膠膜法、硅珠法等。

苯酚-氯仿抽提法的原理是，通過裂解液裂解細胞，利用有機溶劑使蛋白質(zhì)變性與DNA分離，高速離心后，密度較大的有機相與變性的蛋白質(zhì)、細胞碎片等位于下層，DNA溶于水相位于上層；將上層水相轉(zhuǎn)移到新的容器中后，用異丙醇或乙醇將DNA沉淀濃縮，最后用水將DNA溶解，獲得純化的DNA。

磁珠法、硅珠法、硅膠膜法原理是，通過裂解液裂解細胞，利用裂解液裂解細胞，離心分離拭子、糞便、泥土等雜質(zhì)和細胞碎片，上清液中只有DNA、蛋白質(zhì)、脂類、糖類等可溶性成分；將上清液轉(zhuǎn)移后，向其中加入高濃度離液鹽和異丙醇或乙醇，利用磁珠、硅珠、硅膜表面的硅烷醇在高鹽條件下結(jié)合DNA的特性，使DNA與其它可溶性雜質(zhì)分離；然后用乙醇漂洗磁珠、硅珠、硅膠膜表面殘留的離液鹽，待乙醇揮發(fā)之后，利用硅烷醇在低鹽條件下不結(jié)合DNA的特性，用水或TE緩沖液將純化的DNA洗脫出來。

上述DNA提取方法都需要將含有DNA的溶液在不同容器轉(zhuǎn)移，由于移液器吸頭、離心管管壁等粘附的溶液中含有DNA，這必然會造成部分DNA的損失，另外，轉(zhuǎn)移操作還有一定風(fēng)險造成不同樣品間的交叉污染；本發(fā)明涉及的一種無需轉(zhuǎn)管的DNA提取方法和試劑，可以避免DNA提取操作過程中的轉(zhuǎn)管操作。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明為解決上述存在的問題，提供了一種無需轉(zhuǎn)管的DNA提取方法，其解決技術(shù)問題的技術(shù)方案是：

一種無需轉(zhuǎn)管的DNA提取方法，包含如下步驟：

1）試劑準(zhǔn)備

配制裂解液、漂洗液、洗脫液，準(zhǔn)備好組合管；

所述裂解液，其組成成分包括表面活性劑、離液鹽、pH緩沖劑；

所述表面活性劑為：十二烷基硫酸鈉、十二烷基磺酸鈉、月桂酰基肌氨酸鈉、聚乙二醇辛基苯基醚、TWEEN 20、TWEEN 40、TWEEN 60、TWEEN 80、NP 40、十六烷基三甲基溴化銨中的一種或兩種及以上的混合，所述表面活性劑的濃度為0.1% m/v -10%m/v；

所述離液鹽為異硫氰酸胍、鹽酸胍、硫氰酸鉀、高氯酸鈉、碘化鉀、碘化鈉中的一種或兩種及以上的混合，所述離液鹽的濃度為3mol/l -5mol/l；

所述pH緩沖劑為Tris-HCl、Tris-醋酸、NaH2PO4-Na2HPO4、KH2PO4-K2HPO4、醋酸-醋酸鈉、檸檬酸-檸檬酸鈉，所述pH緩沖劑的pH值為4.5-9.0；

所述漂洗液為80%乙醇；

所述洗脫液，其組分為：10 mmol/l Tris-HCl，0.1 mmol/l EDTA-2Na，pH 8.0；

所述組合管，包含三層套管的結(jié)構(gòu)，所述三層套管的結(jié)構(gòu)，包含內(nèi)層裂解管、中層DNA吸附管、外層收集管和蓋子；所述裂解管為中空結(jié)構(gòu)，頂部為裂解管管口，底部有收口，收口臺階上有疏水性過濾材料；所述吸附管為中空結(jié)構(gòu)，頂部為吸附管管口，底部有收口，收口臺階上設(shè)有兩層材料，上層為核酸吸附膜，下層為疏水性過濾材料；所述收集管頂部有收集管管口；所述蓋子可分別蓋在裂解管管口、吸附管管口、收集管管口上；蓋子邊緣有柔性長柄和收集管管口邊緣連接，防止蓋子掉落；

2）DNA提取

樣品放入組合管內(nèi)層裂解管中，加入裂解液和蛋白酶K后50-100℃裂解，離心，內(nèi)層裂解管中的液體在穿過中層DNA吸附管內(nèi)的核酸吸附膜時，被核酸吸附膜結(jié)合，分離并獲得純化的DNA；具體包括以下步驟：

a.將樣品放入組合管裂解管中，加入400-500 μl裂解液和15-25 μl蛋白酶K，渦旋振蕩混勻，50℃-100℃加熱10-20分鐘；

b.12000 rpm離心1-2分鐘，丟棄裂解管，倒棄收集管中的液體，吸附管放回收集管，向吸附管內(nèi)加入400-500 μl漂洗液，12000 rpm離心0.5-1.0分鐘；

c.倒棄收集管的液體，吸附管放回收集管內(nèi)，向吸附管內(nèi)加入400 -500μl漂洗液，12000 rpm離心0.5-1.0分鐘；

d.丟棄收集管，吸附管放入一根新的收集管，打開蓋子，70℃加熱3-4分鐘；

e.向吸附管內(nèi)加入30 μl洗脫液，蓋上蓋子，70℃加熱3-4分鐘，12000 rpm離心1-1.5分鐘，丟棄吸附管，收集管內(nèi)的液體即DNA溶液；

3）PCR擴增及電泳

將上步純化的DNA進行PCR擴增，在電泳儀中檢測DNA。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明的一種無需轉(zhuǎn)管的DNA提取方法，配制好裂解液、漂洗液、洗脫液，利用包含內(nèi)層裂解管、中層DNA吸附管、外層收集管的組合管結(jié)構(gòu)，DNA在裂解管內(nèi)裂解，裂解完成后，通過離心，裂解管底部的篩板或濾膜使固體雜質(zhì)與可溶性成分分離，吸附管底部的核酸吸附膜使DNA與可溶性雜質(zhì)分離，實現(xiàn)在同一裝置內(nèi)，一次性分離純化DNA；與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明技術(shù)無需轉(zhuǎn)管，簡化了DNA提取操作步驟，避免了轉(zhuǎn)管操作過程可能帶來的DNA損失和交叉污染的風(fēng)險。

附圖說明

圖1是本發(fā)明中組合管的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖中：1.裂解管，2.吸附管，3.收集管，4.核酸吸附膜，5.過濾器，6.收集管管口，7.吸附管管口，8.裂解管管口，9.蓋子。

圖2是本發(fā)明實施例1中提取的DNA的復(fù)合STR擴增圖譜。

圖3是本發(fā)明實施例2中提取的DNA的復(fù)合STR擴增圖譜。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明的附圖，對本發(fā)明的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述。

實施例1 針對總量500 pg DNA微量樣品的提取

1）試劑準(zhǔn)備

a.裂解液：其組分為5 mol/l 鹽酸胍，2%月桂?；“彼徕c（m/v)，5% Tween 20，100 mmol/l Tris-HCl，100 mmol/l 檸檬酸鈉，pH 7；

b.漂洗液：其組分為80%乙醇；

c.洗脫液：其組分為10 mmol/l Tris-HCl，0.1 mmol/l EDTA-2Na，pH 8.0；

d.組合管一套。

2）DNA提取

a.取一根無菌、無DNA污染的棉拭子，向棉拭子上滴加0.5μl Identifiler Plus PCR試劑盒9947A陽性對照DNA（1ng/μl），試劑盒由Appplied Biosystems公司提供；折斷拭子頭，放入組合管裂解管（1）中，加入400 μl裂解液，15 μl蛋白酶K，渦旋振蕩混勻，50℃加熱10分鐘；

b.12000 rpm離心1分鐘，丟棄裂解管（1），倒棄收集管（3）中的液體，吸附管（2）放回收集管（3），向吸附管（2）內(nèi)加入400 μl漂洗液，12000 rpm離心0.5分鐘；

c.倒棄收集管（3）的液體，吸附管（2）放回收集管（3）內(nèi)，向吸附管（2）內(nèi)加入400 μl漂洗液，12000 rpm離心0.5分鐘；

d.丟棄收集管（3），吸附管（2）放入一根新的收集管（3），打開蓋子，70℃加熱3分鐘；

e.向吸附管（2）內(nèi)加入30 μl洗脫液，蓋上蓋子，70℃加熱3分鐘，12000 rpm離心1分鐘，丟棄吸附管（2），收集管（3）內(nèi)的液體即DNA溶液。

3）PCR擴增及電泳

PCR擴增使用Identifiler Plus試劑盒，由Applied Biosystems公司提供，10 μl擴增體系中含4 μl master mix、2 μl primer set、4 μl模板，擴增程序如下：

a.將擴增體系在95℃下恒溫11分鐘；

b.開始30個循環(huán)反應(yīng)，每個循環(huán)反應(yīng)條件為：在94℃下20秒，59℃下3分鐘，60℃下10分鐘，反復(fù)30次；

c.30個循環(huán)反應(yīng)后，放置4℃環(huán)境下，保存待用。

電泳在ABI 3500XL儀器中進行；電泳上樣體系為，1 μl PCR產(chǎn)物，9 μl甲酰胺，其中已加Liz。

圖2是本實施例1中提取的DNA的復(fù)合STR擴增圖譜，為粘有500 pg DNA拭子檢測結(jié)果，16個基因座等位基因完整，峰高均在300以上，符合法醫(yī)案件檢測數(shù)據(jù)要求；證明本發(fā)明方法和試劑，能有效針對微量檢材中的DNA進行提取。

實施例2 針對指紋脫落細胞的DNA提取

1）指紋樣品的制作及采集：食指在干凈玻璃窗戶上按壓5秒，濕的棉簽搽拭指紋，用于DNA提取。

2）DNA提取

a.將上述1）中樣品放入組合管裂解管（1）中，加入500 μl裂解液， 25 μl蛋白酶K，渦旋振蕩混勻，100℃加熱20分鐘；

b.12000 rpm離心2分鐘，丟棄裂解管（1），倒棄收集管（3）中的液體，吸附管（2）放回收集管（3），向吸附管（2）內(nèi)加入500 μl漂洗液，12000 rpm離心1.0分鐘；

c.倒棄收集管（3）的液體，吸附管（2）放回收集管（3）內(nèi)，向吸附管（2）內(nèi)加入500μl漂洗液，12000 rpm離心1.0分鐘；

d.丟棄收集管（3），吸附管（2）放入一根新的收集管（3），打開蓋子，70℃加熱4分鐘；

e.向吸附管（2）內(nèi)加入30 μl洗脫液，蓋上蓋子，70℃加熱4分鐘，12000 rpm離心1.5分鐘，丟棄吸附管（2），收集管（3）內(nèi)的液體即DNA溶液；

3）PCR擴增及電泳

PCR擴增采用PowerPlex 21試劑盒，由Promega公司提供，10 μl PCR體系中包含，2 μl master mix、2 μl primer set、6 μl模板，擴增程序如下：

a.將擴增體系在96℃下恒溫1分鐘；

b.開始30個循環(huán)反應(yīng)，每個循環(huán)反應(yīng)條件依次為：在94℃下10秒，59℃下1分鐘，72℃下30秒；60℃下10分鐘，反復(fù)30次；

c.30個循環(huán)反應(yīng)后，放置4℃環(huán)境下，保存待用。

電泳參照實施例1中進行，圖3是本實施例2中提取的DNA的復(fù)合STR擴增圖譜，為指紋脫落細胞 DNA檢測結(jié)果，21個基因座等位基因完整，峰高均在1000以上，符合法醫(yī)案件檢測數(shù)據(jù)要求；證明本發(fā)明方法和試劑，能有效針對微量檢材中的DNA進行提取。

以上所述僅為本發(fā)明的具體實施方式而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化；凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。