本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種啟動子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：當前，世界性能源短缺和環(huán)境污染已經(jīng)成為人類社會所面臨的巨大挑戰(zhàn)，因此，尋找一種替代化石能源的新型可再生清潔能源，已成為世界各國的共識。生物柴油(biodiesel)，其性能跟石化柴油基本相當，且具有良好環(huán)保性和生物降解性，已成為國際上應(yīng)用最廣、發(fā)展最快的理想可再生能源。目前，生物柴油是指來自生物體的油脂(主要為甘油三酯)與醇類(甲醇或乙醇)經(jīng)酯交換作用而形成單烷基脂肪酸酯。微藻制生物柴油的原理是利用微藻油脂合成相關(guān)基因的高效表達，提升油脂含量，，然后利用物理或化學(xué)方法把微藻細胞內(nèi)的油脂轉(zhuǎn)化到細胞外，再進行提煉加工，從而生產(chǎn)出生物柴油。微藻是光合自養(yǎng)型的低等水生植物，其種類繁多，分布極其廣泛。其具有光合作用效率高，生長快速，生物量大等特點。而且油脂含量較客觀，已成為制備生物柴油的優(yōu)質(zhì)天然原料，是未來生物柴油發(fā)展的研究熱點。目前，微藻生物柴油的生產(chǎn)能耗和高昂成本是阻礙其產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵問題。海洋硅藻富含油脂，一般占細胞干重的40％-60％，且短鏈脂肪酸(c14與c16)占總脂肪酸的67％-70％左右。2008年，海洋硅藻三角褐指藻基因組已測完，是硅藻生物學(xué)研究的模式藻。其油脂含量一般在20％-30％左右，是制備生物柴油的優(yōu)質(zhì)原料。通過基因工程技術(shù)手段構(gòu)建出高油脂含量的工程微藻有望提高生物柴油的產(chǎn)率。目前，通過基因工程手段獲得的高產(chǎn)油三角褐指藻，大多數(shù)都是過表達某個脂質(zhì)相關(guān)的關(guān)鍵基因得到的。然而，這種方法獲得的工程微藻藻株的產(chǎn)油效果是有限的。當前，在三角褐指藻產(chǎn)油的研究中，廣泛應(yīng)用的啟動子只有一種，這大大阻礙了微藻基因工程的發(fā)展。啟動子是一段位于基因5'端上游區(qū)的dna序列，能活化rna聚合酶，使之與模板dna準確地相結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。啟動子一般由啟動子核心元件和上游元件組成。位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游-20～-30bp處的tatabox為啟動子核心元件，是富含有at的保守序列區(qū)，與dna(脫氧核糖核酸)雙鏈的解鏈有關(guān)，并決定轉(zhuǎn)錄起始點的選擇，是絕大多數(shù)植物啟動子正確表達所必需的。tatabox上游的保守序列稱為啟動子上游元件，包括上游-75bp處的caatbox和-80--110bp附近的gcbox等一般上游啟動子元件及其他特殊的上游元件。大量文獻表明啟動子元件的種類、數(shù)量以及彼此間胡順序與距離都可能影響基因的轉(zhuǎn)錄與否或轉(zhuǎn)錄程度，不同基因其啟動子的長度各有不同，所含有胡元件也各有不同，因此，啟動子的長度與其啟動基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)。目前，通過基因工程獲得的高產(chǎn)油工程微藻藻株一般都是使用三角褐指藻內(nèi)源型啟動子fcp(fucoxanthin，chlorophylla/c-bindingprotein，墨角藻葉綠素a/c結(jié)合蛋白)基因簇，此啟動子已實現(xiàn)多個報告基因與目的基因的穩(wěn)定表達。然而，若想同時表達多個脂質(zhì)關(guān)鍵基因，只有一個啟動子是不夠的，在動物中，同時過表達多個基因的技術(shù)已經(jīng)相當成熟。只要有不同的啟動子，就能同時過表達不同的基因。但是，在三角褐指藻中只有少數(shù)啟動子被證實并廣泛應(yīng)用。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供一種啟動子及其應(yīng)用。該啟動子能夠啟動下游基因在三角褐指藻的細胞生長周期內(nèi)高效表達。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種啟動子，包括基本組成元件、特有元件和誘導(dǎo)元件；所述特有元件選自3-af3bindingsite、box4、box-w1、p-box、tc-richrepeats、wbox；所述基本組成元件選自tata-box或caat-box；所述誘導(dǎo)元件選自光誘導(dǎo)順式作用元件、光誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄元件、熱誘導(dǎo)元件、硫反應(yīng)核心元件或質(zhì)體patpb基因啟動子核心元件。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述啟動子中所述光誘導(dǎo)順式作用元件為-10promoterelement；所述光誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄元件選自t-box或gt-1box；所述熱誘導(dǎo)元件為ccaatbox；所述硫反應(yīng)核心元件為sure；所述質(zhì)體patpb基因啟動子核心元件為boxii。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述啟動子具有(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)所示的核苷酸序列中任意一個：(ⅰ)如seqidno:1所示；(ⅱ)與如seqidno:1所示序列具有至少70％同源性的序列；(ⅲ)如seqidno:1所示序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個或幾個核苷酸獲得的核苷酸序列。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述啟動子中所述取代為取代1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37或38個核苷酸。本發(fā)明還提供了所述啟動子在啟動下游基因在微藻生長周期內(nèi)高效表達中的應(yīng)用。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述微藻為三角褐指藻；所述下游基因為三角褐指預(yù)測蛋白基因pt48882。本發(fā)明的三角褐指藻預(yù)測蛋白基因pt48882，在genbank的基因組編號為phatrdraft_48882，本發(fā)明克隆該基因的預(yù)測編碼區(qū)的上游區(qū)域，命名為啟動子ppt48882。其在微藻的生長周期內(nèi)均可高效啟動報告基因的轉(zhuǎn)錄表達。本發(fā)明的三角褐指藻預(yù)測蛋白基因pt48882高表達啟動子位于三角褐指藻19號染色體上，全長1103bp，在染色體上位置是：568482--569585。本發(fā)明還提供了一種表達載體，含有本發(fā)明提供的所述啟動子。作為優(yōu)選，所述表達載體還包括報告基因gus。把此啟動子與報告基因gus連接，構(gòu)建到帶有抗性基因(博來霉素)的質(zhì)粒中，通過電擊等方法，把重組質(zhì)粒整合到三角褐指藻的基因組中，只需驗證gus的表達即能驗證啟動子的啟動效率。作為優(yōu)選，所述表達載體依次包括ori、ppt48882、gus、tfcpa、pnr、ble和tnr。本發(fā)明還提供了一種宿主細胞，含有所述表達載體。作為優(yōu)選，所述宿主細胞為微藻。優(yōu)選的，所述宿主細胞為硅藻。更優(yōu)選的，所述宿主細胞為三角褐指藻。本發(fā)明還提供了所述宿主細胞的制備方法，包括如下步驟：步驟1：獲得具有(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)所示的核苷酸序列中任意一個的啟動子：(ⅰ)如seqidno:1所示；(ⅱ)與如seqidno:1所示序列具有至少70％同源性的序列；(ⅲ)如seqidno:1所示序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個或幾個核苷酸獲得的核苷酸序列；步驟2：將步驟1獲得的所述dna分子與表達載體融合，構(gòu)建重組表達載體，轉(zhuǎn)化宿主細胞。本發(fā)明還提供了所述宿主細胞在提高微藻內(nèi)目的產(chǎn)物的產(chǎn)量中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了所述宿主細胞在生產(chǎn)生物柴油中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)生物柴油的方法，利用本發(fā)明提供的宿主細胞的油脂合成相關(guān)基因的高效表達，提升油脂含量，用于生產(chǎn)生物柴油。具體的，本發(fā)明還提供了所述宿主細胞的制備方法，包括如下步驟：步驟1：獲得具有(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)所示的核苷酸序列中任意一個的啟動子：(ⅰ)如seqidno:1所示；(ⅱ)與如seqidno:1所示序列具有至少70％同源性的序列；(ⅲ)如seqidno:1所示序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個或幾個核苷酸獲得的核苷酸序列；步驟2：將步驟1獲得的所述dna分子與表達載體融合，構(gòu)建重組表達載體，轉(zhuǎn)化宿主細胞；步驟3：利用含重組表達載體的宿主細胞的油脂合成相關(guān)基因的高效表達，提升油脂含量，用于生產(chǎn)生物柴油。本研究發(fā)現(xiàn)的啟動子序列沒有任何文獻報道過，在genbank等公開數(shù)據(jù)庫也沒有任何注釋是啟動子及何種特征的啟動子。本發(fā)明為首次發(fā)現(xiàn)并鑒定該啟動子的功能、啟動效率。本發(fā)明從三角褐指藻中克隆出基因pt48882的啟動子：三角褐指藻預(yù)測蛋白基因的ppt48882啟動子，該啟動子能夠啟動下游基因在三角褐指藻的細胞生長周期內(nèi)能高效表達，將其應(yīng)用于基因工程中，獲得的工程微藻藻株能夠顯著提高生物量。尤其是提高生物柴油的產(chǎn)率，顯著節(jié)約生產(chǎn)成本。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。圖1示重組載體圖譜；圖2示pcr驗證結(jié)果，其中，tc是轉(zhuǎn)化藻，wt是野生藻；圖3示轉(zhuǎn)化藻gus染色圖，其中，1是對照藻，2是轉(zhuǎn)化藻；圖4示三角褐指藻染色后細胞形態(tài)圖，其中，a是野生藻，b是轉(zhuǎn)化藻；圖5示第一、四、八天野生藻和轉(zhuǎn)化藻gus染色效果，其中，第1、3、5為第一、四、八天野生藻，第2、4、6為第一、四、八天正常條件轉(zhuǎn)化藻；圖6示第一天rt-pcr分析結(jié)果；圖7示第四天rt-pcr分析結(jié)果；圖8示第八天rt-pcr分析結(jié)果；圖9示本發(fā)明提供的啟動子。具體實施方式本發(fā)明公開了一種啟動子及其應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明的第一個目的是提供一種三角褐指藻基因pt48882高表達啟動子。所述的三角褐指藻基因pt48882高表達啟動子，其特征在于，其核苷酸序列如seqidno.1所示。本發(fā)明的三角褐指藻基因pt48882，在genbank的基因組編號為phatrdraft_48882，本發(fā)明克隆該基因的預(yù)測編碼區(qū)的上游區(qū)域，命名為啟動子ppt48882。其在微藻的生長周期內(nèi)均可高效啟動報告基因的轉(zhuǎn)錄表達。本發(fā)明的三角褐指藻lhcf15基因高表達啟動子位于三角褐指藻19號染色體上，全長1103bp，在染色體上位置是：568482--569585。通過place(adatabaseofplantcis-actingregulatorydnaelements)和plantcare預(yù)測軟件對該啟動子(1103bp)進行分析，發(fā)現(xiàn)該序列具有啟動子的基本組成元件tata-box、caat-box，且包含多個誘導(dǎo)元件，光誘導(dǎo)順式作用元件：-10promoterelement；光誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄元件：t-box、gt-1box；熱誘導(dǎo)元件：ccaatbox；硫反應(yīng)核心元件：sure；質(zhì)體patpb基因啟動子核心元件：boxii。其中，含有的特有元件選自3-af3bindingsite、box4、box-w1、p-box、tc-richrepeats、wbox。作為優(yōu)選，特有元件及其含有的個數(shù)如下所示：(括號內(nèi)的數(shù)字為本發(fā)明提供的啟動子中含有該特有元件的個數(shù))：3-af3bindingsite(1)、box4(1)、box-w1(1)、p-box(2)、tc-richrepeats(1)、wbox(1)。本專利把此啟動子與報告基因gus連接，構(gòu)建到帶有抗性基因(博來霉素)的質(zhì)粒中，通過電擊等方法，把重組質(zhì)粒整合到三角褐指藻的基因組中，只需驗證gus的表達即能驗證啟動子的啟動效率。目前在轉(zhuǎn)基因植物中廣泛應(yīng)用的gus基因由大腸桿菌e.coli菌株k12中uida(也稱gusa)基因座編碼。該基因編碼的β-葡萄糖苷酸酶，系統(tǒng)命名為β-d-glucuronideglucuronosohydrolase(ec3.2.1.31)。該酶是一種外切水解酶，能催化多種β-d-葡萄糖苷酸類物質(zhì)水解為d-葡萄糖醛酸和糖苷配基。1987年jefferson等克隆了gus基因并進行了測序，由此發(fā)展出用gus基因作為基因融合標記的系統(tǒng)。由于在絕大多數(shù)植物的細胞內(nèi)不存在內(nèi)源的gus活性，而且gus基因表達產(chǎn)物具有檢測方法簡單、靈敏度高、易于定量及定位分析、可以與其他蛋白質(zhì)基因融合等優(yōu)點，使得gus基因成為近年來在植物基因工程研究中應(yīng)用最為廣泛的報道基因之一。目前常用于gus組織化學(xué)定位的酶作用底物是5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖苷酸(5-bromo-4-chloro-3-indolylglucuronide,簡稱x-gluc)。這一底物能夠在酶活性位點形成藍色沉淀物。β-葡萄糖苷酸酶作用于x-gluc的初始產(chǎn)物為無色的吲哚衍生物，經(jīng)過氧化二聚化作用形成不溶解的5,5′-二溴-4,4′-二氯深色的靛藍色物質(zhì)，使得具有g(shù)us活性的部位呈現(xiàn)藍色。本發(fā)明的啟動子ppt48882是三角褐指藻內(nèi)源啟動子，啟動lhcf15的表達，因此，本發(fā)明驗證了在三角褐指藻一個生長繁殖周期的正常條件和熱激后的啟動子效率。分別利用gus染色組織染色法和實時熒光pcr(real-timeqpcr)方法來檢測該啟動子的效率。real-timeqpcr就是在pcr擴增過程中，通過熒光信號，對pcr進程進行實時檢測。由于在pcr擴增的指數(shù)時期，模板的ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。real-timeqpcr由于其操作簡便，靈敏度高，重復(fù)性好等優(yōu)點發(fā)展非常迅速。設(shè)在已經(jīng)涉及到生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域，比如基因的差異表達分析，snp檢測，等位基因的檢測，藥物開發(fā)，臨床診斷，轉(zhuǎn)基因研究等。對rt-pcr產(chǎn)生的結(jié)果，分析時采用2-ct法，即按照如下公式進行計算：1.δct(目的基因ct—內(nèi)參ct)的平均值±標準偏差；2.δδct(待測樣品中目的基因δct—參照樣品中目的基因δct)的平均值±標準偏差；3.相對表達量(2-δδct)的平均值±標準偏差；本發(fā)明的第二個目的是提供一種表達載體，其特征在于，含有上述三角褐指藻lhcf15基因ppt48882高表達啟動子。本發(fā)明的第三個目的是提供一種宿主細胞，其特征在于，含有上述表達載體。所述的宿主細胞優(yōu)選為三角褐指藻。本發(fā)明的第四個目的是提供上述啟動子ppt48882在啟動下游基因在三角褐指藻的細胞生長周期內(nèi)高效表達的應(yīng)用。所述的微藻優(yōu)選為三角褐指藻。所述的下游基因優(yōu)選為三角褐指藻基因pt48882。本研究發(fā)現(xiàn)的啟動子序列沒有任何文獻報道過，在genbank等公開數(shù)據(jù)庫也沒有任何注釋是啟動子及何種特征的啟動子。本發(fā)明為首次發(fā)現(xiàn)并鑒定該啟動子的功能、啟動效率。本發(fā)明從三角褐指藻中克隆出基因pt48882的啟動子：三角褐指藻lhcf15基因ppt48882啟動子，該啟動子能夠啟動下游基因在三角褐指藻的細胞生長的生長周期內(nèi)均能高效表達，因此可將其應(yīng)用于基因工程中在基因工程中有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明提供的一種啟動子及其應(yīng)用中所用原料及試劑均可由市場購得。下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明：實施例1：啟動子和gus基因的克隆首先，提取三角褐指藻的基因組dna，采用magene公司的植物dna提取試劑盒進行。引物由上海生工生物工程有限公司合成，經(jīng)page方法純化，使用時稀釋到100μm。啟動子ppt48882在三角褐指藻dna中克隆，gus基因于通用載體pcambia1301(于上海捷蘭生物技術(shù)有限公司購買)中克隆。其中克隆條件均采用pcr方法，使用kod-plus-neo酶(toyobo，japan)pcr獲得，啟動子ppt48882及gus基因的pcr引物如表1所示，pcr反應(yīng)體系分別如表2和表3所示，三角褐指藻基因pt48882的啟動子沒有確認，本發(fā)明通過多個預(yù)測軟件預(yù)測到ppt48882啟動子的核心元件，并取其中1103bp為啟動子區(qū)域，在此區(qū)域設(shè)計引物。表1.pcr引物表2.pcr反應(yīng)體系(20l)表3.gus基因pcr反應(yīng)體系(20l)反應(yīng)條件為：預(yù)變性：94℃,2min.通過place(adatabaseofplantcis-actingregulatorydnaelements)和plantcare預(yù)測軟件對上述克隆的序列進行分析，發(fā)現(xiàn)該序列具有啟動子的基本組成元件tata-box、caat-box，且包含多個誘導(dǎo)元件，光誘導(dǎo)順式作用元件：-10promoterelement；光誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄元件：t-box、gt-1box；熱誘導(dǎo)元件：ccaatbox；硫反應(yīng)核心元件：sure；質(zhì)體patpb基因啟動子核心元件：boxii。該序列被命名為啟動子ppt48882。實施例2：構(gòu)建重組載體把上述克隆出來的啟動子ppt48882、gus基因以及fcpa終止子(277bp，由上海生工生物有限公司合成)通過采用clonexpressmultisonestepcloning試劑盒(vazymebiotechco.,ltd，nanjing)同源重組的方法連接到含有博來霉素抗性表達盒的載體，含有博來霉素抗性表達盒的載體是由ppt-apcat載體(ppt-apcat載體的構(gòu)建步驟參考niu等，2011)把氯霉素抗性基因通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)基因工程手段替換成博來霉素基因獲得，得到含有啟動子ppt48882和gus基因的重組表達載體(如圖1所示)。采用的試劑盒是諾唯贊生物科技有限公司的onestepcloningkit。實施例3：三角褐指藻轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化藻的篩選參考niu等(2012)的電擊方法把重組載體整合到三角褐指藻基因組中。通過4-5次博來霉素的篩選獲得具有抗性的轉(zhuǎn)化藻。實施例4：轉(zhuǎn)化藻的驗證第一步，在分子水平上驗證，把100ml轉(zhuǎn)化藻和100ml野生型三角褐指藻3000g離心5min收集，用pbs溶液清洗3次后用magene公司的植物dna提取試劑盒提取基因組dna，用gus-f引物(如seqidno.6所示，f:5’atgttacgtcctgtagaaa3’)和gus-r引物(如seqidno.7所示，r:5’tgtttgcctccctgctgcggt3’)進行pcr，結(jié)果如圖2所示，第2列是轉(zhuǎn)化藻，第1列是野生型藻，轉(zhuǎn)化藻在大概1.8kb處有條帶，而野生型藻沒有，可知轉(zhuǎn)化藻中已含有g(shù)us基因。第二步，在表觀上驗證，把100ml轉(zhuǎn)化藻和100ml野生型三角褐指藻3000g離心5min收集，藻沉淀用gus染色試劑盒37℃染色過夜，然后5000g離心棄上清，加入1ml固定液(乙醇：乙酸＝3:1)洗脫30min，結(jié)果如圖3所示，1為對照藻，染色后無顏色變化，2為轉(zhuǎn)化藻，染色后形成藍色沉淀物，由此可知，轉(zhuǎn)化藻均能表達gus基因。第三步，從細胞形態(tài)上觀察。轉(zhuǎn)化藻通過gus染色后，取10μl的藻液置于倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，如圖4所示。a為野生型的藻細胞沒有染上藍色，b為轉(zhuǎn)化藻細胞整個細胞均染成藍色。實施例5：gus染色驗證啟動子效率對轉(zhuǎn)化藻的報告基因gus進行表觀驗證。將野生型藻和轉(zhuǎn)化藻分別放置在新的培養(yǎng)基中且藻密度控制在1x106個/ml，分別取第一天、第四天和第八天的微藻，微藻的數(shù)量控制在2.2x108個。藻沉淀用gus染色試劑盒37℃染色過夜，然后5000g離心棄上清，加入1ml固定液(乙醇：乙酸＝3:1)洗脫30min后拍照。結(jié)果如圖5所示，由圖5可知，第一天轉(zhuǎn)化藻gus染色顯示最接近藍綠色，第四，第八天gus染色為藍色，推測原因是，在三角褐指藻生長周期初期啟動表達的gus基因效率相比后期不高，對數(shù)期和穩(wěn)定期啟動效率最高。實施例6：rt-pcr檢測啟動子效率本發(fā)明對轉(zhuǎn)化藻的報告基因gus進行熒光實時定量分析。野生型藻和轉(zhuǎn)化藻放置新的培養(yǎng)基中且藻密度控制在1x106個/ml，分別取第一天、第四天和第八天的微藻，微藻的數(shù)量控制在3x108個。3000g離心5min，于-80°保存。采用omega公司的植物rna提取試劑盒獲得三角褐指藻的rna，takara公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將rna反轉(zhuǎn)錄成cdna。針對gus基因的特異引物f:5’gccaaaagccagacagagtg3’(如seqidno.8所示，)；r:5’tgacgaccaaagccagtaaag3’(如seqidno.9所示，)，用于實時定量擴增。所用熒光探針sybrqpcrmix購自takara公司，實驗所用的檢測設(shè)備為美國bio-rad公司的cfx96touchtm熒光定量pcr檢測系統(tǒng)。結(jié)果如圖6-8所示。由此可見，該啟動子在三角褐指藻生長周期內(nèi)都能高效啟動目的基因表達，并且均能顯著性提高目的基因表達。實時定量pcr結(jié)果可知，ppt48882啟動子在三角褐指藻生長生長周期內(nèi)均能高效啟動基因的表達。實施例7對照組：beta-tubulin(tub)啟動子；實驗組：本發(fā)明提供的啟動子ppt48882；分別將對照組和實驗組中的啟動子構(gòu)建重組載體，制得轉(zhuǎn)化藻。轉(zhuǎn)化藻放置新的培養(yǎng)基中且藻密度控制在1×106個/ml，分別取第一天、第四天和第八天的微藻，微藻的數(shù)量控制在3×108個。3000g離心5min，于-80℃保存。采用omega公司的植物rna提取試劑盒獲得三角褐指藻的rna，takara公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將rna反轉(zhuǎn)錄成cdna。選用相應(yīng)的引物用于實時定量擴增。所用熒光探針sybrqpcrmix購自takara公司，實驗所用的檢測設(shè)備為美國bio-rad公司的cfx96touchtm熒光定量pcr檢測系統(tǒng)。實時定量pcr結(jié)果見表4。表4實時定量pcr結(jié)果組別對照組實驗組第一天20.12162.80**第四天50.86483.66**第八天300.80753.35**注：與對照組相比，*示p＜0.05，**示p＜0.01.由表4結(jié)果可知，第一天、第四天和第八天時，實驗組的啟動子在三角褐指藻生長周期內(nèi)都能高效啟動目的基因表達，并且均能顯著性提高目的基因表達。實驗組與對照組相比，具有極顯著差異(p＜0.01)。實施例8對照組：beta-tubulin(tub)啟動子；實驗組：本發(fā)明提供的啟動子ppt48882；分別將對照組和實驗組中的啟動子構(gòu)建重組載體，制得轉(zhuǎn)化藻。利用對照組和實驗組制得的微藻油脂合成相關(guān)基因的高效表達，提升油脂含量，，然后利用物理或化學(xué)方法把微藻細胞內(nèi)的油脂轉(zhuǎn)化到細胞外，再進行提煉加工，從而生產(chǎn)出生物柴油。結(jié)果如表5所示。表5生物柴油產(chǎn)量及成本組別對照組實驗組生物柴油的產(chǎn)率(％)10.2024.70*生物柴油相對產(chǎn)量12.86*注：與對照組相比，*示p＜0.05，**示p＜0.01.由表5結(jié)果可知，實驗組的啟動子在三角褐指藻生長周期通過高效啟動目的基因表達，顯著提高的生物柴油的產(chǎn)率，顯著節(jié)約了生產(chǎn)成本。實驗組與對照組相比，均具有顯著差異(p＜0.05)。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。sequencelisting<110>暨南大學(xué)<120>一種啟動子及其應(yīng)用<130>mp1618582<160>9<170>patentinversion3.3<210>1<211>1163<212>dna<213>人工序列<400>1gagtagatcaaacgtaaaggagaaataagagagaatctatttattacgtcttcttgatct60gagtagatcaaacgtaaaggagaaataagagagaatctatttattacgtctctgttgtca120gctagtaatcgtatatttatgtgaccaatttcttgatcttgatgctgcgttccttcgcgt180tcttcggaagtcctcctaacagtgaactccattcacatgtccatgttccctgccttttgt240gagctgtcgtatcgtaggttcgggccacacctatttacaattggcactatctagccgcta300ctagagagaggctttcgctataagcaatctccatagaatcggtatgaatccctttttcga360atcaatgtcataaaatcgtatatttatgtgaccaatttcttgatgttgacaccgcgttcc420tcgcgttctttggatatcctttagaatttcattcacaggtcaatgtccagtgcattttgt480gagctgtcgcaggttcgggttctacttatttacagtattgactagccaaccttgaggctt540tcgctgcgaccgttttacagcaatcagttttgattatgcgcattctccattaatctggta600tgattccctttttagaatcagtgtcattaaatcgtatgttcatgtgaccaatttcttgaa660gttgacaccgcgttccttcgcgttcttcggaaatcctcctgaatccattttcaaccccaa720gttccgtgccttttgtgagctgtcgtaggttcggctttacttatttaaaggaagcaatag780ccagcttaggctttcgctgcgactatttcacggcagtccttatgcttcaattgatctagc840ttgacagctcgacgcaactgtcgctgaatcttgatttacattagctctcaatttcgagtc900attagtgaaggtactggtacatcaatagttaattaagcaaaacaaattcctttgtattct960tactagctttccttcaacacattcgtccccaggatcttctcactggacttattgtcggag1020tctatcaaaaatacctgactgtgaatgacatgactgcgtgcactatattgaagttttcct1080tcaactgggatcctgaaaaagtcacgccaccgtgggaaccatgtatagcctgatttgccc1140aaagccccacagtgaattcgaag1163<210>2<211>47<212>dna<213>人工序列<400>2ctggaaagcgggcagtgagagtagatcaaacgtaaaggagaaataag47<210>3<211>37<212>dna<213>人工序列<400>3ttgttggtaattgttcttcgaattcactgtggggctt37<210>4<211>44<212>dna<213>人工序列<400>4aattacaatccagtggtaccatgttacgtcctgtagaaacccca44<210>5<211>39<212>dna<213>人工序列<400>5cgtccttgtagtccaggtgttgtttgcctccctgctgcg39<210>6<211>19<212>dna<213>人工序列<400>6atgttacgtcctgtagaaa19<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列<400>7tgtttgcctccctgctgcggt21<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8gccaaaagccagacagagtg20<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列<400>9tgacgaccaaagccagtaaag21當前第1頁12