本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及分子標(biāo)記物在制備胰腺癌預(yù)后評估產(chǎn)品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一，在西方國家惡性腫瘤死亡率第四位,全球每年約250萬人死于胰腺癌。我國胰腺癌發(fā)病率逐年上升，近20年增長迅速。胰腺癌的治療主要為手術(shù)、化療和放療相結(jié)合的綜合治療，其五年生存率小于5％。由于胰腺的解剖學(xué)位置較深，腹部疼痛、體重減輕、黃疸等臨床特異性的癥狀不易被發(fā)現(xiàn)，多數(shù)患者確診時已發(fā)生癌癥轉(zhuǎn)移。胰腺癌發(fā)生肝轉(zhuǎn)移較早，早期診斷、根治性手術(shù)切除是胰腺癌患者獲得長期存活的唯一希望，但80％以上的患者就診時已經(jīng)失去了根治性切除的機會。因此，提高胰腺癌的早期診斷率，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，提高藥物的治療效果，成為改善胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。目前臨床上常用的胰腺癌腫瘤學(xué)標(biāo)志物是CA19-9。CA19-9單獨作為診斷胰腺癌的指標(biāo)尚不精確，敏感性較低，并且在其他消化道腫瘤及良性疾病中也有升高，因此對胰腺癌早期診斷的價值有限。另外，一些基因腫瘤標(biāo)志物也用于臨床胰腺癌的早期診斷，但始終未能達(dá)到診斷的目的。因此，需要更迫切地尋找一些敏感性或特異性更好的標(biāo)志物用于胰腺癌的早期診斷、療效評估或轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的監(jiān)控。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了實現(xiàn)胰腺癌的早期診斷，預(yù)后評估，復(fù)發(fā)監(jiān)控，個體化治療，本發(fā)明的目的之一在于提供一種檢測胰腺癌的分子標(biāo)記物。本發(fā)明的目的之二是在于提供所述分子標(biāo)記物在制備胰腺癌預(yù)后評估產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的之三在于提供一種胰腺癌預(yù)后評估的試劑盒。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一種檢測胰腺癌的分子標(biāo)記物，所述標(biāo)記物為C21orf82，其核苷酸序列為SEQIDNO.1。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了所述的分子標(biāo)記物在制備胰腺癌預(yù)后評估產(chǎn)品中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述產(chǎn)品為芯片或試劑盒。優(yōu)選地，所述芯片為基因芯片。優(yōu)選的，所述基因芯片包括固相載體以及固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括特異性地對應(yīng)于C21orf82核苷酸的部分或全部序列。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供一種胰腺癌預(yù)后評估的試劑盒，所述試劑盒包括：(1)組織或血液樣品提取總RNA試劑；(2)反轉(zhuǎn)錄試劑；(3)定量PCR試劑。優(yōu)選地，組織或血液樣品提取總RNA試劑包括TRizol、三氯甲烷、異丙醇、75％乙醇和無酶水；所述反轉(zhuǎn)錄試劑包括5xPrimerScriptBuffer、PrimeScriptRTEnzymeMixI、OligodTPrimer、Random6mers和RNaseFreedH2O。優(yōu)選地，所述定量PCR試劑包括特異性擴增C21orf82的引物序列。優(yōu)選地，所述引物序列包括SEQIDNO.2和SEQIDNO.3。優(yōu)選地，所述的引物序列適用于SYBRGreen、TaqMan探針、雙雜交探針、復(fù)合探針的檢測。優(yōu)選地，所述定量PCR試劑還包括10×Buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶和SYBRGreen熒光染料。優(yōu)選地，所述試劑盒含有陽性對照和陰性對照；所述陽性對照為人正常的胰腺組織或細(xì)胞的總RNA或DNA；所述陰性對照為蒸餾水。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種評估胰腺癌治療效果的方法，所述方法包括如下步驟：(1)獲取受試者的樣品；(2)檢測受試者樣品中C21orf82的表達(dá)水平；(3)將測得的C21orf82的表達(dá)水平與受試者的患病與否關(guān)聯(lián)起來判斷治療效果。判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：治療后C21orf82表達(dá)水平與治療前相比，比值P≤1判斷為治療無效，1<P<1.5判斷為病情改善，1.5＜P判斷為治療顯著。優(yōu)選地，所述受試者樣品包括胰腺癌組織樣品和血液樣品；所述受試者樣品為治療前的或治療后的樣品。優(yōu)選地，所述治療包括施用手術(shù)干涉，化療，放療，藥物治療或其組合。本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明公開了一種與胰腺癌相關(guān)的lncRNAC21orf82，并且通過單因素Cox回歸分析了C21orf82為胰腺癌保護(hù)性因素。利用C21orf82檢測胰腺癌不僅能夠快速有效的做到早期檢測、預(yù)后評估，其精確度大大提高，而且為基因治療、藥物治療等臨床應(yīng)用提供了治療靶點和重要依據(jù)。附圖說明圖1C21orf82表達(dá)水平對胰腺癌患者總生存期的影響。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用的試劑可以商業(yè)購買得到。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常為本領(lǐng)域常規(guī)方法，如按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆，實驗手冊(第三版)(科學(xué)出版社，2002)中的所述條件，或按照試劑制造廠家所建議的條件。本發(fā)明基于TCGA數(shù)據(jù)庫信息中160個胰腺癌患者的數(shù)據(jù)進(jìn)行胰腺癌的生存分析篩選相關(guān)基因，篩選得到與生存時間相關(guān)C21orf82，通過單因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)C21orf82為保護(hù)性因素。進(jìn)一步通過定量PCR檢測胰腺癌患者C21orf82表達(dá)量，并分析與總生存時間的關(guān)系。本發(fā)明所述的基因是在本發(fā)明之前的已知基因，均來源于人類基因組。Genebank登錄號：C21orf82：GeneID:114036。C21orf82又名LINC00310(longintergenicnon-proteincodingRNA310，長鏈非編碼蛋白質(zhì)的RNA310)，位于21號染色體上。在本發(fā)明中，“預(yù)后”是指癌癥患者在通過手術(shù)、化療、藥物治療或其組合處理等抑制或緩解腫瘤生長后的過程或結(jié)果。預(yù)后可以是通過手術(shù)、化療、藥物治療或其組合處理抑制或緩解胰腺癌生長后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更久時的生機狀態(tài)。預(yù)后可以通過檢查標(biāo)志物來評估，所述的標(biāo)記物為一個或多個基因。預(yù)后評估可以這樣進(jìn)行：根據(jù)標(biāo)志物的有或無，或者升高或降低，確定患者的預(yù)后是良好還是不良，或者確定良好預(yù)后或不良預(yù)后的概率。本發(fā)明中，TNM分期是目前國際上最為通用的腫瘤分期系統(tǒng)。目前他已經(jīng)成為臨床醫(yī)生和醫(yī)學(xué)科學(xué)工作者對于惡性腫瘤進(jìn)行分期的標(biāo)準(zhǔn)方法。國際TNM分期系統(tǒng)各不相同，因此TNM分期中字母和數(shù)字的含義在不同腫瘤所代表的意思不同。TNM分期中T，N，M確定后就可以得出相應(yīng)的總的分期，即I期，II期，III期，IV期等。I期的腫瘤通常是相對早期的腫瘤有著相對較好的預(yù)后。分期越高意味著惡性腫瘤程度越高。本發(fā)明參考胰腺癌AJCCTNM分期。如：胰腺癌AJCC2002年(第6版)TNM分期：原發(fā)腫瘤(T)TX原發(fā)腫瘤不能確定；T0未見原發(fā)腫瘤；Tis原位癌；T1腫瘤限于胰腺內(nèi)，最大徑≤2cm；T2腫瘤限于胰腺內(nèi)，最大徑＞2cm；T3腫瘤侵犯至胰腺外，未累及腹腔干或腸系膜上動脈；T4腫瘤累及腹干軸或腸系膜上動脈。區(qū)域淋巴結(jié)(N)Nx區(qū)域淋巴結(jié)不能確定；N0無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；N1有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M)Mx遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移不能確定；M0無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；M1有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。臨床分期：0期TisN0M0；IA期T1N0M0，IB期T2N0M0；IIA期T3N0M0，IIB期T1N1M0，T2N1M0，T3N1M0；Ⅲ期T4任何NM0；Ⅳ期任何T任何NM1。實施例1基于TCGA數(shù)據(jù)庫信息進(jìn)行胰腺癌的生存分析篩選相關(guān)基因1、臨床信息篩選檢索TCGA數(shù)據(jù)庫中的胰腺癌患者臨床信息，截至2015年12月10日，TCGA數(shù)據(jù)庫中總共記載了185例胰腺癌臨床病例。對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，共有160例患者納入研究。篩選時排除具有其他惡性腫瘤病史、曾接受過放療或化療的患者，同時納入研究的患者需含臨床信息和mRNA數(shù)據(jù)。2、生存期研究樣本統(tǒng)計160例胰腺癌患者生存時間的統(tǒng)計結(jié)果如下表所示:表1160例胰腺癌患者生存時間統(tǒng)計生存期時間t(年)期初進(jìn)入研究人數(shù)期內(nèi)死亡人數(shù)期內(nèi)失訪人數(shù)t<116027741≤t<25922152≤t<3221023≤t<410224≤t<56015≤t5413、mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)生存分析研究方案(1)對胰腺癌高通量mRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)檢索、數(shù)據(jù)下載及樣本挑選和歸類。由下載的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)通過生物信息學(xué)分析篩選得出與胰腺癌生存時間相關(guān)的mRNA。(2)用Cytoscape軟件構(gòu)建由mRNAs組成的生物信息網(wǎng)絡(luò)，通過DAVID對生物信息網(wǎng)絡(luò)中與胰腺癌生存時間相關(guān)的mRNA進(jìn)行GO分析和Pathway分析。4、胰腺癌mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)的生存分析結(jié)果將胰腺癌組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載后，去除readcount＝0小于20％的mRNA后用做下一步分析，包括17100個mRNA。提取mRNA基因表達(dá)量和胰腺癌TCGA數(shù)據(jù)庫生存時間數(shù)據(jù)，采用survival包的coxph函數(shù)完成，經(jīng)單因素Cox回歸分析，篩選得到單因素Cox回歸中p值<0.05的mRNA有580個，包括328個風(fēng)險性mRNA和252個保護(hù)性mRNA。Coef值是回歸系數(shù)，HR＞1為風(fēng)險性因素，HR＜1為保護(hù)性因素。為了更好的研究與生存時間相關(guān)的mRNA的功能，我們通過GORILLA和GeneCodis軟件對胰腺癌生存時間相關(guān)的mRNA進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路富集，篩選標(biāo)準(zhǔn)皆為FDR<0.05。其中C21orf82的p值為0.002901，HR<1為胰腺癌保護(hù)性lncRNA。實施例2胰腺癌組織中C21orf82與胰腺癌臨床病理特點及預(yù)后相關(guān)性1、受試者病理組織標(biāo)本來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院。樣本納入和排除標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)入選標(biāo)準(zhǔn)：接受外科手術(shù)切除病例，術(shù)后病理診斷為胰腺癌；(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：病例資料不完整，無病理學(xué)以及隨訪資料；腫瘤未切除、或僅行腫瘤的穿刺活檢術(shù)，未獲得完整組織學(xué)標(biāo)本。本實施例納入55例胰腺癌患者，其中男性患者34例，女性患者21例，年齡<65歲35人，年齡>65歲20人；低、中分化32例，高分化23例；腫瘤TNM分期1～2期為41例，3～4期為14例。參與本研究的患者手術(shù)前均未接受化、放療以及免疫治療。本研究通過北京協(xié)和醫(yī)院理論委員會審核。2、方法2.1對組織樣本進(jìn)行總RNA提取依據(jù)編號分別對55例胰腺癌組織及18例癌旁組織進(jìn)行總RNA提取，采用Reagent(invitrogen，貨號15596-018)進(jìn)行樣本RNA提取，實驗操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，具體操作如下：收集樣本后凍存于液氮，取出后把組織放入已預(yù)冷的研缽中進(jìn)行研磨，待組織樣本成粉末狀后：①加入Trizol，室溫保存5分鐘；②加氯仿0.2mL，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5分鐘-10分鐘；③12000rpm高速離心15分鐘后吸取上層水相(吸70％)到另一新離心管管中，注意不要吸到兩層水相之間的蛋白物質(zhì)。移入新管，加入等體積的-20℃預(yù)冷異丙醇，充分顛倒混勻，置于冰上10分鐘；④12000rpm高速離15分鐘后小心棄掉上清液，按1mL/mLTrizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振蕩混合，4℃下12000rpm高速離心5分鐘；⑤棄去乙醇液體，室溫下放置5分鐘以充分晾干沉淀，加入DEPC處理過的水溶解沉淀；⑥用Nanodrop2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度，凍存于-80℃。RNA質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)：RNA樣本的OD260/OD280值為1.7-2.2之間；總RNA電泳圖譜有清晰的28S、18S條帶；70℃水浴保溫1小時后的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜無明顯差異。2.2RNA樣品的質(zhì)量分析RNA提取后瓊脂糖凝膠電泳，從電泳結(jié)果可以初步判定提取的RNA樣品質(zhì)量合格與否。進(jìn)而通過NanoDrop1000分光光度計檢測RNA樣品要求：OD260/OD280為1.8-2.2。2.3逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA采用IIIReverseTranscriptase(invitrogen，貨號18080-044)進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，實驗操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，具體操作如下：使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對lμg總RNA進(jìn)行逆反錄合成cDNA。采用25μL反應(yīng)體系，每個樣品取1μg總RNA作為模板RNA。獲得的cDNA保存放-20℃冰箱備用。2.4Real-TimePCR2.4.1儀器及分析方法用ABI7500型熒光定量PCR儀，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)相對定量分析。采用在線軟件設(shè)計引物，基因序列參照NCBI：NR_027266.1(C21orf82)，內(nèi)參選GAPDH，引物設(shè)計后由invitrogen公司合成。具體引物序列如表2所示：表2引物序列操作過程如下：表3RealTime反應(yīng)體系組分加入量2×mix10μL上游引物(10uM)0.5μL下游引物(10uM)0.5μL模板2μL加入滅菌蒸餾水至25μL(一)反應(yīng)體系：用PowerGreenPCRMasterMix(invitrogen，貨號4367659)進(jìn)行擴增，實驗操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。擴增程序為：95℃5min，(95℃15sec，60℃45sec，72℃35sec)×40個循環(huán)。(二)引物篩選將各樣本cDNA混合后，以此為模板進(jìn)行5倍梯度稀釋，稀釋后樣品各取2μL作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴增，同時在60-95℃進(jìn)行融解曲線分析，根據(jù)擴增效率高和溶解曲線單峰原則進(jìn)行引物篩選。(三)樣品RealTime-PCR檢測將各樣品cDNA10倍稀釋后取2μL作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴增。同時在60-95℃進(jìn)行溶解曲線分析。2.4.2數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析收集臨床病理資料和表達(dá)結(jié)果，進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS19.0，統(tǒng)計學(xué)顯著差異定義為<0.05。胰腺癌組織中C21orf82表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性采用卡方或者Fisher’s精確檢驗法。用Kaplan-meier方法進(jìn)行生存時間分析，擬合總生存時間曲線，應(yīng)用Long-rank檢驗比較不同組間的生存曲線差異；應(yīng)用Cox比例風(fēng)險回歸模型分析預(yù)后因素。以p<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。3、實驗結(jié)果(1)C21orf82在胰腺癌組織表達(dá)情況實時定量PCR擴增曲線拐點清楚，擴增曲線整體平行性好，表明各反應(yīng)管的擴增效率相近，極限平而無上揚現(xiàn)在，曲線指數(shù)期斜率較大，說明擴增效率較高；樣本擴增產(chǎn)物溶解曲線都是單峰，說明擴增產(chǎn)物只有一條，為特異性擴增；根據(jù)qRT-PCR的相對定量公式：2-ΔΔCt×100％，比較C21orf82在胰腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：qRT-PCR擴增結(jié)果穩(wěn)定，其中C21orf82在胰腺癌患組織中的表達(dá)水平低于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。(2)人胰腺癌組織中C21orf82表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)系根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)劃分胰腺癌組織中C21orf82表達(dá)水平的高低，采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS19.0，統(tǒng)計學(xué)顯著性差異定義為P<0.05。對胰腺癌組織中C21orf82的表達(dá)水平與胰腺癌病例的臨床病理參數(shù)進(jìn)行分析，詳情見表4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織C21orf82的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(p<0.05)。表4胰腺癌組織C21orf82表達(dá)水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性1依據(jù)WHO分級；2依據(jù)TNM分期；*p<0.05。(3)C21orf82表達(dá)水平與胰腺癌患者的總體生存預(yù)后關(guān)系應(yīng)用Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存檢測胰腺癌組織中C21orf82表達(dá)水平高低對患者總生存時間的影響。根據(jù)C21orf82表達(dá)量將患者分成兩組，C21orf82高表達(dá)組定義為高表達(dá)C21orf82的前40％的患者(22例)，剩余60％患者定義為C21orf82的低表達(dá)組(33例)。結(jié)果如圖1所示，C21orf82低表達(dá)患者的總生存期(中位生存時間27個月)短于C21orf82高表達(dá)的患者(中位生存時間45個月)，C21orf82高表達(dá)患者具有更久的生存期，p<0.01，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。提示胰腺癌組織中C21orf82異常表達(dá)與患者的預(yù)后有關(guān)。對C21orf82表達(dá)水平和臨床病理特征對患者總體生存期的影響進(jìn)行單因素和多因素分析(Cox回歸模型)，結(jié)果表明C21orf82表達(dá)水平是影響胰腺癌患者預(yù)后的獨立保護(hù)因素(p<0.01)。實施例3試劑盒制備本實施例提供了用于胰腺癌療效評估的試劑盒，該試劑盒包括(1)RNA提取試劑包括TRizol、三氯甲烷、異丙醇、75％乙醇和無酶水；(2)反轉(zhuǎn)錄試劑包括5xPrimerScriptBuffer、PrimeScriptRTEnzymeMixI、OligodTPrimer、Random6mers和RNaseFreedH2O；(3)定量PCR試劑包括特異擴增C21orf82的引物序列如表2所示。和特異擴增管家基因(GAPDH)的引物對如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示；還包括SYBRGreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系，如PCR緩沖液、SYBRGreen熒光染料、dNTPs。所述PCR緩沖液的成分為25mMKCl，2.5mMMgCl2，200mM(NH4)2SO4；還包括胰腺正常組織cDNA：作為陰性對照與檢測樣本cDNA共同定量PCR檢測，每個反應(yīng)體系使用與檢測樣本cDNA相同量。反轉(zhuǎn)錄體系如表5所示。反應(yīng)程序為：37℃孵育15min，85℃滅活5s。表5反轉(zhuǎn)錄體系組分加入量5xPrimerScriptBuffer2μLPrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μLOligodTPrimer(50μM)0.5μLRandom6mers(100μM)0.5μLTotalRNA1ulRNaseFreedH2O至10μL定量PCR反應(yīng)體系如表6所示。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5min，(95℃變性15sec，60℃退火45sec，72℃延伸35sec)×40個循環(huán)，72℃延伸15min。表6定量PCR反應(yīng)體系實施例4C21orf82檢測用于胰腺癌療效評估2010年10月至2015年12月從北京協(xié)和醫(yī)院收集10例胰腺癌患者治療前和治療后的血液樣品，利用實施例3所述的試劑盒分檢測C21orf82表達(dá)含量，根據(jù)以下公式計算P值：P＝治療后/治療前，P≤1判斷為治療無效，1<P≤1.5判斷為病情改善，1.5＜P判斷為治療顯著，將P值判斷結(jié)果與這10名患者的臨床評價結(jié)果進(jìn)行比較，考察C21orf82檢測用于胰腺癌療效評估的效果。結(jié)果如下：由表7可知，試劑盒用于胰腺癌療效評估的結(jié)果與臨床評價結(jié)果的符合率達(dá)100％。表7C21orf82檢測用于胰腺癌療效評估患者編號P值P值判斷結(jié)果臨床評價結(jié)果11.45病情改善病情改善20.49治療無效果治療無效果31.21病情改善病情改善40.45治療無效果治療無效果51.69療效顯著療效顯著60.54治療無效果治療無效果71.36病情改善病情改善80.98治療無效果治療無效果91.15病情改善病情改善100.78治療無效果治療無效果雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。序列表<110>北京致成生物醫(yī)學(xué)科技有限公司<120>C21orf82在制備胰腺癌預(yù)后評估產(chǎn)品中的應(yīng)用<130>p16yxa74<160>5<170>PatentInversion3.5<210>1<211>1269<212>DNA<213>人工序列<400>1gcagattcttggcagacctctgttgtttttctagagttgtaggcaagtagttggacaaaa60agcaagaagctgatcgatgttgctggctttggattctttgtgaacaaatgagacaagccc120cttttgtctaaaatagtgatgtacattaaatgcaaagggcaaatggaaccattgaaaagt180actttttgcatccaaaacagccaacgctttggtgcctgctatgtgtcagacactgattct240tctgtcatccttattctactgatgaggcaactgaggcagcttcagagagttcgagtaacc300tgcggatcacacaactaggaagtaagagagctggaacttgacgttgggctgttgacctcc360agaaatggtgttttttccagtactcagtgctgcctctgactccattgtgatggttgattt420tatgtgtcaacttgactgggcccaggggtacccagatatttggtcaaacattattctggg480tgtttctgtgagggcgttttgggtgagattaacatttaaattggtagactgagtaaagca540gatggccctctatgatatggccaggcctcatccaatccattgaaagcctgaatggaacaa600aaaggccaaccctccctcagtaggaggaaatttcgtctgcttgactgcattcaaactagg660acgtcaactttttcctgcctttggacttgaatagaaacatcagctcttcctagatcttca720acctgccaggcttcagattgaagtttataccatcagctctcttggttcttgggcctttgg780acccagactgtaagtgcaccatccgttctcttgggtcttgcttgctgactcaccctgcag840atttggggacttatcagcctctaattctgtgagccaattccttctaatatatctctctat900acgcatcctgtctcactggaagaaccctgatacggttaggctttgtgtcctcattcaaat960ctcatcttgaattgtaaatcccataatccccataatccccatgtgtcaggggagggatca1020ggtggaggtaattgcatcatgggagcagtttcccctgtgctcttctcacgatagtgaaag1080agttctcacaagatctgatggttttataaggggctcttccccctttgctctgcacttccc1140cttcctgctgccttgtggccttgtgaagaaggtgtcttgcttcccctttgccctcctcca1200tgattgtaagtttcctgaggcctccccagtcatgcagaactgtgagtcaattaaacctct1260gtcctttat1269<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2gatcgatgttgctggctttgg21<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3acagcccaacgtcaagttcc20<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>4ggagcgagatccctccaaaat21<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>5ggctgttgtcatacttctcatgg23當(dāng)前第1頁1 2 3