本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中的動(dòng)物模型，更具體地說(shuō)，是涉及一種IRTKS基因肝臟特性剔除的小鼠模型，其構(gòu)建方法，及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

糖尿病是由遺傳因素，環(huán)境因素和生活行為等多種因素共同作用引起的一種以高血糖為特征的代謝性疾病。糖尿病的患病率，致殘率和病死率以及對(duì)總體健康的危害程度，已居于慢性非傳染性疾病的第三位，糖尿病及其并發(fā)癥所造成的死亡率人數(shù)也已居于世界死亡原因的第五位。有研究報(bào)道2013年世界糖尿病患病人數(shù)已達(dá)到3.82億，并預(yù)計(jì)到2030年增加到5.52億人。過(guò)去30多年來(lái)，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，國(guó)內(nèi)糖尿病的患病率增加了十幾倍，1980年全國(guó)14省市30萬(wàn)人調(diào)查資料顯示糖尿病的患病率為0.67％；2010年調(diào)查顯示，我國(guó)18歲以上的人群糖尿病患病率為9.7％。根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)的數(shù)據(jù)，我國(guó)2014年的糖尿病患病人數(shù)為9629萬(wàn)人，位居全球首位。因此糖尿病的高發(fā)病率引起全球的高度重視。

為了深入探索糖尿病的發(fā)病機(jī)制，良好的動(dòng)物模型是非常必要的研究工具。早期，研究人員通過(guò)物理，化學(xué)，生物等致病因素，人工誘發(fā)具有糖尿病特征的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，自發(fā)性遺傳性糖尿病模型由于沒(méi)有人為的干預(yù)因素，更能模擬人類真實(shí)的糖尿病發(fā)病機(jī)制，其應(yīng)用于糖尿病發(fā)病機(jī)制及并發(fā)癥方便的科研價(jià)值較大，較常見(jiàn)的有ob/ob，db/db小鼠等，分別是由于瘦素基因或瘦素基因受體的突變導(dǎo)致的肥胖伴隨嚴(yán)重的胰島素抵抗，但這些動(dòng)物模型的局限性在于它所基于的基因突變遺傳背景在人類患者中并不常見(jiàn)。近年來(lái)，隨著研究人員對(duì)糖尿病發(fā)病機(jī)制了解的深入，以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型技術(shù)的日趨成熟，基于疾病的相關(guān)關(guān)鍵信號(hào)通路的轉(zhuǎn)基因或基因剔除動(dòng)物模型在糖尿病的研究中應(yīng)用增多。另一方面，由于糖尿病是一組多種遺傳背景和環(huán)境因素相互作用而引發(fā)的臨床綜合癥，目前雖然開(kāi)發(fā)的糖尿病動(dòng)物模型很多，但與人類糖尿病仍有偏差，至今尚無(wú)與人類糖尿病完全吻合的動(dòng)物模型。基于糖尿病發(fā)病機(jī)制的研究新進(jìn)展，開(kāi)發(fā)獲得較好模擬人類糖尿病的動(dòng)物模型仍然是我們探索糖尿病，胰島素抵抗的有效工具和必需研究途徑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種IRTKS基因肝臟特異性剔除的小鼠模型及構(gòu)建與應(yīng)用。它可以為糖尿病的研究及分子發(fā)病機(jī)制的探討提供研究模型。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

第一方面，本發(fā)明涉及一種IRTKS基因肝臟特異性剔除的小鼠模型的構(gòu)建方法，通過(guò)同源重組的方法，用2.245-kb frt-neo-frt-loxp-Flox-loxp序列取代了小鼠IRTKS基因中含有exon2的序列，得到IRTKS^flox/+的嵌合體小鼠；將獲得的嵌合體小鼠與肝臟特異性表達(dá)Cre的小鼠Alb-Cre交配，最終獲得IRTKS基因肝臟特異性剔除的小鼠模型。

優(yōu)選的，所述構(gòu)建方法包括如下具體步驟：

S1、構(gòu)建IRTKS-CKO質(zhì)粒；

S2、ES細(xì)胞基因打靶及篩選陽(yáng)性克?。?/p>

S3、陽(yáng)性ES克隆注射小鼠囊胚，獲得IRTKS^flox/+的嵌合體小鼠；

S4、將嵌合體雄鼠與雌鼠繁育，獲得雙臂陽(yáng)性F1代小鼠；

S5、將F1代小鼠或其后代與Alb-Cre小鼠交配。

優(yōu)選的，步驟S1中，IRTKS-CKO質(zhì)粒DNA用NotI酶切，分離純化，無(wú)水乙醇沉淀，無(wú)菌PBS重懸，獲得IRTKS-CKO質(zhì)粒。

優(yōu)選的，步驟S2中，ES細(xì)胞為SCR012，克隆篩選條件為300μg/ml G418和2μM GanC篩選8天。

優(yōu)選的，步驟S2還包括用PCR方法鑒定陽(yáng)性ES克隆；5’PCR鑒定的引物對(duì)序列如SEQ ID NO：1、2所示；3’PCR鑒定的引物對(duì)序列如SEQ ID NO：3、4所示。

優(yōu)選的，步驟S3中，所述嵌合體小鼠為嵌合率在50％以上的雄性小鼠。

優(yōu)選的，步驟S3中提供囊胚的小鼠和步驟S4中的雌鼠均為C57BL系小鼠。

優(yōu)選的，步驟S5還包括用PCR方法鑒定基因型；野生型WT PCR的鑒定引物對(duì)為SEQ ID NO：7、8，突變型Neo PCR的鑒定引物對(duì)為SEQ ID NO：5、6。

第二方面，本發(fā)明還涉及一種上述構(gòu)建方法獲得的IRTKS基因肝臟特異性剔除的小鼠模型。

第三方面，本發(fā)明還涉及一種上述構(gòu)建方法獲得的IRTKS基因肝臟特異性剔除的小鼠模型在制備或篩選糖尿病治療藥物中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

1)本發(fā)明通過(guò)同源重組，用2.245-kb frt-neo-frt-loxp-Flox-loxp序列取代了小鼠IRTKS基因中含有exon2的序列，得到IRTKS^flox/+的嵌合體小鼠。利用Cre重組酶的特性，將獲得的嵌合體小鼠與肝臟特異性表達(dá)Cre的小鼠Alb-Cre交配，構(gòu)建了可靠的IRTKS基因肝臟特異性剔除的小鼠模型。

2)通過(guò)對(duì)IRTKS基因肝臟特異性剔除的小鼠模型體重，空腹血糖，糖耐量，及病理檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)IRTKS基因肝臟特異性剔除的小鼠出現(xiàn)體重增加，高血糖，葡萄糖耐量降低，并且肝臟切片中伴有空泡樣脂肪變，這與人類的發(fā)病特征相符，從而為糖尿病發(fā)病機(jī)制的研究以及治療藥物的評(píng)價(jià)和篩選提供了良好的動(dòng)物模型。

附圖說(shuō)明

通過(guò)閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1 IRTKS-CKO小鼠的打靶質(zhì)粒構(gòu)建示意圖；其中，A為打靶載體的構(gòu)建策略，B為打靶載體的示意圖，C為IRTKS-CKO打靶示意圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例1 IRTKS-CKO小鼠的基因型鑒定結(jié)果示意圖；其中，a為首代嵌合體小鼠基因型的5’arm的鑒定結(jié)果，b為首代嵌合體小鼠基因型的3’arm的鑒定結(jié)果；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例2 IRTKS-LKO小鼠的基因型鑒定策略，其中P5/P6引物擴(kuò)增的neo為插入loxp位點(diǎn)單個(gè)等位基因，P7/P8引物擴(kuò)增的WT為未插入loxp位點(diǎn)的單個(gè)等位基因；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例2 IRTKS基因肝臟特異性剔除小鼠的基因型PCR鑒定結(jié)果示意圖；

圖5是本發(fā)明實(shí)施例2熒光定量PCR鑒定不同組織中IRTKS mRNA的表達(dá)水平；

圖6是本發(fā)明實(shí)施例2 IRTKS基因肝臟特異性剔除小鼠的基因型Western-blot驗(yàn)證結(jié)果示意圖；

圖7是本發(fā)明實(shí)施例3中野生型和IRTKS基因肝臟特異性敲除的雄性小鼠體重對(duì)比示意圖；

圖8是本發(fā)明實(shí)施例3中野生型和IRTKS基因肝臟特異性敲除的雄性小鼠空腹血糖值對(duì)比示意圖；

圖9是本發(fā)明實(shí)施例3中野生型和IRTKS基因肝臟特異性敲除的雄性小鼠胰島素耐量曲線圖；

圖10是本發(fā)明實(shí)施例3中野生型和IRTKS基因肝臟特異性敲除的雄性小鼠肝臟組織HE染色圖；其中，a為WT小鼠在正常飲食下肝臟的HE染色結(jié)果，b為L(zhǎng)KO小鼠在正常飲食下肝臟的HE染色結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干調(diào)整和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1、IRTKS-CKO小鼠的構(gòu)建

1、IRTKS-CKO質(zhì)粒的構(gòu)建

參見(jiàn)圖1，將100μg IRTKS-ABRLFn-pBR322打靶載體DNA用NotI(酶用量：120U)線性化，酶切體系為200μl、37℃消化過(guò)夜，等體積酚氯仿、氯仿處理后，無(wú)水乙醇沉淀，100μl無(wú)菌PBS重懸備用。

2、ES細(xì)胞打靶及篩選

將上述IRTKS-ABRLFn-pBR322載體線性化質(zhì)粒用于ES細(xì)胞打靶。

ES細(xì)胞：SCR012

線性化IRTKS-CKO DNA量：35μg

電轉(zhuǎn)儀型號(hào)：Bio-Rad Gene Pulser(Cat.No.165-2105)

電穿孔條件：電壓240v，電容500μF，實(shí)際通電時(shí)間9.6ms，實(shí)際電壓256v

克隆篩選條件：300μg/ml G418和2μM GanC篩選8天

挑取抗性克隆和提供DNA樣本共96份

3、陽(yáng)性ES克隆的鑒定

分別設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，參見(jiàn)圖1；其中，P1/P2引物對(duì)鑒定5’arm，P3/P4引物對(duì)鑒定3’arm。

5’PCR鑒定：鑒定引物P1 IRTKS-5P111和P2 neo-reverse，目的片段為4188bp；鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2。

PCR引物序列：

P1 IRTKS-5P111：TCTAGACAATGTGCTTGCAGCC(SEQ ID NO：1)

P2 neo reverse：GGCCTACCCGCTTCCATTGCTC(SEQ ID NO：2)

反應(yīng)體系(25μl)：

PCR反應(yīng)條件：95℃4min，94℃45s，63.6℃210s(34cycles)，72℃10min.

3’PCR鑒定：鑒定引物為P3 neo-L和P4 IRTKS-3P211，目的片段為4513bp。鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2。

PCR引物序列：

P3 neo-Lh：CCGTGCCTTCCTTGACCCTGG(SEQ ID NO：3)

P4 IRTKS-3P211：AACTCAGACGCAGAAACCAGTC(SEQ ID NO：4)

PCR反應(yīng)條件：95℃4min；94℃45s，68℃330s(34 cycles)，72℃10min.

反應(yīng)體系(25μl)：

4、囊胚注射

顯微注射用囊胚來(lái)源：C57BL/6J小鼠超數(shù)排卵，自然受孕，體內(nèi)發(fā)育至囊胚階段。將陽(yáng)性同源重組的胚胎干細(xì)胞注入到C57BL/6J小鼠的囊胚，共注射96枚胚胎，制作9只受體。共出生3只小鼠，其中3只♂為＞50％嵌合雄鼠。

5、嵌合體小鼠的繁育

將嵌合率大于50％的成熟雄鼠與C57BL/6J雌鼠進(jìn)行交配，后代灰色小鼠經(jīng)提取尾基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定(鑒定策略同上)，共獲得雙臂陽(yáng)性F1代小鼠7只，

實(shí)施例2、IRTKS-LKO小鼠的基因型鑒定以及IRTKS的表達(dá)鑒定

1、將F1代小鼠與Alb-Cre工具鼠交配繁殖，利用PCR鑒定小鼠基因型，可獲得IRTKS-LKO小鼠。

首先設(shè)計(jì)兩對(duì)PCR引物，參見(jiàn)圖3。引物序列如下

Neo(751bp)P5：TAGTTGCCAGCCATCTGTTG(SEQ ID NO：5)

P6：CATCCTGCACTGCTCCTGTA(SEQ ID NO：6)

WT(497bp)P7：CTGGGGTTCCTGAGACTTTG(SEQ ID NO：7)

P8：CATCCTGCACTGCTCCTGTA(SEQ ID NO：8)

及Cre通用引物：(293bp)P9：AACGCTGGTTAGCACCGCAGG(SEQ ID NO：9)

P10：TATCTCGCGCGGCTCCGACA(SEQ ID NO：10)

PCR反應(yīng)體系(50μl)：5U/ul TaKaRa rTaq 0.25μl，10XTaKaRa rTaq緩沖液5μl，2.5mM dNTP混合液4μl，DNA模板300ng，正反向引物各0.3-1μM，滅菌蒸餾水補(bǔ)足總體積至50μl。

PCR反應(yīng)條件：95℃10min；95℃10s，58℃30s，72℃30s，共30個(gè)循環(huán)；72℃5min。

圖4是PCR鑒定結(jié)果示意圖；其中，P7/P8引物對(duì)是鑒定野生型IRTKS，P5/P6是鑒定IRTKS-neo插入loxp位點(diǎn)的突變型，圖中顯示，編號(hào)為19的小鼠基因型為IRTKS^flox/floxX Alb-Cre。

2、小鼠組織RNA的提取，逆轉(zhuǎn)錄，及熒光定量PCR

經(jīng)基因型鑒定過(guò)的小鼠頸椎脫臼處死，解剖，取各個(gè)組織器官(白色脂肪墊，腎，脾，胰腺，肝，肺)與液氮中速凍并轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。采用Trizol reagent(Invitrogen)提取組織RNA，經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR獲得cDNA，最后進(jìn)行熒光定量PCR鑒定。

定量PCR反應(yīng)使用Thermal Cycler Dice Real time System(TP800實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，TaKaRa)及SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa Biotechnology Inc.Dalian，China)

qPCR鑒定引物為：

IRTKS-F：TTGGCAGGCTACGTCTACCT(SEQ ID NO：11)

IRTKS-R：GCGCCTAGGACTTGAGACTG(SEQ ID NO：12)

Actin-F：AATCGTGCGTGACATTAAGGAG(SEQ ID NO：13)

Actin-R：ACTGTGTTGGCGTACAGGTCTT(SEQ ID NO：14)

PCR反應(yīng)體系(25μl)：2XSYBR Premix Ex Taq 12.5μl，cDNA 2μl，10μM正反向引物0.5μl，滅菌蒸餾水補(bǔ)足總體積至25μl。

PCR反應(yīng)條件(二步法擴(kuò)增)：95℃10s；95℃5s，60℃30s，共38個(gè)循環(huán)。

擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行溶解曲線分析，溶解曲線生成的反應(yīng)程序?yàn)?5℃15s，60℃30s，95℃15s，解離時(shí)間4s。

熒光定量PCR的反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)圖5，由圖5可知在白色脂肪，腎，脾，肺，胰腺中IRTKS mRNA的表達(dá)水平與WT一致，LKO小鼠肝臟中IRTKS的mRNA不表達(dá)。

3、小鼠肝臟組織蛋白的提取及免疫印跡分析

預(yù)先配制好含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液：20mM Tris pH8.0，137mM NaCl，10％甘油，1％NP-40(乙基苯基聚乙二醇)，2mM EDTA，蛋白酶及磷酸酶抑制劑。置于冰上，將研磨好的組織放入裂解液中20min，4℃，120000rpm/min離心20min。吸取上清，蛋白BCA定量，免疫印跡分析，anti-IRTKS(兔多抗)，anti-Actin(Santa Cruz)。免疫印跡結(jié)果見(jiàn)圖6，Western-blot驗(yàn)證的與熒光定量PCR的結(jié)果一致。

通過(guò)上述分析鑒定，驗(yàn)證了實(shí)施例1構(gòu)建的IRTKS基因肝臟特異性剔除小鼠模型的可靠性。

實(shí)施例3、野生型及肝臟特異性剔除IRTKS小鼠的糖代謝相關(guān)分析

1、5.5月齡雄性小鼠體重檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肝臟特異性剔除IRTKS小鼠體重明顯高于野生型小鼠體重見(jiàn)圖7。

2、用羅氏血糖儀(Roche Accu-Chek)檢測(cè)IRTKS-LKO及WT小鼠空腹血糖值，結(jié)果見(jiàn)圖8。IRTKS-LKO小鼠血糖顯著高于WT。

3、5.5月齡的雄性小鼠，禁食過(guò)夜，用1ml注射器腹腔注射1.5g/kg的葡萄糖，分別在注射前(0)以及注射后15，30，60，90，120分鐘測(cè)定每只小鼠的血糖值，計(jì)算出每個(gè)時(shí)間點(diǎn)小鼠血糖的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并進(jìn)行student’s t-test統(tǒng)計(jì)分析，以時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，血糖值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)差為誤差值，繪制葡萄糖耐量曲線，結(jié)果見(jiàn)圖9。

4、5.5月齡雄性小鼠肝臟組織切片，HE染色結(jié)果見(jiàn)圖10。LKO小鼠肝臟組織中出現(xiàn)較多空泡樣脂肪變。

綜合圖7-10結(jié)果可見(jiàn)，IRTKS基因肝臟組織特異性剔除小鼠糖代謝出現(xiàn)異常，具有高血糖，葡萄糖耐受等特征。

以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海交通大學(xué)

<120> IRTKS基因肝臟特異性剔除的小鼠模型及構(gòu)建與應(yīng)用

<130> DAG28026

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物P1 IRTKS-5P111

<400> 1

tctagacaat gtgcttgcag cc 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物P2 neo-reverse

<400> 2

ggcctacccg cttccattgc tc 22

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物P3 neo-Lh

<400> 3

ccgtgccttc cttgaccctg g 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物P4 IRTKS-3P211

<400> 4

aactcagacg cagaaaccag tc 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物P5

<400> 5

tagttgccag ccatctgttg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物P6

<400> 6

catcctgcac tgctcctgta 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物P7

<400> 7

ctggggttcc tgagactttg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物P8

<400> 8

catcctgcac tgctcctgta 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物P9

<400> 9

aacgctggtt agcaccgcag g 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物P10

<400> 10

tatctcgcgc ggctccgaca 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物IRTKS-F

<400> 11

ttggcaggct acgtctacct 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物IRTKS-R

<400> 12

gcgcctagga cttgagactg 20

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物Actin-F

<400> 13

aatcgtgcgt gacattaagg ag 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物Actin-R

<400> 14

actgtgttgg cgtacaggtc tt 22